Nucleotidi ed Acidi Nucleici. Marco Nardini Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie Università di Milano

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1 Nucleotidi ed Acidi Nucleici Marco Nardini Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie Università di Milano

2 Nucleotidi

3 - 8 tipi di nucleotidi comuni Struttura nucleotidi - base azotata legata ad uno zucchero unito al almeno un gruppo fosforico Basi azotate Purine: Adenina (A) Guanina (G) Pirimidine: Citosina (C) Uracile (U) Timina (T) molecole planari, aromatiche, eterocicliche, derivati dalla purina e dalla pirimidina* * (ma non sintetizzate in vivo da questi composti)

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5 Zuccheri (pentosio) 1) Ribonucleotidi ribosio Struttura nucleotidi 2) Deossiribonucleotidi 2 -deossiribosio (ribosio privato del gruppo ossidrilico in 2 ) Gruppo fosforico può legarsi al pentosio in posizione 3 e 5 3 -nucleotide, 5 -nucleotide

6 Struttura nucleotidi - in assenza del gruppo fosforico il composto si dice nucleoside Es: 5 -nucleotide nucleoside-5 -fosfato - Adenina, Guanina, Citosina in ribonucleotidi e deossiribonucleotidi - Uracile solo in ribonucleotidi - Timina solo in deossiribonucleotidi 8 tipi di nucleotidi comuni A, G, C, U A, G, C, T

7 Derivati nucleotidici ATP, FAD, NAD(P) +, CoA, acidi nucleici (RNA, DNA) ATP (Adenosina trifosfato) - trasportatore/trasmettitore di energia (in tutti gli organismi) - energia resa disponibile quando uno o due dei suoi gruppi fosforici sono trasferiti ad un altra molecola - concentrazione cellulare abbastanza modesta (~5mM), ma utilizzo giornaliero medio umano pari al peso corporeo

8 Adenosina trifosfato - adenosina = adenina + ribosio - 3 gruppi fosforici ( PO 3 2- ) - 1 legame fosfoestere - 2 legami fosfoanidridici (pirofosforili) Derivati nucleotidici importanza biologica ATP correlata con la elevata quantità di energia libera (-30.5 kj/mol) rilasciata dalla rottura dei legami fosfoanidridici trasferimento gruppo fosforico ad altro composto Idrolisi dell ATP (nel caso in cui l accettore sia H 2 O) ATP + H 2 O ADP + P i P i = PO 3 2- ATP + H 2 O AMP + PP i PP i = P 2 O 7 4- (pirofosfato) di solito nella maggior parte delle reazioni l accettore è H 2 O

9 Derivati nucleotidici - oltre a donare un gruppo fosforico, in molte reazioni metaboliche un nucleotide può donare anche altri costituenti Es: sintesi amido nelle piante - aggiunta unità glucosio donate da ADP-glucosio FAD e NAD + coenzimi nucleotidici Flavina Adenina Dinucleotide FAD Nicotinamide Adenina Dinucleotide NAD + (1) subiscono riduzione reversibile in modo da accettare elettroni e (2) passarli ad altri trasportatori ed essere rigenerati

10 Derivati nucleotidici FAD (Flavina Adenina Dinucleotide) - adenosina legata mediante 2 gruppo fosforici alla riboflavina (vitamina B2: sintetizzata da molti organismi ma non dall uomo dieta) - sistema eterociclico della riboflavina può essere ridotto reversibilmente

11 Derivati nucleotidici FAD (3 stati redox) - riduzione per trasferimento di uno o due e - - FADH (radicale stabile detto semichinone) sistema ad anelli coniugati assorbe luce a λ = 450 nm (giallo) giallo intenso -FADH 2 (forma totalmente ridotta o idrochinone) assorbe luce a λ = 570 nm (blu) giallo pallido }isoallossazina

12 Derivati nucleotidici NAD + (Nicotinamide Adenina Dinucleotide) - adenosina legata mediante 2 gruppo fosforici a un ribosio ed alla nicotinamide -NADP + (versione fosforilata del NAD + ): gruppo fosforico legato al ribosio dell adenosina in posizione 2 - sulla nicotinamide (derivato della vitamina niacina) è presente il sito di riduzione reversibile (il C4 dell anello piridinico è il centro reattivo) - N quaternario agisce come trappola di elettroni

13 Derivati nucleotidici NAD + (Nicotinamide Adenina Dinucleotide) - riduzione per trasferimento di uno ione idruro H: - (trasferimento catalizzato da deidrogenasi) -NAD + e NADP + sono trasportatori di coppie di elettroni - negli organismi aerobici l accettore terminale degli elettroni è O 2 -O 2 può accettare solo elettroni non accoppiati. Gli elettroni devono essere trasferiti ad O 2 uno alla volta gli elettroni rimossi da metaboliti a coppie (come quelli che riducono NAD + ) devono essere poi trasferiti ad altri trasportatori in grado di subire reazioni redox con 2 od 1 elettrone soltanto (es: FAD)

14 Derivati nucleotidici CoA (Coenzima A) - funzione centrale nel metabolismo ma non viene ossidato/ridotto - trasportatore di gruppi acili [CH 3 (CH 2 ) n CO ]. legame al gruppo sulfidrilico della parte mercaptoetilamminica della molecola - adenosina 3 -fosfato legata mediante 2 gruppo fosforici all acido pantotenico (vitamina B 3 ), unito alla β-mercaptoetilammina legame amidico legame tioestere ΔG 0 = kj/mol per l idrolisi del legame tioestere dell acetil-coa reazione più esoergonica dell idrolisi di ATP (-30.5 kj/mol) ponte pirofosforico

15 Acidi nucleici

16 Acidi Nucleici: DNA e RNA 1) l informazione genetica deve essere conservata in una forma di dimensioni ridotte e stabile per lunghi periodi 2) l informazione genetica deve essere decodificata, spesso parecchie volte, al fine di poter essere usata trascrizione, il processo in cui la sequenza nucleotidica nel DNA viene copiata nel RNA, al fine di poter passare al successivo processo della traduzione, e cioè la sintesi delle proteine 3) l informazione contenuta nel DNA o nel RNA deve essere resa accessibile alle proteine e ad altri acidi nucleici 4) La progenie di un organismo deve essere dotata con lo stesso blocco di istruzioni presente nel progenitore il DNA deve andare incontro ad un processo di replicazione

17 Acidi Nucleici: DNA e RNA

18 Struttura Acidi Nucleici RNA, DNA acidi nucleici = polinucleotidi (polimeri di nucleotidi) in cui un gruppo fosforico fa da ponte fra le posizioni 3 e 5 di due unità ribosio vicine - legame fosfodiestere (2 legami esteri con 2 unità ribosio) - gruppi fosforici acidi (a ph fisiologico gli acidi nucleici sono polianioni -estremità 5 residuo con posizione C5 non impegnata con altro nucleotide -estremità 3 residuo con posizione C3 libera

19 Struttura Acidi Nucleici RNA, DNA - convenzione sequenza scritta a partire dall estremità 5 a 3 - rappresentazione schematica: linea verticale ribosio linea diagonale legame fosfodiestere base rappresentazione ad una lettera tetraribonucleotide: papupcpg o paucg H tetradeossiribonucleotide d(paptpcpg) o d(patcg)

20 Struttura Acidi Nucleici RNA, DNA - le proprietà fisiche del polimero variano rispetto al monomero e dipendono dalle dimensioni (es: carica, solubilità) - il polimero (formato da monomeri non identici) rispetto al monomero contiene una informazione relativa alla sequenza RNA nessuna regola sulla composizione nucleotidica DNA n A = T e n G = C (Regole di Chargaff) natura doppia elica del DNA capito dopo in base a struttura DNA - composizione in basi del DNA molto variabile tra organismi diversi Es: G + C dal 25% -75% (ma ~costante in specie correlate: es. 39% -46% nei mammiferi)

21 Struttura DNA (Watson-Crick, 1953) basata sulle seguenti considerazioni: - regole di Chargaff nel 1953 il fatto che le basi degli acidi nucleici sono in forma chetonica non era stata ancora definita ma a W&C erano state fornite informazioni sulle forme tautomeriche predominanti - corretta forma tautomerica delle basi negli acidi nucleici (tautumeri = isomeri interconvertibili che differiscono per la posizione degli atomi di H) solo forma chetonica - natura elicoidale della struttura

22 Struttura DNA struttura ad elica (X) ripetitività di 3.4 Å (fra le basi)

23 Struttura DNA Struttura del DNA B la forma biologicamente più comune di DNA - doppia elica (catene antiparallele destrorse) - 2 scanalature: scanalatura maggiore e minore - scheletro covalente di unità ribosio e gruppi fosforici - gruppi fosforici all esterno (repulsione elettrostatica minimizzata) - basi nella parte interna dell elica - coppie di basi planari (da catene opposte) legate da legami a H (A T, G C) e ~ all asse dell elica appaiamento complementare delle basi Passo dell elica 34 Å, diametro 20 Å, d-basi 3.4 Å, nucl/giro 10

24 Struttura DNA appaiamento complementare delle basi ogni catena di DNA agisce da stampo per la sintesi della catena complementare - ciascuna coppia di basi ha circa la stessa larghezza A T e G C sono intercambiabili senza alterare lo scheletro di unità ribosio e gruppi fosforici (analogamente A T e T A, C G e G C )

25 Struttura DNA - molecole di DNA generalmente di grandi dimensioni (misurata in coppie di basi, bp, o kb) - di solito più un organismo è complesso maggiore è il suo contenuto in DNA - il genoma di un organismo è distribuito in diversi cromosomi, ognuno contenente una molecola di DNA - molti organismi sono diploidi, cioè contengono 2 serie equivalenti di cromosomi, una per ogni genitore il contenuto di DNA specifico (aploide) è quindi la metà del contenuto di DNA totale Es: 46 cromosomi per cellula umana numero aploide 23

26 Struttura DNA - DNA a doppia elica: diverse strutture a seconda della composizione del solvente e della sequenza di basi DNA A, DNA Z DNA A - condizioni di deidratazione cambio conformazionale reversibile del DNA B struttura più larga e meno profonda - elica destrorsa, passo dell elica 34 Å, diametro 26 Å, d-basi 2.9 Å, nucl/giro presenza di un buco assiale (6 Å di diametro) - piani delle basi ruotate di 20 rispetto all asse dell elica profonda scanalatura maggiore, scanalatura minore poco profonda

27 DNA B DNA A

28 Struttura DNA DNA Z - polinucleotidi complementari con che alternano purine a pirimidine ad alta concentrazione di sali assumono conformazione Z es: poli d(gc) poli d(gc), poli d(ac) poli d(gt) - elica sinistrorsa, passo dell elica 44 Å, diametro ~18 Å, d-basi 7.4 Å, nucl/giro 12 simile a punta di trapano sinistrorsa - stretta e profonda scanalatura minore, scanalatura maggiore molto poco profonda - il sale stabilizza la struttura Z riducendo la repulsione elettrostatica fra i gruppi fosfati dei filamenti opposti (nell elica Z sono più vicini rispetto all elica B: 8 Å vs 12 Å)

29 DNA B DNA Z

30 Struttura DNA DNA Z funzione biologica ed esistenza in vivo? - esistono domini proteici Zα che legano DNA Z (uno per filamento) interazione ionica e legami-h fra catene laterali polari e basiche e scheletro di unità ribosio e gruppi fosforici (non coinvolte le basi) - complementarità strutturale e di carica fra la superficie proteica e lo DNA Z - sequenze in grado di formare DNA Z presenti spesso in vicinanza dell inizio dei geni conversione reversibile fra DNA Z e DNA B può avere un ruolo nel controllo della trascrizione two ADAR1 Zα domains in complex with Z-DNA

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32 Limitata flessibilità del DNA Struttura DNA - l interconversione fra diverse strutture di DNA non avviene liberamente in vivo inusuali condizioni fisiche (deidratazione o interazione con proteine che legano il DNA) - residui individuali possono differire dalle conformazioni medie - le molecole di DNA B (spesse ~20 Å) possono adottare diversi gradi di curvatura (le variazioni più elevate dalla linearità richiedono il legame di specifiche proteine) flessibilità fondamentale per poter essere impacchettato nelle cellule - la conformazione dell unità nucleotidica dipende da 7 angoli di torsione di cui uno descrive l orientazione della base rispetto al legame glicosidico (N-C1, angolo χ) - limitati gradi di libertà rotazionali dovuti a constraints interni

33 Limitata flessibilità del DNA Struttura DNA - la rotazione attorno al legame glicosidico (angolo χ) è fortemente ostacolata residui purinici: conformazione sin e anti residui pirimidinici: conformazione anti (unica stabile) (nella forma sin lo zucchero interferisce stericamente con il sostituente sull atomo C2) - negli acidi nucleici a doppia elica le basi sono di solito in forma anti - eccezione: DNA Z residui purinici in forma sin e residui pirimidinici in forma anti ( dinucleotide unità ripetitiva elica Z)

34 Limitata flessibilità del DNA Struttura DNA per diminuire l affollamento, che si ha sempre con gli atomi di H - la flessibilità dell anello di ribosio è limitata - l anello del ribofuranosio non è piatto perchè se lo fosse i sostituenti sarebbero eclissati - 4 atomi dell anello sono coplanari, il quinto (C2 o C3 ) è fuori dal piano di diversi 0.1 Å conformazioni del ribosio C2 -endo e C3 -endo endo perchè l atomo spiazzato è sul lato dell anello del C5 (endo = dentro, eso = fuori) - il ripiegamento del ribosio governa l orientamento relativo dei gruppi fosforici sul ribosio DNA B C2 -endo DNA A C3 -endo DNA Z residui purinici C3 -endo residui pirimidinici C2 -endo

35 Limitata flessibilità del DNA Struttura DNA - lo scheletro zucchero-fosfato ha costrizioni conformazionali (angoli α e ζ) ciò è dovuto a se fossero liberi di ruotare probabilmente non ci sarebbero configurazioni stabili degli acidi nucleici - interazioni non-covalenti tra anello di ribosio e gruppi fosforici - interferenze steriche tra residui vicini (nei polinucleotidi) le catene costituite da unità zucchero-fosfato nelle doppie eliche sono rigide ed i loro angoli sono privi di tensioni

36 Forze che stabilizzano la struttura degli acidi nucleici complessità strutturale del DNA inferiore a quello delle proteine Denaturazione riscaldamento DNA duplex si separano le 2 catene complementari che assumono conformazioni casuali diminuzione drastica della viscosità della soluzione aumento del 40% dell assorbimento di luce ultravioletta (a causa della rottura delle interazioni elettroniche tra basi vicine)

37 Forze che stabilizzano la struttura degli acidi nucleici Denaturazione - brusco incremento nell assorbimento della luce (di solito a 260 nm) in un ristretto intervallo di T la denaturazione del DNA è un fenomeno cooperativo in cui il collasso di una parte della struttura destabilizza la parte rimanente - l aumento dell assorbanza è noto come effetto ipercromico - l assorbimento relativo è il rapporto tra l assorbimento della luce a 260 nm a T indicata rispetto a quello a T = 25 C

38 Forze che stabilizzano la struttura degli acidi nucleici - T m = temperatura di fusione la stabilità della doppia elica di DNA dipende dalla natura del solvente, dal tipo e concentrazione degli ioni T m aumenta linearmente con la quantità molare di coppie di basi G C (ma questo non solo perché G C contengono un legame H in più di A T) Tm temperatura a cui si raggiunge la metà dell aumento dell assorbimento totale della luce UV

39 Forze che stabilizzano la struttura degli acidi nucleici Rinaturazione raffreddamento DNA duplex - se rapidamente sotto T m parziale riappaiamento casuale delle basi - se a ~ 25 C sotto T m (condizione di riassociazione o annealing) energia termica sufficiente per rinaturazione completa - allo stesso modo le catene complementari di DNA ed RNA possono formare doppie eliche ibride (ibridizzazione) che sono solo di poco meno stabili delle doppie eliche di DNA

40 Forze che stabilizzano la struttura degli acidi nucleici Stabilizzazione: appaiamento delle basi - è la colla che tiene uniti gli acidi nucleici a doppia elica - nelle strutture del DNA sono presenti solo appaiamenti Watson-Crick tale geometria è la più stabile perché hanno una affinità maggiore rispetto a quella di altri appaiamenti - sono noti anche altri tipi di appaiamenti, particolarmente per RNA es: geometria di Hoogsteen l atomo N7 dell adenina si comporta come accettore di legame a H invece di N1 appaiamento Hoogsteen tra adenina e timina appaiamento Watson-Crick

41 Forze che stabilizzano la struttura degli acidi nucleici Stabilizzazione: impilamento delle basi - i legami a H sono alla base delle interazioni di appaiamento delle basi (specificità di appaiamento nel DNA) - i legami a H contribuiscono poco alla stabilità (in condizioni di denaturazione sono rimpiazzati da legami H con molecole di H 2 O) altri tipi di forze - organizzazione impilate delle strutture planari delle basi puriniche e pirimidiniche (interazioni di van der Waals) -le energie di impilamento variano con il contenuto delle basi: (interazioni tra le basi G e C impilate più resistenti di quelle fra le basi A e T maggior stabilità termica DNA ad alto contenuto G + C) energia di impilamento di una doppia elica è sequenza dipendente

42 Forze che stabilizzano la struttura degli acidi nucleici Stabilizzazione: impilamento delle basi

43 Forze che stabilizzano la struttura degli acidi nucleici Stabilizzazione: interazioni ioniche - la stabilità delle strutture degli acidi nucleici dipende dalle interazioni elettrostatiche dei loro gruppi fosforici carichi Esempio: la T m del DNA duplex aumenta con la concentrazione di ioni Na + (schermatura elettrostatica dei gruppi fosforici anionici) Litio e potassio (cationi monovalenti) simili effetti non specifici Cationi divalenti (Mg 2+, Mn 2+ e Co 2+ ) si legano specificamente ai gruppi fosforici più efficaci di quelli monovalenti nello schermare i gruppi fosforici - gli enzimi che mediano reazioni con acidi nucleici e nucleotidi quasi sempre richiedono Mg 2+ come cofattore - gli ioni Mg 2+ contribuiscono a stabilizzare le complesse strutture assunte da molti tipi di RNA

44 Struttura dei cromosomi eucariotici - le molecole di DNA sono in genere enormi es: genoma umano 23 cromosomi, 3.2 miliardi di bp lunghezza di profilo = lunghezza fra le estremità della molecola distesa ciascuna bp contribuisce per 3.4 Å lunghezza di profilo ~ 1 m Come può essere analizzata e decodificata una così grande quantità di informazione genetica in un tempo ragionevole mentre è conservata in una piccola frazione del volume cellulare? - il DNA duplex subisce facilmente danni quando fuori dall ambiente protettivo cellulare (a causa della sua forma allungata e per la sua rigidità) degradazione da taglio mediante agitazione, rimescolamento o pipettamento di una soluzione di DNA (sono comuni tecniche per preparare frammenti di DNA)

45 Struttura dei cromosomi eucariotici genoma dei procarioti - singola molecola di DNA circolare, impacchettata in associazione a proteina molto basiche genoma degli eucarioti - DNA condensato e impacchettato in cromosomi cromosoma - complesso di una molecola lineare di DNA e di proteine, noto come cromatina (metà della massa è costituita da proteine) - entità dinamica la cui forma si modifica durante le fasi del ciclo cellulare forma più condensata durante la metafase della divisione cellulare forma meno condensata durante trascrizione e replicazione del DNA - cromosomi umani: lunghezza di profilo variabile tra cm ma nella forma più condensata sono lunghi solo μm

46 Istoni Struttura dei cromosomi eucariotici - cromatina: metà della massa è costituita da proteine, la maggior parte delle quali sono istoni - 5 classi principali: H1, H2A, H2B, H3, H4 (23 kd, 14 kd, 13.8 kd, 15.3 kd, 11.3 kd) - alta percentuale (20-30%) di residui Arg e Lys possono legare i gruppi fosforici (carichi -) del DNA mediante interazioni elettrostatiche - alta stabilità evolutiva (sequenze fra le più conservate fra quelle note) strutture adattate a funzioni così critiche da essere intolleranti a qualsiasi variazione (solo H1 è più variabile) - modificazioni chimiche (metilazione, acetilazione, fosforilazione su specifici residui Arg, His, Lys, Ser, Thr) (i) molte sono reversibili, (ii) tendono a diminuire la carica positiva e (iii) variano considerevolmente da specie a specie alterando la capacità di interagire coldna

47 Struttura dei cromosomi eucariotici Nucleosomi - la cromatina contiene ~ un ugual numero di H2A, H2B, H3, H4 ma solo la metà di H1 - struttura a collana con particelle (nucleosomi) di ~100 Å di diametro legate da DNA apparentemente nudo - digestione con nucleasi di micrococco (idrolizzano DNA a doppia catena) rompono il DNA soltanto tra le particelle le particelle proteggono il DNA (particelle legate a ~200 bp di DNA) nel 1974 Kornberg propose che i nucleosomi fossero formati da ottameri (H2A) 2 (H2B) 2 (H3) 2 (H4) 2 associati a un segmento di DNA lungo circa 200 bp e che H1 si legasse al nucleosoma in altro modo

48 Struttura dei cromosomi eucariotici Particella centrale del nucleosoma - la nucleasi di micrococco degrada la cromatina in singoli nucleosomi contenenti anche H1 e 166 bp. Una ulteriore digestione rimuove un altro frammento di DNA (rimangono 146 bp) che determina il rilascio di H1 formazione della particella centrale del nucleosoma ottamero (H2A)2(H2B)2(H3)2(H4)2 + DNA lungo circa 146 bp - nucleosomi vicini sono uniti da DNA linker (o DNA di unione) di 55 bp in media (varia tra 8-114bp a seconda di organismi e tessuti) - struttura a simmetria binaria - DNA avvolto attorno all ottamero per 1.6 giri (superelica sinistrorsa)

49 Struttura dei cromosomi eucariotici Particella centrale del nucleosoma - gli istoni H2A, H2B, H3 e H4 hanno sequenze diverse ma struttura 3D (~70 residui) simile: lunga elica centrale affiancata su ogni lato da un ansa e da un elica più corta - eterodimeri H2A-H2B, H3-H4 che legano ciascuno 2.5 giri di DNA duplex che si curva formando un angolo di tetramero (H3-H4) 2 mediante fascio di 4 eliche dei 2 H3 - interazione di (H3-H4) 2 con ciascun H2A-H2B mediante fascio di 4 eliche (2 di H2A e 2 di H4) formazione ottamero metà superiore dell ottamero

50 Struttura dei cromosomi eucariotici superelica DNA - 75% superficie accessibile al solvente - raggio di 42 Å e passo di 24 Å, andamento non uniforme (angoli bruschi seguendo l andamento della struttura del nucleo degli istoni) - variabilità conformazionale nella sua lunghezza (da 9.4 a 10.9 basi per giro rispetto alle 10.4 del DNA in soluzione) interazioni nucleo istonico-dna - legami a H, ponti salini e dipoli delle eliche con gli atomi di O dei gruppi fosforici, interazioni idrofobiche con gli anelli delle unità deossiribosio principalmente a livello dello scheletro covalente zucchero fosfato - inserimento di catena laterale di Arg nella scanalatura minore del DNA in tutte le 14 posizioni in cui il DNA si affaccia sugli istoni - pochi contatti istoni-basi (no specificità in sequenza degli istoni)

51 Struttura dei cromosomi eucariotici Istone H1: ruolo nella condensazione della cromatina - la nucleasi di micrococco degrada la cromatina in singoli nucleosomi contenenti anche H1 e 166 bp, corrispondenti a ~2 giri completi di superelica (estremità vicine) - in presenza di H1 le fibre di cromatina hanno nucleosomi ravvicinati con il DNA che entra ed esce dal nucleosoma dalla stessa parte - in assenza di H1 le fibre di cromatina hanno nucleosomi più dispersi con il DNA che entra ed esce dal nucleosoma da parti opposte modello di Klug: ottamero istonico + H1+ 166bp in presenza di H1 in assenza di H1

52 Cromatina: livelli di organizzazione più elevati - l avvolgimento del DNA sul singolo nucleosoma riduce di 7 volte la lunghezza della molecola (166 bp da 560 Å compresse a 80 Å) - in presenza di concentrazioni saline fisiologiche la cromatina si compatta ulteriormente andamento a zig-zag, filamento di diametro ~30 nm - toroide di 18.9 nucleosomi per giro (~316 Å di passo) diametro nucleosoma

53 Cromatina: livelli di organizzazione più elevati - il filamento di cromatina di ~30 nm è stabilizzato da interazioni che coinvolgono i segmenti N-terminali (molto basici e contenenti siti di acetilazione) di H2B, H3 e H4 che attraversano la superelica di DNA ed interagiscono con nucleosomi vicini es: N-term di H4 con zona carica negativamente del dimero H2A-H2B di un nucleosoma adiacente acetilazione come controllo del livello di strutturazione della cromatina acetilazione N-term indebolimento interazioni di impaccamento

54 Cromatina: livelli di organizzazione più elevati - nel cromosoma umano in metafase (forma più condensata della cromatina), le fibre di cromatina si proiettano radialmente a partire da una impalcatura centrale formata da proteine fibrose - cromosoma umano ~ bp e ~6 μm di lunghezza 2000 loops radiali - proteine non istoniche (10% proteine cromosomiche) sono coinvolte nella organizzazione della cromatina e nella interconversione da forme più condensate (in metafase) a meno condensate.

55 Struttura RNA - catene di DNA ad elica singola sono rare (materiale genetico virale) - l RNA si trova prevalentemente sotto forma di catena singola ma non in forma estesa, bensì in una strutture compatte catene di RNA a doppia elica in materiale genetico virale - una catena di RNA (identica al DNA a meno di U al posto di T e per la presenza di 2 -OH) può formare accoppiamenti di basi con una catena complementare di RNA o DNA - l accoppiamento di basi (G C e A U) avviene spesso intramolecolarmente il singolo filamento di RNA può ripiegarsi in modo che sequenze complementari di basi formino uno stelo con loop a singolo filamento (struttura a stelo e ansa o a forcina)

56 Struttura RNA - RNA a doppia elica non può assumere una conformazione simile al DNA B per interferenze steriche che coinvolgono i gruppi 2 -OH - conformazione simile al DNA A possibile elica destrorsa, passo dell elica 30.9 Å, nucl/giro 11.9, inclinazione basi/asse elica ~ doppie eliche ibride RNA-DNA: strutture tipo DNA A o intermedie fra DNA A e DNA B - corte doppie eliche ibride durante l inizio della replicazione del DNA e durante la trascrizione del RNA sul DNA 10-bp RNA DNA hybrid helix consisting of d(ggcgcccgaa) in complex with r(uucgggcgcc)

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58 Struttura RNA - la struttura del RNA è stabilizzata dalle stesse forze che stabilizzano il DNA - la flessibilità conformazionale dell RNA è limitata in modo analogo al DNA (può essere anche più rigido a causa delle interazioni con molecole di H 2 O dei suoi gruppi 2 -OH) - tuttavia l RNA ha forme e dimensioni maggiormente variabili rispetto al DNA - la potenziale complessità strutturale del RNA si riflette nel fatto che l RNA non mantiene e trasmette solo l informazione genetica ma può legare piccole molecole e catalizzare reazioni chimiche

59 Il mondo ad RNA Evidenze: - gli acidi nucleici possono dirigere la propria sintesi - nelle cellule esistono molti enzimi proteici in grado di interagire col DNA ma pochi con l RNA - molti coenzimi coinvolti in percorsi biosintetici e di immagazzinamento di energia sono ribonucleotidi (ATP, NAD +, FAD, CoA) - molecole di RNA hanno attività enzimatiche: ribozimi (es: catalisi della formazione del legame peptidico nei ribosomi) - nei virus a RNA (a singola o doppia catena) l informazione genetica è codificata dal RNA Ipotesi: in tempi pre-cellulari, gli RNA erano i catalizzatori biologici originali mondo ad RNA

60 Il mondo ad RNA Domande: 1) perché durante l evoluzione i catalizzatori proteici hanno sostituito i ribozimi? 2) perché il DNA ha sostituito l RNA per la codifica dell informazione genetica? Risposte: 1) i 20 aa contengono una varietà di gruppi funzionali (ossidrilici, sulfidrilici, ammidici, carbossilici) non presenti nel RNA 2) il DNA è più stabile del RNA perché l RNA è più suscettibile all idrolisi catalizzata da una base (il DNA non possiede il gruppo 2 -OH)

61 Struttura RNA - la sintesi proteica non è diretta immediatamente dal DNA perché, almeno negli eucarioti, DNA e ribosomi non sono mai in contatto - RNA è l intermediario fra DNA ed il sistema di sintesi delle proteine - 3 tipi principali di RNA rrna: RNA ribosomiale (2/3 della massa ribosomiale) trna: RNA di trasferimento (piccole molecole compatte che portano gli aa ai ribosomi per la sintesi proteica) mrna: RNA messaggero (la cui sequenza nucleotidica dirige la sintesi proteica) - altre specie di piccoli RNA coinvolti nella regolazione dell espressione genica e processamento dei trascritti di RNA - tutti gli RNA sono trascritti da stampi di DNA - la trascrizione del DNA in RNA viene eseguita dalle RNA polimerasi (RNAPs)

62 Traduzione e sintesi delle proteine - un mrna non riconosce direttamente un aa, ma lega in modo assolutamente specifico molecole di trna che trasportano uno specifico aa - il trna contiene una sequenza di 3 nucleotidi detta anticodone complementare ai codoni del mrna - durante la traduzione gli aa trasportati dal trna si uniscono tra loro nell ordine con cui gli anticodoni del trna si legano ai codoni del mrna sul ribosoma

63 Struttura terziaria del trna - molecole adattatrici che trasportano aa legati da reazioni enzimatiche specifiche - molecole formate da nucleotidi (18-28 kd). La maggior parte contiene 76 nucleotidi - struttura secondaria a trifoglio con proprietà comuni 1) gruppo fosforico all estremità 5 2) stelo accettore o stelo dell amminoacido stelo di 7 bp che comprende il nucleotide 5 -terminale l aa trasportato è legato al gruppo OH 3 terminale 3) braccio D (insieme stelo + ansa) stelo di 3-4 bp che termina con un ansa di 5-7 bp spesso contenente il residuo modificato didrouridina (D) 4) braccio dell anticodone stelo di 5 bp che termina con l ansa che contiene l anticodone

64 Struttura terziaria del trna 5) braccio TψC (o braccio T) stelo di 5 bp che termina con l ansa che contiene la sequenza TΨC (Ψ pseudouridina) 6) sequenza 3 CCA con il gruppo ossidrilico 3 libero (a seconda della specie la sequenza -CCA può essere determinata geneticamente o aggiunta enzimaticamente ad un trna immaturo) - presenza nei trna di un alto numero ( 25%) di basi modificate dopo la trascrizione (80 diverse modificazioni trovate in 60 posizioni diverse del trna) (a) nessuna modificazione è essenziale per mantenere l integrità strutturale dei trna e per il legame coi ribosomi (b) le basi modificate possono partecipare al legame dell aa con lo stelo accettore e rinforzare le interazioni codone-anticodone

65 Struttura terziaria del trna Le molecole di trna hanno forma a L in cui lo stelo accettore e lo stelo T formano un braccio della lettera e lo stelo D e dell anticodone l altro braccio - i bracci sono entrambi lunghi ~60 Å - l anticodone ed il sito accettore dell aa sono alle estremità opposte della molecola (~75Å) - spessore relativamente piccolo (~20-25 Å) essenziale per la funzione biologica, poiché durante la sintesi proteica 2 trna si legano simultaneamente a codoni adiacenti sul mrna - la struttura terziaria è stabilizzata da interazioni derivanti dall esteso impilamento ed appaiamento delle basi all interno e tra gli steli elicoidali - di solito le basi coinvolte nelle interazioni trasversali sono invarianti tutti gli trna hanno struttura simile

66 Amminoacilazione del trna amminoacil-trna sintetasi (aars) legame di uno specifico aa all ossidrile 3 terminale del ribosio del trna formando un amminoacil-trna 2 reazioni: a) attivazione dell amminoacido mediante una reazione con ATP a formare un amminoacil-adenilato (amminoacil-amp) b) l ammonoacil-amp reagisce con trna per formare l amminoacil-trna Reazione completa: amminoacil-amp + trna amminoacil-trna + AMP amminoacido + ATP + trna amminoacil-trna + AMP + PP i portata a compimento dall idrolisi di PP i generato nella prima fase della reazione

67 Ribosomi - piccoli organelli sito della sintesi proteica - grandi dimensioni (~ D nei batteri e D negli eucarioti) - grande complessità (dozzine di proteine differenti e parecchie grandi molecole di RNA) funzioni vitali del ribosoma: 1) lega l mrna in modo che i suoi codoni siano letti con alta fedeltà 2) contiene siti di legame specifici per le molecole di trna (l amminoacil-trna entrante, il peptidil-trna che ha legato a sé la catena proteica nascente, il trna che ha donato il suo gruppo amminoacilico) 3) favorisce le interazioni fra fattori proteici non-ribosomiali necessari per iniziare la catena polipeptidica, per allungarla e per terminarla 4) catalizza la formazione del legame peptidico fra il peptidil-trna e l amminoacil-trna entrante 5) è in grado di traslocare l mrna ed il peptidil-trna con la catena nascente in modo da leggere in modo sequenziale i codoni

68 Struttura del Ribosoma nei procarioti - componenti ribosomiali descritti in termini della loro velocità di sedimentazione (in Svedbergs) in ultracentrifuga (che correla ~ con le loro dimensioni) - il ribosoma di E.coli intatto ha coefficiente di sedimentazione 70S e può essere dissociato in 2 subunità diverse fra loro : subunità più piccola, 30S: una molecola di rrna 16S e 21 proteine differenti subunità più grande, 50S: 2 molecole di rrna (5S e 23S) e 31 proteine diverse - convenzione: le proteine della subunità più piccola indicate con S, quelle della subunità più grande L, seguite da un numero (che ~ aumenta dalla più grande alla più piccola) - proteine di aa, tutte in copia singola tranne L12 (4 copie), con poche omologie di sequenza, ma alto numero di residui basici e pochi residui aromatici - i circa ribosomi in una cellula di E.coli rappresentano ~80% del suo RNA totale ed il 10% delle proteine

69 Struttura del Ribosoma nei procarioti numero delle proteine identifica la loro posizione in una gel elettroforesi bidimensionale a partire dall alto a sinistra per arrivare in basso a destra

70 Struttura del Ribosoma ribosoma

71 Struttura del Ribosoma nei procarioti Struttura secondaria 16S rrna (1542 nucleotidi) - formato da 4 domini con 54% delle basi appaiate - steli a doppia elica corti (<8 bp) e molti imperfetti 5S rrna (120 nucleotidi) 2/3 delle basi sono accoppiate 23S rrna (2904 nucleotidi) estesa struttura secondaria

72 Struttura del Ribosoma nei procarioti Struttura tridimensionale - prime strutture a bassa risoluzione con tecniche di microscopia elettronica e crioelettronica (cryo-em) - struttura cristallografica (2.4 Å) della subunità 50S del batterio alofilico Haloarcula marismortui (~10 6 atomi) - struttura cristallografica (~3.0 Å) della subunità 30S del batterio T. thermophilus - struttura cristallografica dell intero ribosoma 70S di T. thermophilus ed E.coli struttura caratterizzata da numerosi lobi e rigonfiamenti ed attraversata da canali e tunnel struttura prevalentemente determinata dalla componente ad RNA e non da quella proteica

73 Struttura tridimensionale Traduzione e sintesi delle proteine 1) subunità 16S e 23S formate da elementi elicali connessi da loops (spesso estensioni irregolari di eliche) Strutture stabilizzate da interazioni tra eliche: - impaccamento scanalatura minore - scanalatura minore - inserimento di gruppi fosfato nella scanalatura minore - inserimento di adenine conservate nelle scanalature minori si ricordi che le forme A dell RNA hanno delle scanalature minori molto shallow 2) 16S: 4 domini distinti i domini della subunità 30S si possono 23S: 6 domini interconnessi muovere uno rispetto all altro, mentre la subunità 50S appare rigida

74 Struttura tridimensionale Traduzione e sintesi delle proteine 3) la distribuzione delle proteine nelle 2 subunità non è uniforme - la maggior parte delle proteine sono presenti nella faccia posteriore o ai lati - le zone all interfaccia di entrambe le subunità sono povere di proteine, specialmente le regioni che legano l mrna ed i trna 4) molte proteine consistono di un dominio globulare e di una coda - se presente, il dominio globulare è localizzato sulla superficie della subunità - la coda è priva di struttura secondaria, ricca di residui basici e si inserisce tra le eliche di RNA infiltrandosi all interno della subunità

75 Struttura tridimensionale Traduzione e sintesi delle proteine 3) la distribuzione delle proteine nelle 2 subunità non è uniforme - la maggior parte delle proteine sono presenti nella faccia posteriore o ai lati - le zone all interfaccia di entrambe le subunità sono povere di proteine, specialmente le regioni che legano l mrna ed i trna 4) molte proteine consistono di un dominio globulare e di una coda - se presente, il dominio globulare è localizzato sulla superficie della subunità - la coda è priva di struttura secondaria, ricca di residui basici e si inserisce tra le eliche di RNA infiltrandosi all interno della subunità

76 Struttura tridimensionale Traduzione e sintesi delle proteine - interazioni mediante ponti salini tra catene laterali code proteiche (+) ed atomi di ossigeno dei gruppi fosfati dell RNA (-) neutralizzazione delle interazioni repulsive carica-carica fra segmenti di RNA vicini - sequenze delle code proteiche meglio conservate rispetto ai domini globulari ipotesi di un ribosoma primordiale interamente ad RNA. Le proteine eventualmente acquisite per stabilizzare la sua struttura e modulare la sua funzione

77 Struttura tridimensionale Traduzione e sintesi delle proteine - nella struttura del ribosoma completo le subunità 30S e 50S mantengono la stessa struttura che hanno quando isolate - 12 posizioni di contatto (RNA-RNA, proteina-proteina, RNA-proteina) fra le 2 subunità (molte interazioni mediate da ioni Mg 2+ ) - alcune interazioni di contatto devono essere rotte e riformate per permettere al ribosoma di funzionare il ribosoma ha 3 siti di legame distinti per il trna sito A: sito dell amminoacile che ospita l amminoacil-trna entrante sito P: sito del peptidile che ospita il peptidil-trna a cui la catena polipeptidica è attaccata sito E: sito di uscita che ospita il trna deacilato che deve uscire dal ribosoma

78 Traduzione e sintesi delle proteine Struttura tridimensionale i 3 trna si legano al ribosoma tutti nello stesso modo: - la subunità 30S lega le braccia contenenti l anticodone - la subunità 50S lega la porzione rimanente - le interazioni consistono primariamente di contatti RNA-RNA e coinvolgono i segmenti di trna universalmente conservati il ribosoma lega allo stesso modo diverse specie di trna 50S 30S P E A A P E

79 Struttura tridimensionale Traduzione e sintesi delle proteine - i 3 trna legati hanno struttura leggermente diversa col trna nel sito A simile al trna Phe ed il trna nel sito E distorto - la catena polipeptidica nascente occupa un tunnel nella subunità 50S che si estende dal sito P alla superficie (100 Å, ~ 15 Å di diametro) formato da residui prevalentemente idrofobici largo a malapena per contenere una α-elica. E poco probabile che il folding avvenga prima che la catena aa esca dal ribosoma

80 Ribosoma eucariotico Traduzione e sintesi delle proteine - struttura e funzione simile a quella dei procarioti - differenza in molti dettagli a) massa D, vs D nei procarioti) e coefficiente di sedimentazione 80S b) 2 subunità diverse: 40S (leggera, 33 polipeptidi unici e 18S rrna) 60S (pesante, 49 polipepdtidi diversi e 3 rrna, 28S, 5.8S e 5S) - rrna eucariotici 18S e 28S simili in struttura secondaria ai procariotici 16S e 23S (le sequenze nucleotidiche sono meno conservate) - rrna 5.8S presente nella subunità pesante forma un complesso per appaiamento di basi con l rrna 28S - rrna 5.8S ha sequenza omologa all estremità 5 dell rrna 23S dei procarioti derivazioni da mutazioni che hanno alterato il processo di mutazioni posttrascrizionali dell rrna 23S portando alla formazione di un 4 rrna

81 Ribosoma eucariotico Traduzione e sintesi delle proteine - differenze rispetto ai procarioti associate alle parti aggiuntive, ma anche le parti comuni possono avere strutture leggermente diverse - 16 interazioni intersubunità, 12 delle quali corrispondono alle 12 trovate negli eucarioti importante conservazione evolutiva Complessità addizionale probabilmente dovuta al fatto di - dover passare dal nucleo (dove si forma) al citoplasma (dove avviene la traduzione) - ha un meccanismo di inizio della traduzione più complesso ribosoma di lievito: crio-em, risoluzione di 15 Å - il macchinario con cui partecipa al percorso secretorio è più complicato (sezione 9:4)???

82 Traduzione e sintesi delle proteine Autocostruzione subunità ribosomiali (solo italiano) - le prime tappe nella costruzione delle subunità ribosomiali sono indipendenti dal legame di alcune proteine all rrna 16S il complesso che si genera costituisce la struttura portante a cui si associano le altre proteine - similmente per la subunità pesante - l autocostruzione in vivo dei ribosomi richiede la presenza di rrna e proteina in quantità appropriate espressione coordinata di rrna e proteine - nelle cellule eucariotiche è richiesto anche il trasporto nel nucleo delle proteine ribosomiali prodotte nel citosol - le cellule regolano la concentrazione dei ribosomi sulla base della velocità a cui devono sintetizzare le loro proteine nelle condizioni di crescita -in E.coli meccanismo di risposta stringente

83 Traduzione e sintesi delle proteine Autocostruzione subunità ribosomiali (solo italiano) -in E.coli meccanismo di regolazione mediante risposta stringente meccanismo che agisce quando uno qualsiasi dei trna carichi viene a limitare la velocità di sintesi proteica (che determina una condizione di crescita rellentata o stringente ) - un ribosoma lega un trna scarico segnala la carenza dell aa stimolando la proteina fattore stringente a catalizzare la sintesi del nucleotide (insolito) ppgpp ATP + GDP AMP + ppgpp ppgpp agisce come messaggero cellulare - riduce di volte la velocità di trascrizione dei geni per gli rrna - stimola la trascrizione dei geni coinvolti nella biosintesi degli aa - reprime la trascrizione dei geni coinvolti nella replicazione del DNA e biosintesi dei carboidrati ppgpp potrebbe agire alterando la specificità del promotore della RNA polimerasi (essendo ppgpp capace di attivare o reprimere la trascrizione genica)