VALERIA BERTON RELAZIONE DELLE ATTIVITA DI RICERCA 1.1.2014 31.12.2014 SIGNIFICATO FUNZIONALE E POTENZIALE TERAPEUTICO DI CELLULE STAMINALI DA MENINGI NELLE LESIONI TRAUMATICHE DEL MIDOLLO SPINALE (SCI) Introduzione Le cellule neurali staminali/progenitrici rappresentano un potenziale terapeutico per diverse patologie del sistema nervoso. Il nostro gruppo ha recentemente dimostrato che queste cellule possono essere isolate anche dalle leptomeningi (aracnoide e pia madre) del midollo spinale adulto; queste cellule sono denominate LeSCs (Leptomeningeal Stem/progenitor Cells). Inoltre, abbiamo evidenziato come le cellule delle meningi reagiscono ad un danno contusivo del midollo spinale in ratti adulti proliferando e migrando all interno del parenchima lesionato. La facile accessibilità delle meningi ed il coinvolgimento delle cellule delle meningi stesse alla reazione del parenchima al danno midollare, ci hanno spinti ad investigare la potenziale applicazione terapeutica delle LeSCs nel trapianto in un modello di danno contusivo al midollo spinale. Abbiamo quindi sviluppato un metodo per isolare le LeSCs da piccole biopsie di meningi di midollo spinale di ratto adulto e differenziarle in seguito in oligodendrociti con alta efficienza; le cellule così ottenute vengono denominate OPCs (Oligodendrocyte Precursor Cells). Gli OPCs derivati dalle LeSCs sono stati trapiantati nel midollodi ratto, 6 giorni dopo un danno contusivo tramite iniezione intraparenchimale. Brevemente, gli animali sono stati anestetizzati e sottoposti a laminectomia a livello T8; un impatto pari a 150kdyne è stato applicato tramite Infinite Horizon Impactor. Sei giorni dopo il danno, gli animali sono stati nuovamente anestetizzati e il midollo spinale esposto. Sono state quindi effettuate 3 iniezioni di 2 ul di medium contenente 200.000 oligodendrociti derivati dalle LeSCs (gruppo di trapianto, n=10) o medium privo di cellule (gruppo di controllo, n=9). Le iniezioni sono state effettuate ad 1mm di profondità nel parenchima e a 3 livelli: il sito di lesione e 1mm rostrale e caudale. Obiettivo Verificare se il trapianto di oligodendrociti derivati dalle LeSCs sia associato ad un migliore recupero delle funzionalità locomotorie dopo danno contusivo al midollo spinale. Risultati Analisi Funzionale Per verificare se i due gruppi di studio (controllo vs. trapianto) presentassero diverse capacità locomotorie, abbiamo effettuato 2 test funzionali: 1- BBB Score (Basso-Beattie-Bresnahan score) Gli animali vengono osservati per 5 minuti mentre si muovono liberamente in un area recintata di 1 m di diametro. Due sperimentatori osservano il movimento generale dell animale e annotato il punteggio per i diversi parametri della scala BBB. Questa scala va da 0 (nessun movimento) a 21 (movimento normale).
In seguito vengono annotati i punteggi per le sottocategorie del BBB score, che definiscono categorie di movimento fine. Un punteggio più alto nelle diverse scale implica un maggiore recupero della funzionalità locomotoria dell animale. Nella nostra analisi abbiamo potuto valutare: il BBB score totale, il BBB scubscore, la posizione delle zampe (paw position), la clearance delle dita (toe clearance), la coordinazione e la regolarità del passo. Come si può osservare dai grafici riassuntivi in Figura 1, gli animali trapiantati (linea rossa) presentano valori di BBB score non dissimili dai valori degli animali di controllo (linea blu). Estendendo l analisi al BBB subscore e ad altri sottoparametri si può invece notare come gli animali trapiantati presentino un più rapido recupero funzionale nel caso del BBB subscore e della clearance delle dita; si può infatti notare che i punteggi raggiunti dal gruppo di trapianto tra i 14 e i 49 giorni dopo il danno per il BBB subscore e i 7 e i 28 giorni dopo il danno per la clearance delle dita, sono significativamente più alti di quelli ottenuti dal gruppo di controllo. Ancora più evidente è la differenza tra i due gruppi per quanto riguarda invece la posizione delle zampe: i punteggi del gruppo di trapianto sono significativamente più elevati di quelli del gruppo di controllo a partire dai 21 giorni dopo il danno e fino all ultimo time-point di osservazione (56 giorni dopo il danno). Questi dati suggeriscono che il trapianto di oligodendrociti derivati dalle LeSCs sia associato ad un più rapido, e nel caso della posizione delle zampe anche ad un maggiore, recupero delle capacità motorie fini. Figura 1: Risultati del test BBB score, BBB subscore e sottoparametri. Lungo l asse y sono rappresentati i punteggi, mentre lungo l asse x sono indicati i time-point di analisi. La linea rossa rappresenta i risultati ottenuti dal gruppo di trapianto, la linea blu rappresenta i risultati del gruppo di controllo. Toe clearance = clearance delle dita. Paw position = posizione delle zampe. Two-way ANOVA, Bonferroni post-hoc test: # p<0,05; ## p<0,01 Student s t-test: * p<0,05; ** p<0,01 2- CatWalk Gait analisi Questo tipo di test consente di effettuare un analisi computerizzata di alcuni parametri della capacità motoria più fine degli animali, andando quindi ad integrare i dati ottenuti dal BBB score. Brevemente, l animale viene lasciato libero di percorrere una passerella in vetro la cui
superficie viene illuminata con una luce tangente e risulta perciò buia; nel momento in cui l animale appoggia la zampa (precedentemente inumidita), la luce viene riflessa dall impronta, che quindi si illumina. I segnali luminosi vengono registrati da una videocamera connessa all apposito software, che consente poi di analizzare diversi parametri del movimento, tra i quali la velocità, la coordinazione destra-sinistra e anterioreposteriore, l angolo di appoggio delle zampe, la base di appoggio delle zampe, etc. Data la grande quantità di dati ottenibili da questo tipo di test, nella nostra analisi ci siamo concentrati sui parametri più significativi per il recupero locomotorio, quali: regolarità, alternanza del passo, base di supporto delle zampe posteriori (base of support of hindpaws), posizione delle impronte, angolo delle zampe posteriori (angle of hind paws), lunghezza del passo delle zampe anteriori e lunghezza del passo delle zampe posteriori. L analisi è stata effettuata prima del danno (in modo da escludere gli animali che avessero presentato difetti nella capacità motoria), e 28 e 56 giorni dopo il trapianto di OPCs o veicolo. Entrambi i gruppi (trapianto e controllo) presentano differenze significative in entrambi i time-point dopo il danno rispetto ai valori registrati prima del danno, ad indicare un incompleto recupero della funzionalità motoria. Per la maggior parte dei parametri analizzati, non si sono evidenziate differenze statisticamente significative tra i due gruppi a 28 o a 56 giorni dal trapianto (dati non presentati). Come illustrato nei grafici in Figura 2, abbiamo registrato una differenza significativa tra il gruppo di trapianto e il gruppo di controllo a 56 giorni dal trapianto di OPCs per quanto riguarda l angolo di appoggio delle zampe posteriori e la base di supporto delle zampe posteriori. Figura 2: Risultati della CatWalk Gait analisi. Lungo l asse y sono rappresentati i punteggi, mentre lungo l asse x sono indicati i time-point di analisi. La barra nera rappresenta i risultati ottenuti prima del danno al midollo, la barra rossa rappresenta i risultati ottenuti dal gruppo di trapianto, la barra blu rappresenta i risultati del gruppo di controllo. Angle of hind paws = angolo di appoggio delle zampe posteriori. Base of support of hind paws = base di supporto delle zampe posteriori One-way ANOVA, Bonferroni post-hoc test: # p<0,05; ## p<0,01 Student s t-test: * p<0,05; ** p<0,01 Distribuzione delle cellule trapiantate Gli OPCs derivati dalle LeSCs sono stati trasdotti con un lentivirus codificante la Green- Fluorescent Protein (GFP) prima del trapianto, in modo da consentirne l identificazione all interno del parenchima. Ho quindi potuto studiare la presenza e la distribuzione delle cellule trapiantate a 1, 15 e 63 giorni dopo il trapianto (dpt). Dall analisi effettuata è risultato che 1 giorno dopo il trapianto, gli OPCs iniettati erano concentrati nel sito di iniezione, mentre già 15 giorni dopo il trapianto era osservabile una migrazione delle cellule all interno del parenchima lesionato.
A 63 giorni dal trapianto questa migrazione era ancora più evidente e gli OPCs sono stati localizzati nella parte ventrale del midollo spinale e a livello delle meningi. La Figura 3 riporta delle immagini rappresentative per i tre time-point analizzati. 1 dpt 15 dpt 63 dpt Figura 3: Immagini rappresentative della distribuzione delle OPCs derivate dalle LeSCs a diversi time-point dal trapianto. Le immagini sono state acquisite al microscopio confocale dopo immunofluorescenza con anticorpo anti-gfp coniugato con Alexa488. I nuclei sono stati marcati con TO-PRO3. Lo studio della localizzazione delle cellule trapiantate non si è limitato all area del danno, ma è stato esteso fino ad 1 cm rostralmente e caudalmente al sito di danno e iniezione. Sezioni di midollo di 2 cm di lunghezza sono state tagliate al criostato sequenzialmente in modo da poter effettuare lo studio di localizzazione in 5 aree adiacenti, ciascuna di 4 mm di lunghezza. A partire dalla zona di midollo più vicina al cranio e finendo con la zona più prossima alla coda, ho diviso i campioni di midollo nelle seguenti sezioni: rostrale distale, rostrale prossimale, lesione, caudale prossimale e caudale distale (Figura 4). Analizzando vetrini appartenenti a ciascuna delle 5 zone di midollo in
ognuno dei 6 campioni disponibili per questo time-point di analisi corrispondente a 63 giorni dopo il trapianto, è stato possibile ricostruire graficamente l entità e la direzione della migrazione delle OPCs dopo il trapianto. La Figura 4 riporta i risultati di questa analisi; per facilitarne l interpretazione, le dimensioni dei cerchi verdi sono proporzionali al numero di OPCs osservati in quell area di midollo spinale. Si noti come la maggior parte degli OPCs derivati dalle LeSCs siano stati osservati nella regione caudale distale, ad 1 cm dal sito di danno e iniezione; un numero inferiore di cellule è stato osservato nella regione rostrale prossimale (0,5 cm dal sito di iniezione), mentre rare cellule sono state osservate nelle zone caudale prossimale e rostrale distale. Infine, nessun OPCs era localizzato nel sito di iniezione 63 giorni dopo il trapianto. Figura 4: Rappresentazione grafica della localizzazione degli OPCs derivati dalle LeSCs 63 giorni dopo il trapianto. Le dimensioni dei cerchi verdi sono proporzionali al numero di OPCs osservati. Discussione I risultati evidenziati dall analisi della funzionalità locomotoria suggeriscono che il trapianto di OPCs derivati dalle LeSCs favorisca un più rapido, e per alcuni parametri analizzati un migliore, recupero della capacità motoria negli animali trapiantati rispetto al gruppo di controllo. Ho quindi eseguito uno studio della localizzazione degli OPCs nei campioni di tessuto prelevati, con l obiettivo di chiarire il destino delle cellule trapiantate. I dati ottenuti suggeriscono che gli OPCs non permangano a lungo nel sito di iniezione o nelle zone di midollo adiacenti; le cellule osservate infatti sono principalmente localizzate ad 1 cm di distanza caudalmente e a 0,5 cm rostralmente al sito di iniezione. Questo dato, assieme alla relativa scarsità di OPCs osservate, suggerisce un miglioramento del recupero motorio dovuto più ad un effetto bystander (immunomodulatorio o trofico) delle cellule trapiantate, piuttosto che ad una sostituzione da parte delle OPCs delle cellule endogene danneggiate dalla lesione. Obiettivi Futuri Con l obiettivo di chiarire il meccanismo d azione degli OPCs derivati dalle LeSCs nel recupero funzionale degli animali dopo il danno al midollo spinale, analizzerò i campioni di tessuto ottenuti dal gruppo di trapianto e dal gruppo di controllo per verificare eventuali differenze: 1-nel grado di mielinizzazione/demielinizzazione dei tessuti, tramite colorazione istochimica con Luxol Fast Blue; 2-nell intensità della risposta infiammatoria, tramite immunoistochimica per il marcatore della microglia Iba1; 3-nell entità della formazione della cicatrice, con immunoistochimica per il marcatore astrocitario GFAP e 4-nella quantità di cellule apoptotiche, con immunoistochimica per caspasi-3.
Partecipazione a congressi internazionali: Regenerative potential of leptomeningeal-derived oligodendrocytes in rat model of spinal cord injury. Berton V, Rodríguez FJ, González-Sánchez PH, Braga A, Pino A, Krampera M, Bifari F, Decimo I, Fumagalli G. 9th FENS Forum of Neuroscience. Milano (Italia) 5-9 Luglio 2014. Differentiation of mature oligodendrocytes from small biopsy of adult rat spinal cord meninges. Braga A, Rodríguez FJ, Berton V, González-Sánchez PH, Malpeli G, Pino A, Krampera M, Decimo I, Bifari F, Fumagalli F. 9 th FENS- Federation of European Neuroscience Societies. Milano (Italia) 5-9 Luglio 2014. Regenerative potential of leptomeninges-derived oligodendrocytes in a rat model of spinal cord injury. Braga A, Berton V, Rodriguez FJ, Gonzales-Sanchez PH, Malpeli G, Pino A, Krampera M, Decimo I, Bifari F, Fumagalli G. 2nd International Spinal Cord Injury and Neurotrauma Summer School. Toledo (Spagna) 23-27 Giugno 2014. Verona, 19.11.2014 Firma