SCELTA DEI TEST EZIOLOGICI A SUPPORTO DELLA DIAGNOSI DI LEISHMANIOSI CANINA Saverio Paltrinieri, DVM, PhD, Dipl ECVCP DIAGNOSI EZIOLOGICA DIRETTA (evidenziazione del parassita o di sue componenti) Citologia Istologia (immunoistochimica) Isolamento Xenodiagnosi PCR INDIRETTA (evidenziazione degli anticorpi) ELISA Agglutinazione al latice Immunocromatografia Immunofluorescenza Western Blotting Bari, 12 Novembre 2017 1
CARATTERISTICHE DEI TESTS PATOLOGICI NON PATOLOGICI (ALTRE PATOLOGIE) totale Test + veri positivi (VP) falsi positivi (FP) VP + FP Test - falsi negativi (FN) veri negativi (VN) VN + FN totale VP + FN FP + VN TOTALE SPECIFICITA' = VN/(VN+FP) SENSIBILITA' = VP/(VP+FN) ACCURATEZZA = (VP+VN)/TOTALE VALORE PREDITTIVO POSITIVO = VP/(VP+FP) VALORE PREDITTIVO NEGATIVO = VN/(VN+FN) CARATTERISTICHE DEI TESTS SENS = 90% SPEC = 80% PREV 30% PREV 1% Test + PATOLOGICI veri positivi (VP) NON PATOLOGICI (ALTRE PATOLOGIE) falsi positivi (FP) totale VP + FP Test - falsi negativi (FN) veri negativi (VN) VN + FN totale VP + FN FP + VN TOTALE SPECIFICITA' = VN/(VN+FP) SENSIBILITA' = VP/(VP+FN) ACCURATEZZA = (VP+VN)/TOTALE VALORE PREDITTIVO POSITIVO = VP/(VP+FP) VALORE PREDITTIVO NEGATIVO = VN/(VN+FN) Test + Test - totale PATOLOGICI 270 30 NON PATOLOGICI (ALTRE PATOLOGIE) 140 560 totale 410 590 300 700 1000 totale 10 990 Test + Test - PATOLOGICI 9 1 NON PATOLOGICI (ALTRE PATOLOGIE) 198 792 totale 207 793 1000 PPV = 270/410 = 0.66 (66%) NPV = 560/590 = 0.95 (95%) PPV = 9/207 = 0.043 (4.3%) NPV = 792/793 = 0.999 (99.9%) Bari, 12 Novembre 2017 2
CARATTERISTICHE DEI TESTS RAPPORTO DI VEROSIMIGLIANZA (sens/1-spec) O LIKELIHOOD RATIO (LR+): Quanto è verosimile che il soggetto con un determinato valore abbia una determinata patologia USANDO UN TEST CON LR+ PARI A X, IN CASO DI RISULTATO POSITIVO LA PROBABILITA CHE IL PAZIENTE ABBIA LA MALATTIA IN ESAME E X VOLTE PIU ALTA RISPETTO ALLA PROBABILITA CHE IL PAZIENTE NON ABBIA LA MALATTIA IN ESAME UTILE PER CALCOLARE LA PROBABILITA DI MALATTIA POST- TEST (in caso di risultato positivo) SULLA BASE DELLA PROBABILITA PRE-TEST CARATTERISTICHE DEI TESTS Sens 94% Spec 80% LR + 4.7 5% 50% 90% 90% 98% 50% 80% 5% 18% Bari, 12 Novembre 2017 3
CARATTERISTICHE DEI TESTS Sens 80% Spec 20% LR + 1,0 50% 50% DIAGNOSI EZIOLOGICA DIRETTA (evidenziazione del parassita o di sue componenti) Citologia Istologia (immunoistochimica) Isolamento Xenodiagnosi PCR INDIRETTA (evidenziazione degli anticorpi) ELISA Agglutinazione al latice Immunocromatografia Immunofluorescenza Western Blotting Bari, 12 Novembre 2017 4
SIEROLOGIA - metodi Principio di base SIEROLOGIA - metodi Immunofluorescenza ELISA Patogeno intero su vetrino (promastigote) Reazione rilevata da un anticorpo fluorescente Singoli antigeni su piastra Reazione rilevata da un anticorpo legato a un enzima Bari, 12 Novembre 2017 5
SIEROLOGIA - metodi Immunofluorescenza ELISA Più sensibile (meno falsi negativi)? Meno sensibile (più falsi negativi)? Superabile con antigeni «multipli» SIEROLOGIA - metodi Immunofluorescenza ELISA positivo negativo Lettura al microscopio: Più soggettiva Molte variabili operatore-dipendenti Lettura automatizzata: Più oggettiva Meno variabili operatore-dipendenti POSITIVO = 2-4 volte la soglia del laboratorio Bari, 12 Novembre 2017 6
SIEROLOGIA - metodi Immunocromatografia (test rapidi) Aggiunta campione e migrazione Risultato POSITIVO Risultato NEGATIVO SIEROLOGIA limiti analitici ELISA Immunofluorescenza - Possibili falsi positivi - Cross reattività con altri flagellati (rara-assente in Italia) - Errori tecnici - «rumore di fondo dei kit (ELISA) - Possibili falsi negativi (+ frequenti) - Titolo anticorpale non rilevabile (fase iniziale 6-7 mesi/anni) per: - Bassa quantità di anticorpi - Poca sensibilità analitica del test - Lesioni localizzate (uomo) - Errori tecnici Bari, 12 Novembre 2017 7
SIEROLOGIA limiti analitici Immunocromatografia (test rapidi) - Possibili problemi legati a fluidità del campione - Titolo? - Però è rapido. test di screening? Screening di popolazioni con BASSA prevalenza/probabilità: PPV basso Screening di popolazioni con ALTA prevalenza/probabilità: PPV alta CONTROLLARE I POSITIVI CON ALTRI METODI Preferibili test sensibili a test specifici VEROSIMILMENTE I POSITIVI SONO VERI POSITIVI Preferibili test specifici a test sensibili SIEROLOGIA limiti analitici Immunocromatografia (test rapidi) - Vantaggio: antigeni particolari? Anticorpi anti-kinesine (proteine prodotte da leishmanie in replicazione) Secrete rapidamente dopo infezione Non presenti in animali vaccinati con antigeni «secreti/escreti» Bari, 12 Novembre 2017 8
SIEROLOGIA limiti analitici Immunocromatografia (test rapidi) - Vantaggio: antigeni particolari? Spec: 100% / Sens 98% Spec: 100% / Sens 63% SIEROLOGIA limiti «biologici» Primo contatto con l'antigene 200 180 Quantità di anticorpi 160 140 120 100 80 60 40 IgM IgG 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Settimane Successivi contatti con l'antigene 200 180 Il test indica solo che sono stati prodotti anticorpi Quantità di anticorpi 160 140 120 100 80 60 40 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Settimane IgM IgG Bari, 12 Novembre 2017 9
SIEROLOGIA limiti «biologici» Andamento di positività midollare e titoli anticorpali nel tempo positività PCR midollare Titolo anticorpale 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Mesi La produzione di anticorpi richiede del tempo (2-22 mesi, mediana = 5 mesi) L entità del titolo può indicare infezione «attiva» DIAGNOSI EZIOLOGICA DIRETTA (evidenziazione del parassita o di sue componenti) Citologia Istologia (immunoistochimica) Isolamento Xenodiagnosi PCR INDIRETTA (evidenziazione degli anticorpi) ELISA Agglutinazione al latice Immunocromatografia Immunofluorescenza Western Blotting Bari, 12 Novembre 2017 10
XENODIAGNOSI - COLTURA Gold standard Laborioso e non utilizzabile nella pratica Foto: Dr. Luigi Gradoni Foto: Dr. Luigi Gradoni XENODIAGNOSI - COLTURA Gold standard Laborioso e non utilizzabile nella pratica Foto: Dr. Luigi Gradoni Foto: Dr. Luigi Gradoni Bari, 12 Novembre 2017 11
CITOLOGIA Rapida da eseguire CITOLOGIA Specificità del 100%, soprattutto in presenza di reperti indicativi di infezione «attiva» Bari, 12 Novembre 2017 12
CITOLOGIA Sensibilità? MIDOLLO >50% MIDOLLO + LINFONODO >80% LINFONODO>30% MILZA >30% SANGUE n.d. (bassa) CUTE (lesioni) >50% ISTOLOGIA Specificità 100% Sensibilità n.d. ma presumibilmente elevata Foto: Dr. Chiara Giudice Bari, 12 Novembre 2017 13
IMMUNOISTOCHIMICA Specificità 100% Sensibilità n.d. ma presumibilmente elevata Limiti: tempo di processazione Foto: Prof. Eugenio Scanziani, MAPLab di Fondazione Filarete Dr. Raffaella Bergottini Helab - Milano PCR - METODI PCR tradizionale E E E E E E E Bari, 12 Novembre 2017 14
PCR - METODI PCR «nested» E E E E PCR - METODI Bari, 12 Novembre 2017 15
PCR - METODI PCR quantitativa E E E Informazione sul numero di copie di DNA presenti nel campione PCR - RESA DIAGNOSTICA PCR tradizionale - nested 1 LINFONODO Alta Sens e Spec Facile esecuzione MIDOLLO OSSEO Alta Sens e Spec Prelievo più complesso 2 SANGUE (BUFFY COAT) Spec, poco Sens SANGUE INTERO Poco Spec poco Sens 3 MILZA Sensibilità dell 86% in sintomatici CONGIUNTIVA Sensibilità 92% Specificità 100% Positivo a 45 gg. p.i. CUTE? Bari, 12 Novembre 2017 16
PCR - RESA DIAGNOSTICA PCR quantitativa PCR - RESA DIAGNOSTICA PCR quantitativa Bari, 12 Novembre 2017 17
Sierologia e PCR - INTERPRETAZIONE Sierologia e PCR - INTERPRETAZIONE Andamento di positività midollare e titoli anticorpali nel tempo La «colonizzazione» dei tessuti avviene in tempi variabili? positività PCR midollare 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Mesi Il 50% dei cani infetti nel giro di qualche mese risulta negativo a PCR su midollo Bari, 12 Novembre 2017 18
APPROCCIO DIAGNOSTICO 1 DATI ANAMNESTICI (esposizione al flebotomo) 2 REPERTI CLINICI COMPATIBILI (sistemici, cutanei, oculari, ecc..) 3 RILIEVO REPERTI DI LABORATORIO COMPATIBILI (anemia, inversione rapporto A/G, gammopatia, ins. renale o sindrome nefrosica, ecc ) APPROCCIO DIAGNOSTICO 4 CONFERMA DIAGNOSTICA Citologia? Istologia? Immunoistochimica? PCR? Sierologia? Bari, 12 Novembre 2017 19
APPROCCIO DIAGNOSTICO 4 CONFERMA DIAGNOSTICA CI SONO lesioni campionabili? (linfoadenomegalia, splenomegalia, lesioni cutanee nodulari) Approccio d elezione: citologia Foto: Dr. Fabrizio Ibba APPROCCIO DIAGNOSTICO 4 CONFERMA DIAGNOSTICA CI SONO lesioni campionabili? (linfoadenomegalia, splenomegalia, lesioni cutanee nodulari) Citologia POSITIVA MALATO Bari, 12 Novembre 2017 20
APPROCCIO DIAGNOSTICO 4 CONFERMA DIAGNOSTICA CI SONO lesioni campionabili? (linfoadenomegalia, splenomegalia, lesioni cutanee nodulari) Citologia NEGATIVA ma compatibile Istologia e/o immunoistochimica POSITIVA MALATO APPROCCIO DIAGNOSTICO Citologia NEGATIVA ma compatibile 4 CONFERMA DIAGNOSTICA CI SONO lesioni campionabili? (linfoadenomegalia, splenomegalia, lesioni cutanee nodulari) PCR o sierologia (vedi oltre) Bari, 12 Novembre 2017 21
APPROCCIO DIAGNOSTICO 4 CONFERMA DIAGNOSTICA NON CI SONO lesioni campionabili? (solo sintomi sistemici, lesioni cutanee non nodulari, ecc..) Citologia midollo POSITIVA MALATO APPROCCIO DIAGNOSTICO 4 CONFERMA DIAGNOSTICA NON CI SONO lesioni campionabili? (solo sintomi sistemici, lesioni cutanee non nodulari, ecc..) Citologia midollo NEGATIVA ma compatibile Vedi sopra (citologia lesioni) Bari, 12 Novembre 2017 22
APPROCCIO DIAGNOSTICO 4 CONFERMA DIAGNOSTICA CITOLOGIA (ISTOLOGIA) NEGATIVA? SIEROLOGIA QUANTITATIVA APPROCCIO DIAGNOSTICO 4 CONFERMA DIAGNOSTICA CITOLOGIA (ISTOLOGIA) NEGATIVA? SIEROLOGIA QUANTITATIVA Bari, 12 Novembre 2017 23
APPROCCIO DIAGNOSTICO 4 CONFERMA DIAGNOSTICA CITOLOGIA (ISTOLOGIA) NEGATIVA? SIEROLOGIA QUANTITATIVA Andamento di positività midollare e titoli anticorpali nel tempo MALATO INFETTO/ESPOSTO positività PCR midollare Titolo anticorpale 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Mesi APPROCCIO DIAGNOSTICO 4 CONFERMA DIAGNOSTICA CITOLOGIA (ISTOLOGIA) NEGATIVA? SIEROLOGIA QUANTITATIVA TITOLO ALTO (>4 volte il valore soglia del laboratorio) TITOLO BASSO (<4 volte il valore soglia del laboratorio) MALATO INFETTO/ESPOSTO Bari, 12 Novembre 2017 24
APPROCCIO DIAGNOSTICO 4 CONFERMA DIAGNOSTICA CITOLOGIA (ISTOLOGIA) NEGATIVA E TITOLO BASSO? PCR SU LESIONE O MIDOLLO Andamento di positività midollare e titoli anticorpali nel tempo INFETTO/ESPOSTO positività PCR midollare Titolo anticorpale 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Mesi APPROCCIO DIAGNOSTICO 4 CONFERMA DIAGNOSTICA CITOLOGIA (ISTOLOGIA) NEGATIVA E TITOLO BASSO? PCR SU LESIONE O MIDOLLO NEGATIVO POSITIVO ESPOSTO INFETTO Considerare altre diagnosi e monitorare sierologia MALATO se vengono escluse altre diagnosi Bari, 12 Novembre 2017 25
CANI VACCINATI? CANI VACCINATI? (%) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 T0 1 : 320 1 : 160 1 : 80 T21 T42 T100 1 : 40 Negative Figure 3:IFATpositivity(%),Group3. 1 anno Bari, 12 Novembre 2017 26
CANI VACCINATI? 100 90 80 70 60 (%) 50 40 30 20 10 0 T0 T21 T42 T250 T405 1 : 320 1 : 80 1 : 40 Negative Figure 2:IFATpositivity(%),Group2. 1 anno e seconda annualità CANI VACCINATI? 100 90 80 70 60 (%) 50 40 30 20 10 0 T0 T250 T405 T770 1 : 80 1 : 40 Negative Figure 1:IFATpositivity(%),Group1. 1 anno, 2 anno e terza annualità Bari, 12 Novembre 2017 27
CANI VACCINATI? (Vannucci et al, 2017) CANI VACCINATI? (Vannucci et al, 2017) Bari, 12 Novembre 2017 28
RIASSUMENDO 1 DATI ANAMNESTICI (esposizione al flebotomo) 2 REPERTI CLINICI COMPATIBILI (sistemici, cutanei, oculari, ecc..) 3 RILIEVO REPERTI DI LABORATORIO COMPATIBILI (anemia, inversione rapporto A/G, gammopatia, ins. renale o sindrome nefrosica, ecc ) 4 conferma diagnostica mediante: Citologia/istologiaPOSITIVA (lesioni o midollo) titolo anticorpale ALTO (se citologia/istologia NEGATIVA) PCR POSITIVA se titolo anticorpale BASSO (dopo avere escluso altre diagnosi) LEISHMANIOSI Citologia DELLE LESIONI (incluso il midollo se mancano lesioni evidenti) INDIPENDENTEMENTE dal titolo Negativo Positivo TITOLO ALTO TITOLO BASSO Lesioni cutanee No lesioni cutanee Istologia / immunoisto / PCR Su lesioni cutanee PCR Su midollo / linfonodo MALATO Positivo Negativo Positivo Negativo INFETTO ESPOSTO INFETTO ESPOSTO Bari, 12 Novembre 2017 29