3 Punto di ascolto. Cosa sono le cellule staminali
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- Fabriciano Grillo
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1 3 Punto di ascolto tra medici, ricercatori e malati neuromuscolari f m m fondazione malattie miotoniche Aggiornamento+su+ alcune+mala0e+ neuromuscolari+ Prof. Giovanni Meola IRCCS Policlinico San Donato 30 novembre 2013 Cosa sono le cellule staminali! Le cellule staminali sono cellule primitive non specializzate con due importanti caratteristiche: " sono immortali e possono riprodursi molto rapidamente, " hanno la capacità di differenziarsi, cioè trasformarsi in cellule specializzate con specifiche funzioni, come ad esempio le cellule cardiache o le cellule nervose.! Sono classificate in base alla loro capacità di differenziazione (cellule totipotenti, pluripotenti, multipotenti e unipotenti).! Il corpo umano contiene 1000 miliardi di cellule di 200 tipi diversi.! Tutti i differenti tipi di cellule del corpo umano derivano da cellule staminali.! A seconda della provenienza le cellule staminali possono essere di due tipi: embrionali o adulte.
2 Quali sono i potenziali usi delle cellule staminali?! Le cellule staminali possono generare qualsiasi tipo di tessuto e quindi capendo il meccanismo della differenziazione e del normale o anormale sviluppo, si potrebbero utilizzare quale fonte rinnovabile di cellule sane per moltissimi tipi di patologie.! Le cellule staminali possono portare a nuove scoperte nello studio delle proteine prodotte dal nostro DNA in modo da correggere difetti genetici, come per esempio, nel campo neuromuscolare, nella SLA e nella SMA.! La prima potenziale applicazione della tecnologia delle cellule staminali è nel settore della ricerca di nuovi farmaci. Trial clinici: cosa sono! trial clinico = studio farmacologico, biomedico o salutecorrelato sull uomo, che segue dei protocolli predefiniti.! scopo ultimo = verificare che una nuova terapia sia sicura, efficace e migliore di quella normalmente impiegata e correntemente somministrata. Senza i trial clinici, il progresso nella lotta contro le malattie sarebbe bloccato.! Esistono trial in cui i ricercatori intervengono direttamente, attraverso la somministrazione di farmaci o altre sostanze con successiva valutazione degli effetti e trial, invece, basati solo sull osservazione, con i ricercatori che si limitano appunto ad operare osservazioni e misurazioni.! Per un malato, partecipare a un trial clinico vuol dire assumere un ruolo attivo nei confronti della propria salute, avere accesso a nuovi trattamenti prima che essi siano resi disponibili a tutti e significa anche contribuire alla ricerca scientifica.
3 Trial clinici: cosa sono STUDI PRECLINICI STUDI CLINICI! Gli studi pre-clinici hanno lo scopo di determinare le caratteristiche farmacologiche delle nuove molecole e delle terapie genetiche, sia con ricerche sugli animali, sia con studi sperimentali su cellule, anche dei malati (i cosiddetti studi in vitro ). La loro durata è in media di due-tre anni e meno del 50% delle molecole provate in animali o in laboratorio passa, per il suo potenziale terapeutico, alla sperimentazione sull uomo.! Gli studi clinici Hanno lo scopo di dimostrare l efficacia e la tollerabilità della nuova terapia e la possibilità che il rapporto/beneficio sia favorevole e sono suddivisi in quattro fasi principali. Le fasi dei Trial clinici " La fase I dura circa 1-2 anni e viene condotta generalmente su volontari sani. Comprende lo studio della tollerabilità, della farmacocinetica, del metabolismo e della farmacodinamica. Il numero di pazienti è di solito tra 50 e 100. Se questa fase viene superata, il Ministero della Salute dà il via libera alla fase II per la sperimentazione allargata. " Fase II: dura circa 2 anni ed è il momento in cui la molecola viene somministrata per la prima volta ai pazienti per cui era stata studiata.vengono coinvolti pazienti in numero maggiore e nelle malattie rare come la distrofia, i numeri dei pazienti coinvolti nella sperimentazione sono inferiori, proporzionati alla ridotta frequenza della patologia. " Fase III: serve per verificare su larga scala i dati emersi in fase II, con una più accurata determinazione dell efficacia terapeutica e della tollerabilità. Questo è il momento più estensivo e rigoroso di tutto il processo, quello in cui la molecola viene messa a confronto verso placebo [sostanza priva di effetti farmacologici, N.d.R.] o altri farmaci di riconosciuta efficacia, per dimostrarne il vantaggio terapeutico. Le ricerche vengono condotte in ambito universitario od ospedaliero, seguendo rigidi protocolli e la selezione dei pazienti bada che essi siano sufficientemente rappresentativi della popolazione di malati, identificando il tipo di paziente più indicato per la cura ed escludendo i sottogruppi di pazienti a rischio, per non esporli ai pericoli dello studio. Se si supera questa fase, si chiede l autorizzazione all immissione in commercio del farmaco e a questo punto possono essere richieste nuove sperimentazioni, arrivando finalmente all approvazione del farmaco stesso, con precise indicazioni per una patologia definita. " La fase IV è successiva all immissione in commercio e include gli studi sperimentali e osservazionali per la farmacovigilanza, con la segnalazione di reazioni indesiderate e impreviste. Essa è perciò importante al fine di una pronta scoperta delle reazioni avverse e di un appropriata risposta a tali eventi.
4 STRATEGIE TERAPEUTICHE NELLA DM1 DM1 LOCUS (chr. 19q13.3) DMWD DMPK CTG v SIX (CUG) >37 DMPK ORF AAAAAAAA Regione prossimale Regione distale Struttura ad harpin FOCI MBNL1 U-U mismatches Attivazione PKC? P CUGBP1
5 Distrofia Miotonica è una malattia RNA mediata 3 sono le strategie terapeutiche utilizzate per eliminare i livelli di DMPK mrna tossico: 1) Utilizzo di Ribozimi 2) Utilizzo di Oligonucleotidi antisenso (AONs) 3) Utilizzo di inibitori della trascrizione 1. RIBOZIMA # Molecole catalitiche da RNA, in grado di down-regolare l espressione di un gene attraverso la degradazione del suo stesso RNA. # Presentano una struttura terziaria. # Possono essere nativi o ingegnerizzati.
6 2. AONs Gli AONs differiscono essenzialmente dal tipo di modificazione: Tuttavia due sono le specie molecolari di AONs utilizzate nella terapia genica della DM: 1) AONs di seconda generazione: (MOE, o 2-O-metil modified AON) o cet AONs agiscono degradando il target $ sono meno tossici dei fosfotioati $ hanno > affinità x l RNA complementare $ sono in grado di attivare l RNA H 2) AONs di terza generazione: agiscono non degradando il target ma provvedono all inibizione tramite ingombro sterico (blocco meccanico del ribosoma) permettendo così: $ aumento della permeabilità nucleare $ > stabilità nel nucleo $ > specificità del target rispetto ai tradizionali AONs AONs di terza generazione PNA: l ossatura di zucchero fosfati è sostituita da legami poliammidici VANTAGGI:Aumenta ta stabilità e affinità SVANTAGGI: Non attivano RNasi H, problemi di solubilità e di uptake cellulare LNA: l anello del ribosio è chiuso da un ponte metilene che collega 2 -O con 4 -C VANTAGGI:Aumenta ta stabilità termodinamica e affinità SVANTAGGI: ridotta capacità di silenziamento Non attiva RNasi H HNA (Hexytol nucleic acids): al posto del desossiribosio si trova un esitolo che è più rigido e porta a una riorganizzazione dell HNA VANTAGGI:Aumenta ta resistenza alle nucleasi termodinamica e affinità SVANTAGGI: non attiva RNasi H MFs (Morpholino oligonucletides): il rishna (Hexytol nucleic acids): al posto del ribosio si trova una molecola morfolino e i legami sono fosforodiammidici VANTAGGI:Aumentata resistenza alle nucleasi termodinamica e affinità SVANTAGGI: non attiva RNasi H, problemi di uptake cellulare
7 TIPI DI VEICOLI $ LIPOSOMI (BUBBLE- LIPOSOME) $ NANOPARTICELLE (hanno dimensioni nanometriche con carica negativa) $ MICROSFERE (hanno dimensioni comprese tra 1 e 100mm, sono a base di zuccheri biodegradabili che consentono il rilascio ritardato di acidi nucleici) $ VETTORI VIRALI MODELLI ANIMALI $ Topi DMSXL omozigoti (presentano l anticipazione, hanno più coinvolgimento cerebrale, con 1400 CTG) $ Topi HSA LR (espansione nel gene dell actina, hanno più coinvolgimento muscolare) $ Scimmie (che non presentano la malattia) $ MBNL knockdown $ CUGBP iperfosforilata Tipo di somministrazione: $ Iniezioni muscolari (muscolo tibiale) Dosi 20-50mg/kg per 2 volte a settimana per 6 settimane Topi HSA-LR Utilizzavano bubble liposomi di fluorescinato PMO intramuscolore e poi bombardavano con ultrasuoni DMPK exp mrna (60%) RT-qPCR Dei FOCI Topi DMSXL $ Iniezioni intracerebroventricolare Utilizzavano bubble liposomi di 2 generazione PS58 (CAG)7 Ippocampo Corteccia Striatum Bulbo olfattivo Talamo Splicing alternativo Cl-, IR La tossicità solitamente viene testata sui modelli cellulari DMPK exp mrna (75%) RT-qPCR
8 -Somministrazioni sottocutanee Gen 2.5 (di nuova generazione) ASO Topi HSA-LR e Topi DMSXL -Scimmia normale 40mg/kg trattamento durava 13 settimane Splicing alternativo Cl-, IR DMPK exp mrna (50-70%) RT-qPCR 3. INIBITORI DELLA TRASCRIZIONE $ Pentamidina $ Actinomicina D Legano i promotori%no RNA tossico Miotonia, Splicing alternativo $ TOSSICI $ ASPECIFICI Modelli animali DM1 Siamo nel 2013 abbiamo fatto una lunga strada! a descrizione DM1! a descrizione mutazione! a descrizione Proteins binding to CUG! a descrizione modello animale che presenta il meccanismo della malattia! 2002 responsabilità della tossicità del RNA! a descrizione dell antisense nel topo DM1! 2012 &13 1a dimostrazione che l antisense è alla base della terapia sistemica per la DM1! pianificazione dei trials per la DM1 Cooper TA. PNAS 2009
9 Preparazione trial clinico in DM1 nel 2015? (con effetti positivi su distrofia e miotonia)! I malati DM1 e DM2 vengono codificati nel Registro Nazionale DM avere informazioni sulla storia naturale della malattia! Messa a punto della biopsia ad ago sul muscolo Tibiale Anteriore (TA) (indicatore di malattia - Biomarker)! Sul muscolo TA valutare: 1. Presenza di foci 2. Riduzione di foci dopo terapia genica (biologo dedicato) 3. Studi biomolecolari sullo splicing di alcune proteine chiave (canale del cloro, del calcio, BIN1)! Fondi per * attrezzature biomolecolari, reagenti; * biologo dedicato 4. Valutazione clinica del muscolo TA nel tempo (clinico dedicato) Compromissione a livello cerebrale nella DM1 e DM2! Studi neuropsicologici! Studi di neuro immagini! Modelli animali (DMSXL)! Studi a livello cellulare (neuroni in vitro) Valutare pattern gangliosidico su modelli cellulari e cervelli di topo DMSXL Fondi per stabulario animali Reagenti Biologo dedicato
10 Trial clinico per mitigare la compromissione cerebrale nella DM1! Trial sulla miotonia e distrofia informazioni su trial per deficit cognitivi " Problema di passaggio della Barriera Ematoencefalica (BE) " Modello animale ottimale (DMSXL o MBNL2?)! Meccanismi patomolecolari non noti FASE PRE-CLINICA COSA POSSO FARE OGGI PER AIUTARE IL CMN E LA FMM?! Se non lo sono ancora, iscrivermi come socio al CMN: è possibile qui rivolgersi al Dott. Mancinelli! Acquistare qualche sacchetto di nocciole e farmi promotore della campagna nocciole per la ricerca! Acquistare il libro I fatti La distrofia miotonica la cui edizione italiana è stata curata dal prof. meola! Acquistare una borsa o uno zainetto con il logo della FMM
11 COSA POSSO FARE A CASA PER AIUTARE IL CMN E LA FMM?! Impegnarmi a vendere i sacchetti di nocciole (rivolgersi alla Sig.ra Paola Meola)! Diffondere le finalità del CMN e della FMM tra parenti, amici, conoscenti sensibilizzando sulla necessità di raccogliere fondi per la ricerca clinica e di base (anche con il 5x1000)! Organizzare qualche iniziativa per raccogliere fondi AGGIORNAMENTI SU ALTRE MALATTIE NEUROMUSCOLARI
12 Atrofie muscolospinali - SMA! Ricercatori della Iowa State University hanno identificato una struttura RNA negli esseri umani che potrebbe portare ad un nuovo trattamento per l'atrofia muscolare spinale: la scoperta di un nuovo bersaglio terapeutico che potrebbe essere modificato da farmaci, portando a nuove possibilità terapeutiche per la malattia.! PTC Therapeutics ha annunciato la selezione del farmaco candidato per il trattamento dell atrofia muscolare spinale, nel suo programma di sviluppo in collaborazione con Roche e SMA Foundation. Il raggiungimento di questo traguardo comporta il pagamento di 10 milioni di dollari per PTC da Roche. Atrofie muscolospinali - SMA TERAPIA GENICA! Nel dicembre del 2012, il team del dott. Kaspar al Nationwide Children's Hospital ha presentato il programma di sperimentazione all Istituto Nazionale di Sanità statunitense, che ha approvato un trial clinico con terapia genica AAV9-SMN sistemica per la SMA.! L inizio della sperimentazione clinica è previsto nei primi mesi del 2014 e sarà limitata ai soli pazienti SMA I, con età fino a 9 mesi.! Isis Pharmaceuticals ha annunciato che i dati di follow-up relativi allo studio di fase I con ISIS-SMNRx nei bambini SMA, mostrano che la maggior parte di quelli che hanno ricevuto i due dosaggi più elevati del farmaco (6 mg e 9 mg) ha continuato a mostrare miglioramenti nella funzione muscolare anche dopo 14 mesi da una singola iniezione del farmaco. I risultati di questo studio di fase I, compresi questi dati preliminari di follow-up, sono stati presentati al Congresso internazionale della World Muscle Society dalla dott.ssa Kathy Swoboda il 3 ottobre 2013.
13 SLA e staminali: una corretta informazione! Si sta studiando molto perché le cellule staminali diventino una terapia applicabile, ma al momento si hanno solo dati sperimentali, derivanti da studi in laboratorio e sui modelli animali e non trasferibili all uomo senza ulteriori ricerche.! Decine di centri di ricerca stanno infatti lavorando per l identificazione di una terapia per la SMA, anche in Italia! Ad oggi, sono state sviluppate una decina di potenziali terapie per questa devastante malattia (comprese alcune basate sull uso delle cellule staminali) che, a differenza dell approccio proposto da Stamina Foundation, sono supportate da robusti dati scientifici preliminari, e hanno dimostrato la loro efficacia potenziale su modelli animali della malattia. Questi dati sperimentali sono stati messi a disposizione e ampiamente discussi dalla comunità scientifica internazionale e, cosa estremamente rilevante, sono regolarmente pubblicati su riviste scientifiche specializzate.! Molte di queste potenziali terapie sono oggi in attesa di passare alla sperimentazione umana, ciò che avverrà nel momento in cui verrà dimostrato alle Istituzioni preposte alla salvaguardia della salute dei Cittadini, che i possibili benefìci per i pazienti sono superiori ai rischi potenziali, legati alla somministrazione di una terapia i cui effetti sono oggi sconosciuti.! Qualsiasi approccio terapeutico, infatti, va condotto nell ambito del più assoluto rigore scientifico e con la supervisione di clinici esperti della malattia. SLA e metodo Stamina! Un inchiesta di Nature (luglio 2013) ha rivelato che il metodo Stamina (di Davide Vannoni) laureato in lettere e filosofia e presidente della fondazione, è basato su dati errati e ricalca una ricerca pubblicata nel 2003 da un équipe dell università ucraina di Kharkov.! La rivista ripercorre la storia della richiesta del brevetto, presentata da Stamina nel 2010 negli Stati Uniti, e rileva che i dati sui quali si basava «erano stati duplicati da articoli pubblicati in precedenza e non attinenti». In sintesi l accusa è di plagio.! Vannoni avrebbe dovuto presentare il metodo al comitato di esperti nominato dal governo per valutarne l efficacia, ma non l ha fatto! Di recente il biologo Angelo Vescovi, direttore scientifico di Neurothon (fondazione presieduta dal vescovo di Terni, Vincenzo Paglia) ha annunciato che i primi test di trapianto di cellule staminali su sei pazienti affetti da Sla hanno dato esiti positivi. Nel senso che non ci sono stati effetti collaterali. Molti giornali hanno invece subito parlato di possibilità di cura della Sla.! E molto sbagliato annunciare l avvio o la fine di sperimentazioni che sono solo in fase 1! Un ricercatore dovrebbe lavorare, produrre dati, renderli visibili e poi parlare.! La visibilità dei dati scientifici è importantissima, perché permette ad altri di verificarne il valore.
14 Distrofia facio-scapolo-omerale FSD! La FSD è la 3 forma di Distrofia muscolare, con una incidenza di 1:20,000! La FSH esordisce in genere attorno ai vent anni, coinvolgendo principalmente i muscoli orbicolari del volto, il cingolo scapolare e pelvico e i muscoli distali degli arti inferiori (quelli più lontani dall asse centrale del corpo).! Esistono 2 forme FSD1 e FSD2: " Nel 95% dei pazienti con FSD1 vi è una contrazione del D4Z4 chr4q35 " Nella FSD2 non vi è alcuna contrazione del D4Z4 ma sono presenti modifiche della cromatina Terapia! Non esiste una terapia risolutiva; si può tuttavia intervenire sui sintomi, per esempio con tecniche di fisioterapia oppure somministrazione di antidolorofici. Nei casi più gravi, in cui sono interessati anche i muscoli respiratori, può essere necessaria la ventilazione meccanica. Distrofia facio-scapolo-omerale FSD Gestione della malattia! Per migliorare le limitazioni funzionali: " Stretching, training aerobico e terapia fisica " Fisiochinesiterapia: esercizio aerobico 3/sett x 30 minuti (tutte le terapie fisiche devono essere fatte sotto controllo medico) " I pazienti che svolgono attività sportive lo fanno con percentuali simili a quelli della popolazione generale: nei primi, infatti, il gruppo dei sedentari corrisponde al 40,6% contro il 41% degli italiani. Per le persone affette da FSH non è controindicata, anche ai fini dell idoneità sportiva, l attività fisica non agonistica e moderata, poiché non sembra esserci un peggioramento clinico rispetto chi svolge una vita sedentaria.! La Fisiochinesiterapia e la terapia fisica possono servire anche per mitigare il dolore (presente più volte a settimana in circa il 55% dei pazienti) e limitare la fatica (presente in questa patologia)! Consigliata la fissazione delle scapole (artrodesi)! E stato creato il registro nazionale della FSD
15 Disferlinopatie Studio Internazionale Sulle Misure di Efficacia Clinica Nella Disferlinopatia (LGMD2B/Miyoshi) Un'opportunità per i pazienti affetti da disferlinopatie di partecipare a uno studio di ricerca clinica mirato a definire misure di efficacia per gli studi clinici, attraverso una misurazione dello sviluppo e della progressione di tali patologie. Senza valide misure degli esiti clinici, non sarà possibile eseguire studi clinici efficaci. Canalopatie muscolari! Sono state riconosciute recentemente forme neonatali di canalopatie muscolari " Nuove mutazioni canale del sodio determinano una severa condizione di laringospasmo neonatale episodico (SNEL) migliora in modo decisivo con farmaci che bloccano canali del sodio! Mexiletina era stata ritirata dal commercio ma attualmente viene somministrata con protocolli regionali (file F) perché prodotta dall Istituto Militare Farmaceutico di Firenze! Diclorofenamide: è stato ritirato dal commercio. Si sta tentando di percorrere la stessa strada della Mexiletina per ottenerne ancora la dispensazione
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