PARETE. Citoplasma. Membrana Citoplasmatica

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1 PARETE Citoplasma Membrana Citoplasmatica Dr. Semih Esin TPAL 2005

2 PARETE BATTERICA Involucro posto all esterno della membrana citoplasmatica in quasi tutti i batteri (eccezione i micoplasmi). Spessore variabile, costituenti peculiari, alcuni dei quali presenti solo nei batteri. FUNZIONI PRINCIPALI: - Protezione dai danni di tipo osmotico (più importante) H H 2 O 2 O H 2 O H 2 O H H 2 O 2 O H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O - Mantiene la forma del batterio - Protegge dalle offese meccaniche - Funzione immunitaria COMPOSIZIONE CHIMICA: Componente principale: PEPTIDOGLICANO O MUREINA, responsabile delle caratteristiche di rigidità della parete. H 2 O Il batterio non scoppia!!! lunghe catene lineari disaccaridiche poste concentricamente alla cellula batterica Struttura semplificata del peptidoglicano corti peptidi che sono attaccati alle catene di zuccheri e le legano trasversalmente

3 ORGANIZZAZIONE DELLA PARETE DEI GRAM+ E GRAM - Esistono importanti differenze sia di struttura che di composizione chimica tra Gram+ e Gram- che sono responsabili delle diverse proprietà tintoriali dei due gruppi di batteri. GRAM + Spesso peptidoglicano; anche 40 strati concentrici, 40-80% del peso secco Altri componenti oltre al peptidoglicano: acidi teicoici, acidi teicuronici, proteine, carboidrati intercalati nel peptidoglicano GRAM - Sottile peptidoglicano; pochi strati concentrici (2-3) 5% del peso secco pochi legami crociati Altri componenti oltre al peptidoglicano: organizzati a formare una struttura complessa all'esterno della mureina: la membrana esterna PERCHE I BATTERI GRAM+ E GRAM- SI COLORANO DIVERSAMENTE? I GRAM+: trattengono il cristal violetto per la presenza di uno spesso peptidoglicano; I GRAM-: rilasciano il cristal violetto per la presenza di un sottile peptidoglicano e di una membrana esterna di natura lipidica solubile in alcool.

4 STRUTTURA DEL PEPTIDOGLICANO Componente glucidica: Catena lineare di n unità di un disaccaride: N-acetil-D-glucosammina (NAG) Acido N-acetil-muramico (NAM) Il NAM ha la stessa struttura del NAG ad eccezione di un acido lattico legato mediante ponte a ossigeno al C3. Componente peptidica: Corta catena di amino acidi (TETRAPEPTIDE) alternati negli stereoisomeri D ed L; Il gruppo carbossilico del gruppo lattilico del NAM si lega al gruppo aminico del primo aminoacido del tetrapeptide mediante un legame carboaminico. La sequenza di aminoacidi nei tetrapeptidi può variare da una specie batterica all altra, ma contiene sempre in terza posizione un aminoacido BIBASICO che è in genere la LISINA (nei Gram +) o l ACIDO-DIAMINOPIMELICO (nei Gram-)

5 I tetrapeptidi legati al NAM si legano tra di loro con due modalità principali: lunghe catene lineari disaccaridiche poste concentricamente alla cellula batterica Struttura semplificata del peptidoglicano corti peptidi che sono attaccati alle catene di zuccheri e le legano trasversalmente

6 STRUTTURA DEGLI AMINOACIDI

7 I tetrapeptidi legati al NAM si legano tra di loro con due modalità principali: 1) DIRETTAMENTE (nei Gram negativi es: E. coli) Tramite un legame peptidico tra il gruppo aminico dell aminoacido bibasico di un tetrapeptide ed il gruppo carbossilico dell aminoacido terminale di un altro tetrapeptide (D-Ala) L-Ala D-Glu DAP D-Ala legame peptidico -NH3 -COOH D-Ala DAP : NAG : NAM D-Glu L-Ala

8 2) INDIRETTAMENTE (nei Gram positivi es: S. aureus) Tramite un ponte di PENTAGLICINA - il gruppo aminico dell aminoacido bibasico di un tetrapeptide forma un legame peptidico con il gruppo carbossilico della pentaglicina. - il gruppo aminico della pentaglicina forma un legame peptidico con il gruppo carbossilico dell ultimo aminoacido del tetrapeptide (D-Ala) L-Ala D-Glu legame peptidico : NAG : NAM L-Lys -NH3 COOH- Gly D-Ala Gly Gly Gly legame peptidico Gly -NH3 COOH- D-Ala L-Lys D-Glu L-Ala

9 NUMERO DI LEGAMI CROCIATI Oltre che nella struttura anche il numero dei legami crociati differisce nei Gram+ rispetto ai Gram-: Nei Gram+: praticamente tutti i residui di NAM sono legati ad un tetrapeptide; Nei Gram-: i legami sono più scarsi e le maglie più larghe CARATTERISTICHE DI RESISTENZA DEL PEPTIDOGLICANO (resistenza alla trazione simile al cemento armato!!!) unica grossa molecola nelle tre direzioni dello spazio; legami beta-1-4 particolarmente forti (anche nella chitina della parete cellulare vegetale); alternanza di aminoacidi D ed L risulta in una resistenza maggiore; sembra infine probabile che come avviene nelle proteine tra i vari gruppi peptidici si stabiliscano numerosi legami ad idrogeno.

10 STRUTTURA COMPLESSIVA DELLA PARETE CELLULARE DEI BATTERI GRAM + ALTRI COMPONENTI DELLA PARETE DEI BATTERI GRAM+ oltre al peptidoglicano ACIDI TEICOICI polisaccaridi acidi intercalati nel peptidoglicano di molti batteri Gram+; fino al 10-15% del peso secco di parete; sono polimeri contenenti anche fino a 30 molecole di GLICEROLO o RIBITOLO FOSFATI; i monomeri sono legati da legami di fosfato; agli ossidrili del ribitolo o glicerolo possono essere legati zuccheri (glucosio, galattosio) o aminoacidi (Dalanina) che rappresentano determinanti antigenici (determinano il sierotipo); uniti covalentemente con il gruppo 6- ossidrile del NAM del peptidoglicano. ACIDI LIPO- TEICOICI Acidi teicoici costituiti di solito da catene di glicerolfosfato, contenenti un acido grasso con il quale sono strettamente ancorati ai lipidi di membrana. Attraversano la parete e si estendono nell ambiente esterno.

11 FUNZIONI DEGLI ACIDI TEICOICI E LIPOTEICOICI FACILITANO L ASSUNZIONE DI CATIONI: La presenza di così tanti gruppi fosfato ripetuti rende le molecole fortemente acide e cariche negativamente; legano cationi (K + ; Ca ++ ; Mg ++ ) e facilitano la loro assunzione) FUNZIONE STRUTTURALE: contribuiscono alla forza ed elasticità della parete FORTEMENTE IMMUNOGENICI INTERVENGONO NEI MECCANISMI DI PATOGENICITA : Es: LTA degli Streptococchi media l adesività alle superfici mucose CARBOIDRATI: es: carboidrato C degli Streptococchi (divisione in gruppi) PROTEINE: es: PROTEINA M degli Streptococchi (divisione in tipi; ruolo nella virulenza); es: PROTEINA A degli Stafilococchi; (ruolo nella virulenza)

12 PARETE DEI GRAM+ E GRAM - Esistono importanti differenze sia di struttura che di composizione chimica tra Gram+ e Gram-

13 STRUTTURA COMPLESSIVA DELLA PARETE CELLULARE DEI BATTERI GRAM - Complessa ultrastruttura e composizione; Componenti non mureinici organizzati a formare una MEMBRANA ESTERNA O PARIETALE: Struttura: in due foglietti tipica di tutte le membrane biologiche; Composizione: FOSFOLIPIDI: simili a quelli della membrana citoplasmatica, situati nel foglietto interno. LIPOPOLISACCARIDE: costituisce con la sua componente lipidica la maggior parte del foglietto esterno. PROTEINE: inserite a varie altezze. LIPOPROTEINA: ancora la membrana esterna allo strato sottostante di peptidiglicano.

14 STRUTTURA DEL LIPOPOLISACCARIDE (LPS) Unità di ripetizione Outer core Inner core CATENA LATERALE O CORE LIPIDE A Polisaccaride Lipide Lipopolisaccaride POSIZIONE DEL LPS NELLA MEMBRANA ESTERNA Occupa la maggior parte del foglietto esterno della membrana esterna; la porzione polisaccaridica è rivolta verso l esterno, il lipide A è immerso nello spessore della membrana

15 CATENA LATERALE O Polimero di unità oligosaccaridiche di ripetizione (in media 40 unità); Trisaccaride lineare o tetra, penta saccaride ramificato; Almeno 20 diversi tipi di zuccheri molti dei quali sono dei dideossiesosi che si ritrovano, in natura, solo nella parete dei batteri Gram-; Legionella pneumophila, serogruppo 1: omopolimero formato da circa 75 residui di un solo zucchero; Rappresenta la parte più variabile alla base della classificazione sierologica dei batteri Gram- CORE E' un oligosaccaride costante nell'ambito di un genere; L' inner core di tutti i batteri Gramcontiene uno zucchero a 8 atomi di C (2- keto-3-deoxyoctulosio) più, in tutte le Enterobacteriaceae, è presente uno zucchero a 7 atomi di C. L'outer core è la porzione relativamente più variabile anche se vi sono presenti zuccheri a 6 atomi di C comuni. LIPIDE A E' un glicofosfolipide; Consiste in un dimero di NAG-fosforilata con legati acidi grassi a catena lunga; Rappresenta la porzione idrofobica che si ancora alla membrana esterna; Rappresenta il principio tossico dell'intera molecola; Altamente conservato in tutti batteri Gram-

16 FUNZIONI DELLA MEMBRANA ESTERNA E DELL' LPS barriera di permeabilità selettiva (ancor più selettiva della membrana interna) che si oppone al passaggio di molecole idrofobiche (dovuto alla catena laterale O, idrofilica, del LPS) e di molecole idrofiliche (dovuto al doppio strato fosfolipidico) al di sopra di certe dimensioni. LPS rappresenta una importante struttura di superficie nell'interazione dell'agente patogeno con il suo ospite: per es. può essere coinvolto nell'adesione (colonizzazione) e nella resistenza alla fagocitosi; è sede dei determinanti antigenici; se liberato in un ospite sensibile, dà luogo a numerosi effetti tossici (ENDOTOSSINA BATTERICA)

17 TOSSINE BATTERICHE: molecole con attività tossica nei confronti dell ospite; la produzione di tossine è uno dei meccanismi principali con cui i batteri causano le malattie (es: tetano, difterite, pertosse, colera) ENDOTOSSINE componenti strutturali; quasi sempre rilasciate in seguito a lisi ESOTOSSINE rilasciate nel mezzo esterno da cellule vitali Proprietà Endotossine Esotossine Natura chimica Localizzazione in rapporto alla cellula batterica Sensibilità alla denaturazione termica Modalità di azione e sintomatologia Complessa: lipopolisaccaride (MW: c.a. 10 kda) Componenti della membrana esterna dei batteri Gram- Termostabili Non specifica; febbre, infiammazione Proteine (MW: c.a kDa) Secrete Termolabili Attività enzimatica Nessuna Di solito Tossicità Immunogenicità Relativamente poco potenti: LD 50 nel topo: µg/animale Relativamente poco immunogeniche: la risposta immunitaria non è sufficiente a neutralizzare la tossina Specifica; citotossine, enterotossine, neurotossine con azione specifica su cellule e tessuti Altamente tossiche, spesso fatali: LD 50 tossina botulinica nel topo: 25pg Altamente immunogeniche: stimolano la produzione di anticorpi neutralizzanti (antitossine) Potenzialità del tossoide Nessuna Il trattamento della tossina con formaldeide elimina la tossicità, ma non l'immunogenicità (tossoide) Attività piretica Spesso inducono febbre nell'ospite Non inducono febbre nell'ospite

18 EFFETTI BIOLOGICI DELL'ENDOTOSSINA Le endotossine, inoculate in un animale a loro sensibile, danno luogo ad una vasta gamma di sintomi in conseguenza del loro effetto su diversi organi e sistemi. Qualsiasi apparato o cellula dell'organismo sembra rispondere sia in vitro che in vivo allo stimolo endotossico. Piccole dosi di endotossina Bersagli Monocitimacrofagi Neutrofili Linfociti B Complemento Attività Sintesi di IL-1 e TNF Rilascio amine vasoattive Attivazione Attivazione Effetti Febbre Vasodilatazione Produzione di anticorpi Infiammazione Alte dosi di endotossina Coagulazione intravasale Shock Alterazione della funzionalità di molti organi L'ENDOTOSSINA DI SOLITO UN IMMUNOSTIMOLANTE TALVOLTA UNA "TOSSINA"

19 EFFETTI BIOLOGICI DELL'ENDOTOSSINA SEMPLIFICATI 1) Effetto pirogeno (capacità di indurre febbre anche a basse dosi) Macrofago IL-1 TNF-alfa Centro termoregolatore dell'ipotalamo 2) Attiva vari tipi cellulari -Macrofagi (aumento della fagocitosi e capacità battericida, produzione di monochine che agiscono su vari altri tipi cellulari e tessuti) -Linfociti B (proliferazione e differenziazione in plasmacellule) -Cellule endoteliali -Piastrine -Granulociti 3) Induce infiammazione 4) Induce vasodilatiazione con conseguente ipotensione e shock 5) Attiva il complemento 6) Stimola la coagulazione del sangue CID (coagulazione intravasale disseminata) CID A livello cutaneo visibili delle "petecchie" I coaguli a livello del microcircolo degli organi causano ischemia con conseguente insufficienza d organo Consumo dei fattori della coagulazione e conseguente emorragie

20 VISIONE D'INSIEME DEI MOLTEPLICI EFFETTI DELL'ENDOTOSSINA RUOLO DELL'ENDOTOSSINA NELLO SHOCK ENDOTOSSICO Shock endotossico: grave quadro clinico che può accompagnare le setticemie da batteri Gram- caratterizzato da febbre, ipotensione, acidosi, insufficienza renale e respiratoria e nelle fasi finali da CID ed insufficienza d organo. Frequenza: 1% dei pazienti ospedalizzati sviluppa sepsi; 20-30% nei reparti di terapia intensiva. Esito fatale: 40-60% dei pazienti, nonostante terapie antibiotiche.

21 METODI DI DOSAGGIO DELL'ENDOTOSSINA I LPS batterici per la loro diffusione ubiquitaria e per l'estrema stabilità ad agenti chimici e fisici rappresentano una frequente contaminazione ambientale. NECESSITÀ DI VERIFICARE LA PRESENZA DI ENDOTOSSINA IN PREPARAZIONI TERAPEUTICHE, PRODOTTI BIOLOGICI, REAGENTI - TEST PIROGENO NEL CONIGLIO - TEST DEL LIMULUS Sfrutta la capacità del lisato di amebociti (unici elementi cellulari) presenti nell'emolinfa di un crostaceo, il Limulus polyphemus, di gelificare anche in presenza di piccolissime quantità di endotossina (ng). Può essere utilizzato per rivelare la presenza di LPS nel liquor, nel plasma, nelle urine od in altri liquidi biologici, per una diagnosi rapida, anche se aspecifica di infezione da Gram-.

22 LE PROTEINE DELLA MEMBRANA ESTERNA DEI BATTERI GRAM - (50% della massa della membrana) LIPOPROTEINA: piccola proteina con funzione di ANCORAGGIO (strutturale); parte proteica, legata al peptidoglicano; parte lipidica, inserita nel foglietto interno della m. esterna. PROTEINA A: attraversa tutto il bilayer lipidico; funzione di STABILIZZAZIONE STRUTTURALE PORINE: le più abbondanti c.a /cellula P.M. variabile (30-50 Kda); SONO ORAGANIZZATE A FORMARE DEI TRIMERI; SI OPPONGONO AL PASSAGGIO DELLE MOLECOLE IDROFOBICHE; SONO PERMEABILI ALLE MOLECOLE IDROFILICHE; Due TIPI: - ASPECIFICHE: selezionano solo in base alle dimensioni della molecola (piccole molecole idrofiliche < 600 Da) o, al massimo, per la carica - anioni o cationi- - SPECIFICHE: permettono il passaggio di 1 solo soluto o di pochi soluti strutturalmente simili (molecole idrofiliche più grosse: zuccheri, vitamine ecc.es: LamB di E. coli, specifica per le maltodestrine)

23 FUNZIONI DELLE PORINE CANALI CHE PERMETTONO IL PASSAGGIO DI SOSTANZE IDROFILICHE ATTRAVERSO LA MEMBRANA ESTERNA RUOLO NELLA RESISTENZA AI FARMACI sostituzione di aminoacidi neutri con aminoacidi carichi che si proiettano all interno del poro e perturbano la normale diffusione degli antibiotici in presenza di antibiotici viene diminuita od eliminata l espressione delle porine implicate nella diffusione di quell antibiotico FUNZIONE DI RECETTORI per fagi per batteriocine per componenti del complemento per anticorpi FATTORI DI PATOGENICITA BATTERICA possono promuovere l invasione delle cellule dell ospite. l aderenza l attività citotossica. (vengono secrete in piccole vescicole che si fondono con la membrana delle cellule eucariotiche) Esempi di porine di E. coli: OmpF, OmpC: diffusione di ioni ed altre piccole molecole PhoE: indotta da phosphate starvation LamB: indotta da maltosio ed altre maltodestrine nel mezzo FhuA: uptake del Ferro

24 Regolazione della sintesi delle porine OmpF e OmpC di E. coli E. coli in terreno liquido>>>bassa OSMOLARITA EnvZ è una proteina osmosensore della membrana citoplasmatica. Quando la osmolarità è bassa, EnvZ usa ATP per fosforilarsi. La molecola EnvZ-P, a sua volta, fosforila una proteina regolatrice citoplasmatica chiamata OmpR. OmpR-P si lega ad un sito regolatore a monte del gene ompf, consentendone la trascrizione. Quando l osmolarità aumente, il livello di fosforilazione di EnvZ e OmpR aumenta, consentendo a OmpR-P di legarsi a siti a più bassa affinità sul cromosoma a monte sia di ompf che di ompc. Questi siti bloccano la trascrizione di ompf, mentre aumentano la trascrizione di ompc. Inoltre, il legame di OmpR-P vicino a ompc causa la trascrizione di micf nella direzione opposta. Questo segmento di mrna si lega all mrna di ompf e blocca la sua trascrizione SINTESI PREFERENZIALE DI OmpF (grandi pori) E. coli nel tratto gastro-enterico>>>alta OSMOLARITA SINTESI PREFERENZIALE DI OmpC (piccoli pori)

25 Parete Citoplasma Membrana Citoplasmatica La Capsula

26 LA CAPSULA BATTERICA Strato mucoso superficiale presente in alcuni batteri Spessore variabile Evidenziabile con Inchiostro di china (colorazione negativa) Reazioni immunologiche (reazione di rigonfiamento capsulare) Composizione chimica della capsula di alcuni batteri Organismo Natura della capsula Monomeri Bacillus antracis Polipeptide Acido D-glutammico Leuconostoc mesenteroides Omopolisaccaride Glucosio Destrano Streptococcus pneumoniae Eteropolisaccaridi Tipo II Ramnosio, glucosio, acido glicuronico Tipo III Glucosio, acido glicuronico Tipo IV Galattosio, glucosio, ramnosio Tipo XIV Galattosio, glucosio, N-acetilglucosamina Tipo XVIII Ramnosio, glucosio Streptococcus spp. Eteropolisaccaride N-acetilglucosamina, acido glicuronico Klebsiella aerogenes (Tipo 54) Eteropolisaccaride Glucosio, galattosio, fucosio, acido glicuronico, acetato, piruvato Criptococcus neoformans Eteropolisaccaride Xilosio, mannosio, galattosio, acido glicuronico La sintesi della capsula è regolata da fattori GENETICI Nel genoma esistono dei geni che determinano e regolano la sintesi della capsula; Può essere persa per mutazione S-R; Un ceppo acapsulato può diventare capsulato dopo assunzione di DNA da un ceppo capsulato (esperimento di Griffith; TRASFORMAZIONE BATTERICA) Funzioni Può essere utilizzata come materiale di riserva in condizioni estreme Protegge il batterio dalla disidratazione È UN IMPORTANTE FATTORE DI VIRULENZA FENOTIPICI Fattori ambientali possono influenzare la sintesi di capsula Composizione del terreno Fase di crescita

27 LA CAPSULA È UN IMPORTANTE FATTORE DI VIRULENZA BATTERICA IN ASSENZA DI ANTICORPI BATTERIO CAPSULATO NO FAGOCITOSI CELLULA AD ATTIVITÀ FAGOCITARIA Macrofago Monocita Polimorfonucleato IN PRESENZA DI ANTICORPI OPSONIZZAZIONE SI FAGOCITOSI

28 LA CAPSULA COME FATTORE DI VIRULENZA BATTERICA 2 PROPRIETÀ ANTIFAGOCITARIE 2 PROPRIETÀ ADESIVE 2 PERMETTE ALLE CELLULE BATTERICHE DI DARE ORIGINE A MICROCOLONIE I microrganismi capsulati sono dotati di maggiore virulenza rispetto a quelli acapsulati. Risultano infatti maggiormente invasivi grazie alla loro capacità di eludere i meccanismi di difesa aspecifici dell'ospite primo tra tutti la FAGOCITOSI PRIMA TAPPA NELLA FAGOCITOSI riconoscimento della cellula batterica da parte del fagocita per interazioni fisico-chimiche (idrofobia, presenza di cariche elettriche) mediato da recettori (es. per il frammento Fc, per il C3b) IN ASSENZA DI Ac LA CAPSULA INTERFERISCE CON ENTRAMBI I PROCESSI: 2 rappresenta una superficie idrofilica che si oppone all'interazione con il fagocita 2 impedisce con meccanismi specifici ed aspecifici la fissazione dei fattori opsonizzanti FAGOCITOSI DI SUPERFICIE: fagocitosi di batteri anche in assenza di Ac o C che si verifica su una superficie rugosa come carta da filtro o un coagulo di fibrina e permette l'adesione del fagocita al batterio anche se questo è provvisto di capsula. Tale tipo di fagocitosi avviene ad es. nell'alveolo polmonare. IN PRESENZA DI anticorpi (Ac): si ha opsonizzazione mediata dal frammento Fc si ha opsonizzazione per attivazione della via classica del complemento