EFFETTO DEL TAURODEOSSICOLATO SU COLON UMANO STIMOLATO

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1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI BARI ALDO MORO FACOLTÀ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN SCIENZE BIOSANITARIE TESI DI LAUREA IN FISIOLOGIA GENERALE EFFETTO DEL TAURODEOSSICOLATO SU COLON UMANO STIMOLATO RELATORI Prof. Lucantonio Debellis LAUREANDO Rita Daddabbo Prof. Piero Portincasa ANNO ACCADEMICO

2 4 1. INTRODUZIONE La problematica della reazione tra i sali e gli acidi biliari ed il sistema digerente è largamente presente in letteratura in quanto l impatto di queste sostanze particolari sulla funzione, ma anche sull integrità del sistema digerente, è notevole e lungi da essere compreso in tutti i suoi aspetti. I sali biliari sono composti anfipatici che si comportano come detergenti a concentrazioni superiori la concentrazione critica micellare (CMC). In queste condizioni sono utili all organismo, ma possono anche danneggiarlo in quanto si tratta di composti ad elevata tossicità. Ricerche riportate in letteratura dimostrano che l alimentazione ricca di grassi è correlabile ad una ridotta capacità di assorbimento a livello dell intestino tenue, a cui fa seguito un aumento della quantità dei sali biliari idrofobici che raggiungono colon e retto. In tali condizioni i sali biliari divengono i principali agenti eziologici di malattie severe come epatiti fulminanti, malattie croniche del fegato, pancreatiti, danni alla mucosa gastrica, all esofago e all epitelio intestinale. Rappresentano, inoltre, i promotori di gravi forme cancerose. In letteratura sono riportati numerosi esempi dei danni prodotti dai sali biliari, studiati con diverse metodiche e su diversi modelli. Nel gruppo di ricerca nel quale è stato svolto questo lavoro di tesi da molti anni sono condotti studi che concernono l azione dei sali e degli acidi biliari su vari substrati e nei diversi aspetti delle loro interazioni. Gli esperimenti eseguiti nel corso di questo lavoro di tesi, integrano le conoscenze acquisite arricchendole di importanti dati riguardanti l effetto dei sali biliari sui meccanismi di trasporto ionico del colon umano.

3 GLI ACIDI BILIARI Gli acidi biliari, i primi composti naturali ad essere isolati in forma pura, sono il prodotto terminale del metabolismo del colesterolo, hanno la caratteristica peculiare di essere amfipatici e solubili in acqua. Le alterazioni della sintesi e del trasporto di queste molecole determinano l insorgenza di patologie epatiche intestinali e delle vie biliari. In seguito alla sintesi a partire dal colesterolo negli epatociti, vengono coniugati con gli amminoacidi glicina e taurina, processo che li rende impermeabili alla membrana cellulare e che consente loro di persistere nella bile e nel contenuto intestinale anche a concentrazioni elevate. La relazione tra la struttura chimica degli acidi biliari e le loro molteplici funzioni fisiologiche è stato per molto tempo oggetto di studi scientifici. Gli acidi biliari inducono la secrezione epatica di lipidi e solubilizzano il colesterolo promuovendone la sua eliminazione. Nella porzione prossimale dell intestino gli acidi biliari agiscono come detergenti naturali poiché solubilizzano i lipidi alimentari facilitando in tal modo l assorbimento intestinale di grassi introdotti con la dieta. Gli acidi biliari sono tossici quando raggiungono concentrazioni molto più elevate rispetto ai normali valori fisiologici cosi come accade nei pazienti affetti da malassorbimento degli acidi biliari i quali manifestano deficit nella normale funzionalità della mucosa. Difetti nel metabolismo degli acidi biliari possono essere causati da un alterazione durante la fase di sintesi ex novo dal colesterolo o durante la coniugazione con gli amminoacidi, dalla presenza di meccanismi di trasporto transmembrana non funzionanti, nonché da difetti della circolazione enteroepatica e da una aumentata degradazione batterica La bile Gli acidi biliari, sotto forma di sali, sono il maggior costituente organico della bile, di cui rappresentano circa il 50% della componente solida. La bile è un liquido di colore giallo oro, dovuto alla bilirubina, e viene prodotta con un flusso di 0,4 ml/min. E composto in prevalenza da acqua, in cui sono contenute diverse sostanze: acidi biliari, colesterolo, fosfolipidi e pigmenti biliari. Tutti i componenti della bile vengono sintetizzati e secreti dagli epatociti nei canalicoli biliari situati tra epatociti adiacenti insieme ad un liquido isotonico la cui concentrazione elettrolitica è simile a quella plasmatica. I canalicoli biliari confluiscono in dotti sempre più grandi fino a convergere in un singolo grosso dotto biliare, il dotto epatico, tappezzato da cellule epiteliali che secernono una soluzione acquosa ricca di bicarbonato la quale contribuisce al volume totale di bile escreta

4 6 dal fegato. La quantità di bile secreta dal fegato giornalmente oscilla tra 800 e 1000 cc. La secrezione di bile avviene in maniera continua nell arco delle 24 ore. La maggior parte del flusso biliare, formato nell intervallo tra i pasti è dirottato verso la colecisti. Figura Localizzazione della colecisti e dei dotti. La colecisti o cistifellea è in rapporto con la faccia inferiore del fegato, nella fossa cistica del solco sagittale destro, ed è avvolta da peritoneo sulla sua faccia inferiore. E piriforme, con un fondo tondeggiante volto in avanti, e il collo ristretto che continua nel dotto cistico. E lunga 8-10 cm e ha nell uomo una capacità variabile tra 15 e 60 cm 3, in ogni caso insufficiente a contenere tutta la bile prodotta dal fegato nell intervallo tra i pasti. Pertanto il ruolo principale di quest organo è quello di concentrare la bile, assorbendo Na +, Cl - -, HCO 3 e acqua, aumentando la concentrazione degli acidi biliari da 5 a 20 volte. Il Na + viene riassorbito mediante un trasporto attivo negli spazi intercellulari laterali allo stesso modo di Cl - - e HCO 3 per preservare l elettroneutralità. Di conseguenza nella regione del estremità apicale dello spazio intercellulare, l elevata concentrazione ionica fa sì che il liquido sia ipertonico, determinando un flusso osmotico di acqua. L acqua così dal lume si dirige nello spazio

5 7 intercellulare tra cellule adiacenti. Infine acqua ed elettroliti possono attraversare la membrana basale dell epitelio allontanandosi dai capillari. La bile concentrata deve essere riversata nel duodeno. Lo stimolo per lo svuotamento della colecisti è rappresentato dall arrivo nella porzione prossimale dell intestino tenue dei grassi alimentari. Questi composti inducono il rilascio duodenale della colecistochinina, un ormone che stimola la velocità di svuotamento della cistifellea. In seguito a stimolo ormonale le pareti della colecisti, dotate di contrazioni ritmiche capaci di raggiungere pressioni di 300 mm di acqua, si contraggono e la bile attraversa lo sfintere di Oddi e si porta nel duodeno. Nell arco di una giornata vengono riversati nel tenue da 250 a 1500 ml di bile Sintesi e metabolismo degli acidi biliari Gli acidi biliari sono steroidi polari a 24 atomi di carbonio caratterizzati da un ossidrile in posizione 3 e da una catena alifatica in D17 di atomi di carbonio (acido isovalerianico). Gli steroidi costituiscono un ampia classe di composti di origine naturale, derivati dal sistema tetraciclico del ciclopentanoperidrofenantrene, comprendente tre anelli del cicloesano fusi (A, B, C) nell arrangiamento non lineare, o fenantrene, e un anello del ciclopentano terminale (D) Figura Ciclopentanoperidrofenantrene, struttura di partenza degli steroidi. La sintesi degli acidi biliari è un complesso processo multienzimatico in cui una molecola di colesterolo insolubile, non carica costituente la membrana viene convertita in una molecola che nello stato ionizzato è anfipatica e in grado di attraversare le membrane cellulari. I principali acidi biliari prodotti dal fegato a partire dal colesterolo sono l ACIDO CHENODESOSSICOLICO (CDCA) e L ACIDO COLICO. L acido chenodesossicolico può essere considerato la molecola di partenza per la sintesi di tutti gli acidi biliari: presenta 2 gruppi ossidrilici OH in configurazione α in posizione C3 e C7 del nucleo steroide. L ossidrile in posizione 3 è già presente nella molecola del colesterolo, mentre l ossidrile sul C7 viene aggiunto nella via biosintetica degli acidi biliari. In tutti i vertebrati il CDCA subisce un ulteriore reazione di idrossilazione in posizione C12 a

6 8 formare l acido colico. L acido chenodesossicolico e l acido colico sono definiti acidi biliari primari perche sono sintetizzati negli epatociti. Gli acidi biliari secondari si formano, invece, nel colon in seguito a biotrasformazione batterica degli acidi primari. L acido colico, infatti, subisce un attacco da parte della flora batterica anaerobica del colon: l enzima deidratasi batterica catalizza una reazione di deidrossilazione sull atomo di C in posizione 7. L attività enzimatica determina la formazione di un acido biliare di-idrossilato, l ACIDO DEOSSICOLICO (DCA). La deidratasi batterica agisce allo stesso modo sull acido chenodesossicolico a formare uno degli acidi biliari monoidrossilati, l ACIDO LITOCOLICO. Gli acidi biliari primari e secondari sono riassorbiti dagli enterociti e riportati al fegato dove possono subire destini differenti. L acido desossicolico insieme al corrispondente acido biliare primario viene coniugato con glicina e taurina. Il DCA costituisce circa il 20 % degli acidi biliari escreti con la bile, la restante percentuale è rappresentata dall acido colico e chenodesossicolico in proporzioni quasi uguali. L acido litocolico può essere coniugato con glicina e taurina ma anche con il solfato in posizione C3. Questi doppi coniugati SULFOLITOCOLIGLICINA e SULFOLITOCOLITAURINA vengono comunque escreti con la bile ma non sono efficacemente assorbiti dall intestino. Di conseguenza sono rapidamente eliminati dall organismo con la feci e non costituiscono più del 5 % degli acidi biliari nella bile. La loro rapida eliminazione dall organismo è essenziale giacché l acido litocolico e i suoi derivati doppi coniugati si sono mostrati molto tossici negli esperimenti sugli animali. In sintesi, quindi, il 90 % degli acidi biliari escreti è rappresentato dai coniugati dell acido colico e chenodesossicolico mentre l acido litocolico è presente soltanto in tracce. Nella bile è stata riscontrata la presenza di un altro acido biliare l ACIDO URSODESOSSICOLICO, la cui struttura risulta identica a quella del CDCA fatta eccezione per la configurazione β del gruppo ossidrilico in posizione 7. La sintesi degli acidi biliari è schematicamente rappresentata dalla figura successiva ( fig ) Gli acidi biliari coniugati sono completamente ionizzati a ph fisiologico e sono quindi completamente impermeabili alle membrane biologiche. Inoltre a causa della loro elevata dimensione non sono in grado di attraversare le giunzioni intercellulari. Queste proprietà fanno sì che la loro concentrazione intraluminale sia sempre molto elevata. La coniugazione con glicina e taurina influenza le proprietà chimico fisiche di queste molecole: gli acidi biliari

7 9 coniugati sono più solubili a ph acido rispetto ai loro derivati non coniugati e sono più resistenti alla precipitazione in presenza di una elevata concentrazione di Ca 2+. Figura Sintesi e caratteristiche dei principali acidi biliari Dal punto di vista sterico il gruppo idrossilico ed il gruppo carbossilico sono localizzati sullo stesso lato della molecola e ciò spiega la natura anfipatica degli acidi biliari. Il gruppo

8 10 idrossile ed il gruppo carbossilico dissociato sono idrofili mentre il nucleo ciclopentanofenantrenico ed i gruppi metile sono idrofobici (fig ). Figura Caratteristiche idrofiliche ed idrofobiche degli acidi biliari e schema di interazione acidi biliari lipidi - acqua In soluzione il comportamento degli acidi biliari dipende dalla loro concentrazione. A basse concentrazioni esiste scarsa interazione tra le molecole. Al di sopra di una determinata concentrazione definita Concentrazione Micellare Critica, gli acidi biliari interagiscono per formare piccoli aggregati polimolecolari definiti, appunto, micelle. Le regioni idrofobiche delle molecole interagiscono l una con l altra mentre le regioni idrofiliche prendono contatto con l acqua (fig ). Le micelle composte esclusivamente da acidi biliari non si formano nell organismo. Piuttosto, quando raggiungono concentrazioni sufficienti, le molecole coniugate solubilizzano altri lipidi come colesterolo, fosfatidilcolina, miscele di acidi grassi ed anioni di acidi grassi, monogliceridi, a formare micelle miste. La struttura di queste molecole è cilindrica, la fofatidilcolina si dispone a raggiera e gli acidi biliari si interpongono tra questi lipidi. Le micelle non sono unità statiche ma in seguito a collisioni tra micelle miste vi è un continuo scambio di molecole lipidiche tra micelle e tra queste e la fase acquosa che le circonda La circolazione entero-epatica Il ciclo di processi che comprende la secrezione dei sali biliari nella bile epatica, l espulsione nel tratto gastrointestinale, il riassorbimento epatico dal sangue sinusoidale, è definita circolazione enteroepatica. Gli acidi biliari primari vengono sintetizzati negli epatociti e successivamente secreti all interno dei canali biliari grazie alla presenza di un trasportatore stimolato dal ATP. I canalicoli biliari sono avvolti da una spirale nastriforme di filamenti di actina. L attività osmotica degli acidi biliari richiama anche acqua e soluti filtrabili nel canalicolo, queste forze osmotiche agiscono in maniera sinergica con l attività contrattile dei filamenti di actina

9 11 generando una pressione di circa 30 cm di acqua. La bile fluisce così nei canali biliari a calibro sempre maggiore fino a quando non giunge all interno del dotto biliare maggiore. Quando in questa regione si realizza una pressione maggiore rispetto a quella del dotto cistico, la bile viene riversata nella cistifellea. A seguito di un pasto, la presenza di acidi grassi all interno del duodeno stimola la produzione della colecistochinina che rilasciata dalle cellule duodenali agisce andando a stimolare la contrazione delle pareti della cistifellea. Oltre ad agire sulla colecisti, la colecistochinina agisce anche sulle fibre nervose rivenienti dal nervo vago che innervano lo sfintere di Oddi, le quali a seguito dello stimolo ormonale si rilassano. Il risultato finale è il flusso della bile all interno dell intestino tenue. La contrazione della colecisti ha inizio già 2 minuti dopo il contatto della mucosa del tenue con i grassi, lo svuotamento completo si ottiene in minuti. Durante il processo si distinguono 2 fenomeni motori: da una parte abbiamo una contrazione tonica che porta ad un restringimento del diametro della colecisti, dall altro contrazioni fasiche con una frequenza di 2-6/min. In questa occasione vengono sviluppate pressioni di mmhg. Normalmente il % dei sali biliari presenti nell intestino sono riassorbiti a livello dell ileo. Il primo passaggio di questo processo attivo è mediato dal trasportatore ileale apicale sodio-dipendente per i sali biliari (ASBT). Recentemente è stato dimostrato che l ASBT riveste un ruolo importante nel permettere l aumento delle dimensioni del pool dei sali biliari. Nel caso in cui una quantità eccessiva di sali biliari arriva nell ileo, l attività dei trasportatori ASBT diminuisce (down-regulation), mentre la situazione opposta accade quando la concentrazione di sali biliari nell ileo è bassa (up-regulation). Gli acidi biliari coniugati hanno un affinità per la molecola trasportatrice di gran lunga superiore a quella degli acidi biliari non-coniugati. Una piccola frazione dei sali biliari sfugge ai meccanismi di assorbimento ileali ed arriva nel colon, dove i sali vengono deconiugati dalla flora batterica ed assorbiti mediante una modalità di assorbimento passivo poiché risultano meno idrofili e più facilmente assorbibili per tutto lo spessore del bilayer lipidico. Gli acidi biliari riassorbiti per l intera lunghezza del intestino tornano poi al fegato mediante il sangue venoso portale, legati a proteine plasmatiche come l albumina. La captazione epatica degli acidi biliari è molto efficiente e si realizza mediante un trasportatore sodio dipendente ed un trasportatore sodio indipendente, localizzati nella membrana a contatto con il sangue sinusoidale degli epatociti. La concentrazione di acidi biliari nei canalicoli e nei piccoli dotti biliari è moderatamente elevata e si attesta intorno a mm/ lt. In seguito al processo di concentrazione della bile

10 12 che si realizza nella colecisti la concentrazione di acidi biliari si innalza notevolmente raggiungendo valori di circa 300 mm/ lt. Il rilascio di bile nel duodeno è lento e la diluizione ad opera delle secrezioni gastrointestinali riduce la concentrazione a circa 100 mm/ lt., ma tale valore risulta comunque abbastanza elevato tanto da rendere possibile la formazione delle micelle. Nell intestino cieco si assiste, invece, ad una reale riduzione dei livelli di acidi biliari (meno di 1 mm/ lt ) a causa delle reazioni di deconiugazione e deidrossilazione batterica che ne consentono un assorbimento passivo. La concentrazione di acidi biliari nel circolo portale è sempre notevolmente bassa (20-50 µm/ lt ) e si riduce raggiungendo valori pari a 1 μm/ lt a seguito della prima fase di captazione epatica nella quale il % degli acidi biliari viene ricaptato negli epatociti. Figura Circolazione entero-epatica dei sali biliari Gli acidi biliari che non entrano nella circolazione enteroepatica rimangono nel lume intestinale e vengono eliminati con le feci. L eliminazione per via fecale risulta sempre bilanciata dalla biosintesi a partire dal colesterolo. Poiché la concentrazione di acidi biliari nel sangue venoso portale è bassa e a causa del fatto che queste molecole vengono veicolate dall albumina, solo una piccola percentuale entra nel filtrato glomerulare. A livello tubulare renale è presente un carrier la cui attività è affine a quella del trasportatore duodenale, consentendo in tal modo un efficace riassorbimento. Eliminare acidi biliari per via fecale permette di abbassare i livelli di colesterolo.