LE ATTIVITÀ BIOCHIMICHE ENZIMATICHE Una delle operazioni più frequenti nei Laboratori di Microbiologia è l identificazione delle colture batteriche pure isolate da vari campioni attraverso prove biochimiche di tipo enzimatico, cioè dei saggi che permettono di stabilire il profilo enzimatico di un microrganismo, che perciò può essere identificato e differenziato da specie strettamente affini. Ognuna di queste prove enzimatiche, pur utilizzando diversi substrati enzimatici, segue lo stesso schema generale, ovvero: si utilizza un terreno di coltura differenziale, liquido o solidificabile, contenente, oltre agli altri nutrienti di base, un determinato substrato enzimatico che viene degradato solo da alcuni microrganismi e non da altri, perciò permette la differenziazione delle diverse specie batteriche; si esegue un trapianto della coltura di lavoro in esame in questo terreno differenziale in modo che le nuove colonie si sviluppino in presenza del substrato enzimatico che si vuole saggiare; durante la crescita le cellule batteriche che possiedono l enzima specifico per degradare quel determinato substrato enzimatico contenuto nel terreno di coltura produrranno un determinato prodotto final,e che potrà essere riconosciuto sfruttando una sua reazione chimica caratteristica; in assenza dell enzima il substrato enzimatico contenuto nel terreno di coltura rimarrà invariato, perciò la reazione chimica di riconoscimento risulterà negativa. Nella seguente tabella sono riassunte le prove enzimatiche che verranno prese in esame nella presente dispensa (ne esistono, in realtà, molte altre): Test Substrato enzimatico Enzima Prodotto/i finale 11.1 Idrolisi Amid Amilasi Monosaccaridi dell amido o 11.2. Idrolisi della caseina Caseina Caseinasi Amminoacidi 11.3. Idrolisi dell urea Urea Ureasi Ammoniaca 11.4. 11.5. 11.6. Degradazione del triptofano (Produzione di Degradazione indolo) dell acqua ossigenata (Ricerca della Ossidazione catalasi) del citocromo c (Ricerca dell ossidasi) Triptofano Triptofanasi Indolo Acqua ossigenata Catalasi Acqua, ossigeno Citocromo c (Fe 2+ ) Citocromo c ossidasi Citocromo c (Fe 3+ )
IDROLISI DELL AMIDO La prova ha lo scopo di verificare se le cellule del microrganismo in esame possiedono l enzima amilasi, grazie al quale sono in grado di idrolizzare, per via biochimica, il substrato amido contenuto nel terreno di coltura. L amido è un polisaccaride costituito da subunità di glucosio legate fra loro per lo più con legami 1,4--glicosidici. Per idrolisi parziale dell amido si ottiene il maltosio, mentre per idrolisi completa si ottiene soltanto D-glucosio. In acqua calda, in seguito ad ebollizione prolungata, circa il 20% di amido risulta solubile; questa parte di amido solubile viene chiamata amilosio, mentre la restante parte insolubile in acqua calda è detta amilopectina. L amilosio è costituito da catene (contenenti da 200 a 300 residui di glucosio uniti con legami 14 senza alcuna ramificazione) che formano un elica con 6-8 residui per giro di elica. Addizionando iodio ad una soluzione di amilosio si ottiene una colorazione blu, dovuta alla presenza delle strutture ad elica: gli atomi di iodio si intercalano all interno dell elica ed assumono in quest ambiente privo di acqua un colore blu intenso caratteristico. terreno di coltura: AGAR AMIDO (AA) sterile liquefatto 1 piastra Petri in plastica sterile 1 ansa di metallo, bunsen Soluzione di Lugol (soluzione acquosa di I 2 + I - ) La prova consiste nell inoculare la superficie del terreno Agar Amido contenente come substrato differenziale amido sottoforma di amilosio (parte dell amido solubile in acqua dopo prolungata ebollizione durante la preparazione del terreno) e amilopectina (insolubile in acqua).con la coltura batterica in esame e di incubare alla temperatura ottimale di crescita per 2-3 giorni. Dopo il periodo di incubazione, si verifica la presenza o l assenza di un alone di idrolisi incolore intorno allo striscio batterico ricoprendo tutta la superficie del terreno con una soluzione di Iodio (soluzione di Lugol: soluzione acquosa di I 2 + I - ). Siglare la piastra con nome gruppo e AA. Allestire con tecnica sterile la piastra con Agar Amido (AA) sterile liquefatto a 45-50 C e lasciare solidificare. Con tecnica sterile, prelevare un ansata della coltura di lavoro del microrganismo in esame ed eseguire un unico striscio verticale al centro della piastra, ripetendo più volte l inoculo. Lasciare a riposo la piastra chiusa per almeno 15 minuti, quindi rovesciarla e incubare per 2-3 giorni alla temperatura ottimale di crescita. Lettura dei risultati Ricoprire tutta la superficie del terreno con uno strato sottile ed uniforme di soluzione di Lugol e lasciare a riposo qualche minuto, quindi osservare la colorazione assunta dal terreno. Enzima amilasi Idrolisi dell amido Intorno allo striscio batterico è presente un alone di idrolisi incolore (amido assente), mentre la restante superficie del terreno si è colorata in bluviola (amido presente) Tutta la superficie del terreno si è colorata in bluviola (amido assente) Amilasi presente L amido è stato idrolizzato dalla specie batterica in esame Amilasi assente L amido non è stato idrolizzato dalla specie batterica in esame
IDROLISI DELLA CASEINA La prova ha lo scopo di verificare se le cellule del microrganismo in esame possiedono l isoenzima proteolitico caseinasi, grazie al quale sono in grado di idrolizzare, per via biochimica, il substrato caseina (contenuto nel terreno di coltura per aggiunta di latte vaccino) negli amminoacidi costituenti più solubili in acqua. La caseina è un importante proteina del latte sia vaccino (80% delle proteine totali) che umano (45% delle proteine totali); non è una sostanza pura, ma una miscela, in proporzioni variabili, di tre caseine a diverso peso molecolare. Chimicamente è una fosfoproteina e nella sua struttura molecolare è presente acido fosforico esterificato con la serina e salificato con il calcio. La sua importanza nutrizionale deriva dal fatto che in essa sono presenti tutti gli amminoacidi essenziali per la crescita. terreno di coltura: AGAR CASEINA (AC) sterile liquefatto 1 piastra Petri in plastica sterile 1 ansa di metallo bunsen La prova consiste nell inoculare la superficie del terreno Agar Caseina con la coltura batterica in esame e di incubare alla temperatura ottimale di crescita per 2-3 giorni. Dopo il periodo di incubazione, si verifica la presenza o l assenza di un alone di idrolisi trasparente intorno allo striscio batterico. Siglare la piastra con nome gruppo e AC. Allestire con tecnica sterile la piastra con Agar Caseina (AC) sterile liquefatto a 45-50 C e lasciare solidificare. Con tecnica sterile, prelevare un ansata della coltura di lavoro del microrganismo in esame ed eseguire un unico striscio verticale al centro della piastra, ripetendo più volte l inoculo. Lasciare a riposo la piastra chiusa per almeno 15 minuti, quindi rovesciarla e incubare per 2-3 giorni alla temperatura ottimale di crescita. Lettura dei risultati È sufficiente osservare la superficie del terreno. Intorno allo striscio batterico è presente un alone di idrolisi trasparente, mentre la restante superficie del terreno è opaca Tutta la superficie del terreno è opaca Enzima caseinasi Idrolisi della caseina Caseinasi presente La caseina è stata idrolizzata dalla specie batterica in esame Caseinasi assente La caseina non è stata idrolizzata dalla specie batterica in esame
IDROLISI DELL UREA La prova ha lo scopo di verificare se le cellule del microrganismo in esame possiedono l enzima ureasi, grazie al quale sono in grado di idrolizzare, per via biochimica, il substrato urea (contenuto nel terreno di coltura) in anidride carbonica ed ammoniaca secondo la seguente reazione: (NH 2 ) 2 CO + H 2 O ureasi CO 2 + 2 NH 3 terreno di coltura: BRODO UREA (BU) sterile 1 provetta sterile con tappo 1 portaprovette 1 ansa di metallo bunsen La prova consiste nell inoculare il Brodo Urea con la coltura batterica in esame e di incubare alla temperatura ottimale di crescita per 2-3 giorni. Dopo il periodo di incubazione, si osserva la variazione o meno del colore del terreno, dovuto al viraggio dal rosso arancio al rosso intenso (l indicatore vira verso ph basici perché si produce più ammoniaca che anidride carbonica) dell indicatore acido-base presente in esso [Rosso Fenolo giallo 6,8-8,4 rosso]. Siglare la provetta con nome gruppo e BU. Allestire con tecnica sterile la provetta con 4-5 ml di Brodo Urea (BU) sterile. Con tecnica sterile, prelevare un ansata della coltura di lavoro del microrganismo in esame e trapiantarla nel Brodo Urea, ripetendo più volte l inoculo. Incubare per 2-3 giorni alla temperatura ottimale di crescita. Provette di controllo 1 provetta con solo Brodo Urea. 1 provetta con Brodo Urea inoculata con colonie ureasi negative (Escherichia coli o Staphylococcus aureus). 1 provetta con Brodo Urea inoculata con colonie ureasi positive (Micrococcus luteus o Proteus vulgaris). Lettura dei risultati Osservare la colorazione assunta dal terreno di coltura, confrontandola con quella delle provette di controllo. Il terreno è diventato torbido e di colore rosso intenso (in confronto alle provette di controllo) Il terreno è diventato torbido ma è rimasto del colore rosso arancio iniziale (in confronto alle provette di controllo) Enzima ureasi Idrolisi dell urea Ureasi presente L urea è stata idrolizzata dalla specie batterica in esame Ureasi assente L urea non è stata idrolizzata dalla specie batterica in esame
DEGRADAZIONE DEL TRIPTOFANO (PRODUZIONE DI INDOLO) La prova ha lo scopo di verificare se le cellule del microrganismo in esame possiedono l enzima triptofanasi, grazie al quale sono in grado di degradare, per via biochimica, il substrato triptofano (amminoacido contenuto nel terreno di coltura sottoforma di triptone) ad indolo, acido piruvico ed ammoniaca secondo la seguente reazione: triptofano indolo acido piruvico Il triptofano è uno dei venti amminoacidi che possono essere presenti nelle catene polipeptidi che delle proteine nel processo di sintesi proteica. L indolo è un importante intermedio nell anabolismo (o biosintesi, in cui molecole semplici si aggregano per formare macromolecole) e nel catabolismo (in cui le molecole organiche assunte come nutrimento si degradano in prodotti finali più semplici) del glucosio. terreno di coltura: BRODO INDOLO NITRATO (BIN) sterile 1 provetta sterile con tappo 1 portaprovette 1 ansa di metallo bunsen Reattivo di Kovacs (soluzione di p-dimetilamminobenzaldeide in alcool n- amilico, acida per acido cloridrico) preparata di fresco La prova consiste nell inoculare il Brodo Nitrato con la coltura batterica in esame e di incubare alla temperatura ottimale di crescita per 2-3 giorni. Dopo il periodo di incubazione, si addizionano alcune gocce del Reattivo di Kovacs e si osserva la colorazione dello strato superficiale alcoolico. Se le cellule del microrganismo in esame possiedono l enzima triptofanasi, durante la loro crescita degradano il triptofano contenuto nel terreno di coltura ad indolo, perciò addizionando alcune gocce del Reattivo di Kovacs si osserverà la comparsa di uno strato superficiale di colore rosso-violetto intenso dovuto al Rosindolo (immina secondaria) dovuto alla seguente reazione: Siglare la provetta con nome gruppo e BIN. Allestire con tecnica sterile la provetta con 4-5 ml di Brodo Indolo Nitrato (BIN) sterile. Con tecnica sterile, prelevare un ansata della coltura di lavoro del microrganismo in esame e trapiantarla nel Brodo Indolo Nitrato, ripetendo più volte l inoculo. Incubare per 2-3 giorni alla temperatura ottimale di crescita. Provette di controllo 1 provetta con solo Brodo Indolo Nitrato. 1 provetta con Brodo Indolo Nitrato inoculata con colonie indolo negative (Staphylococcus aureus). 1 provetta con Brodo Indolo Nitrato inoculata con colonie indolo positive (Escherichia coli o Proteus vulgaris).
Lettura dei risultati Addizionare alla brodocoltura circa 0,5 ml (10 gocce) di Reattivo di Kovacs, mescolare e lasciare a riposo per almeno 1 minuto. Osservare la colorazione assunta dallo strato superficiale (l alcool amilico contenuto nel Reattivo è immiscibile e più leggero dell acqua contenuta nel terreno). Enzima triptofanasi Produzione di indolo Il terreno è diventato torbido per la crescita batterica e lo strato superficiale si è colorato in rosso-violetto (in confronto alle provette di controllo) Il terreno è diventato torbido ma lo strato superficiale è rimasto del colore iniziale (in confronto alle provette di controllo) Triptofanasi presente Il triptofano è stato decomposto ad indolo dalla specie batterica in esame Triptofanasi assente Il triptofano non è stato decomposto ad indolo dalla specie batterica in esame DEGRADAZIONE DELL ACQUA OSSIGENATA (RICERCA DELLA CATALASI) 11.6. DEGRADAZIONE DEL CITOCROMO C (RICERCA DELL OSSIDASI) La ricerca di questi due enzimi viene trattata insieme in quanto essi vengono comunemente definiti enzimi respiratori, cioè enzimi in grado di catalizzare reazioni biochimiche in cui è coinvolto l ossigeno. La catalasi è l enzima che catalizza la degradazione dell acqua ossigenata secondo la seguente reazione: 2 H 2 O 2 catalasi 2 H 2 O + O 2 È noto (vedi anche 10.2. Effetto della concentrazione di ossigeno) che l acqua ossigenata è estremamente tossica per le cellule batteriche, di conseguenza molte specie di batteri aerobi e anaerobi facoltativi sono dotate di catalasi, enzima che permette loro di vivere in un ambiente ricco di ossigeno; alcune specie, come i batteri aerotolleranti, sono prive di catalasi, ma possiedono un altro enzima respiratorio, la perossidasi, che catalizza la distruzione di un altro composto tossico (il radicale superossido, O 2 ) derivante dalla presenza di ossigeno nell ambiente di crescita; gli anaerobi obbligati sono privi sia di catalasi che di perossidasi, perciò muoiono in presenza di ossigeno. In genere si chiamano ossidasi quegli enzimi, appartenenti al gruppo delle ossidoreduttasi (deidrogenasi, ossidasi, perossidasi, ecc.), che catalizzano le reazioni redox ove l ossigeno funge
da accettore di e - (elettroni) e di H + (protoni). Una caratteristica peculiare dei microrganismi che nel metabolismo energetico realizzano la respirazione aerobica, è la presenza di una particolare catena enzimatica che trasporta gli e - e gli H + all ossigeno. In una classica catena respiratoria, presente nei mitocondri delle cellule eucariote, troviamo: deidrogenasi il cui gruppo prostetico è il NAD (coenzima piridinico), deidrogenasi il cui gruppo prostetico FAD (coenzima flavinico), ubichinone (si tratta di un chinone e quindi è una sostanza non proteica a basso PM), sequenza di citocromi (cromo-proteine il cui gruppo prostetico è un EME, cioè un atomo di ferro allo stato di ossidazione ridotto, 2+, raggruppabili in tre famiglie principali: a, b, c). Durante il trasporto di e - e di H + si ha liberazione di energia sottoforma di ATP; il processo catabolico (serie di reazioni biochimiche catalizzate ciascuna da un diverso enzima nelle quali le sostanza nutrienti vengono decomposte in frammenti più piccoli) è denominato respirazione aerobia. I batteri, che sono dei procarioti, non posseggono mitocondri e la catena respiratoria, quando c è, si trova localizzata a livello della membrana cellulare o delle sue invaginazioni. L ossidasi (termine abbreviato per indicare la citocromo c ossidasi) è l enzima che catalizza l ossidazione del citocromo c (Fe 2+ ) ad opera dell ossigeno secondo la seguente reazione: 2 citocromo c (Fe 2+ ) + ½ O 2 + 2 H + ossidasi 2 citocromo c (Fe 3+ ) + H 2 O terreno di coltura: AGAR TRIPTONE SOIA (ATS) sterile liquefatto 1 provetta sterile con tappo, 1 portaprovette 1 ansa di plastica sterile Bunsen, 1 vetrino da orologio 1 dischetto di carta impregnato N-N-dimetil-p-fenilendiammina ossalato Acqua sterile, Acqua ossigenata al 3% La prova consiste nell inoculare con la coltura batterica in esame uno slant di ATS e di incubare alla temperatura ottimale di crescita per 2-3 giorni, in modo da ottenere delle cellule batteriche fresche. Dopo il periodo di incubazione si verifica, in due fasi distinte, la presenza dei due enzimi respiratori. Ricerca dell ossidasi: se le cellule del microrganismo in esame possiedono l enzima citocromo c ossidasi esso, in presenza di ossigeno, ossida il citocromo c dalla forma ridotta alla forma ossidata; quest ultimo viene poi nuovamente ridotto a contatto con il substrato enzimatico artificiale N-N-dimetil p- fenilendiammina ossalato di cui è impregnato il dischetto, incolore allo stato ridotto, con formazione di un composto colorato in rosso porpora: citocromo c (Fe 3+ ) + N,N-dimetil-p-fenilendiammina ossalato citocromo c (Fe 2+ ) + composto rosso porpora Ricerca della catalasi: se le cellule del microrganismo in esame possiedono l enzima catalasi sono in grado di degradare l acqua ossigenata, perciò si osserva la formazione di bollicine di ossigeno gassoso (reazione ad inizio paragrafo). Siglare 1 provetta con nome gruppo e ATS. Allestire con tecnica sterile la provette con 10 ml di Agar Triptone Soia (ATS) sterile liquefatto a 45-50 C e lasciare solidificare su piano inclinato. Con tecnica sterile, prelevare con ansa di plastica sterile (il metallo potrebbe falsare la prova di ricerca dell ossidasi) un ansata della coltura di lavoro del microrganismo in esame e trapiantarla strisciando sulla superficie dell agar inclinato, ripetendo più volte l inoculo. Incubare per 2-3 giorni alla temperatura ottimale di crescita.
Lettura dei risultati (da eseguire nell ordine indicato) Ricerca dell ossidasi Appoggiare un dischetto contenente N-N-dimetil-p-fenilendiammina ossalato sopra ad un vetrino da orologio pulito e secco ed inumiditelo con acqua sterile. Con ansa di plastica sterile prelevare un po di cellule cresciute sullo slant di ATS e depositare, strisciando, sul dischetto inumidito. Dopo circa 30 secondi osservare la colorazione assunta dal dischetto. Enzima citocromo c ossidasi (o ossidasi) Ossidazione della fenilendiammina Il dischetto di carta assume una Ossidasi presente colorazione da rosa a porpora entro 30 secondi Il substrato artificiale è stato ossidato dalla specie batterica in esame, perciò essa possiede anche il substrato naturale citocromo c Il dischetto di carta non assume alcuna colorazione entro 30 secondi, ma rimane del colore iniziale Ricerca della catalasi Ossidasi assente Il substrato artificiale non è stato ossidato dalla specie batterica in esame, perciò essa non possiede il substrato naturale citocromo c Addizionare alcune gocce di acqua ossigenata al 3% direttamente sulle cellule cresciute sullo slant di ATS. Osservare se sulla superficie dello slant si sviluppano bollicine di ossigeno. Enzima catalasi Degradazione dell acqua ossigenata Catalasi presente Sulla superficie batterica si sviluppano bollicine di gas L acqua ossigenata è stata degradata ad ossigeno e acqua dalla specie batterica in esame Sulla superficie batterica non si sviluppano bollicine di gas Catalasi assente L acqua ossigenata non è stata degradata ad ossigeno e acqua dalla specie batterica in esame
Alunni Classe Data di consegna dei risultati Genere Specie CEPPO BATTERICO IN ESAME LE ATTIVITÀ BIOCHIMICHE ENZIMATICHE IDROLISI DELL AMIDO Alone di idrolisi Enzima amilasi (presente o assente) IDROLISI DELLA CASEINA Alone di idrolisi Enzima caseinasi (presente o assente) IDROLISI DELL UREA Colorazione assunta dal terreno Enzima ureasi (presente o assente) PRODUZIONE DI INDOLO Colorazione dello strato superficiale del terreno Enzima triptofanasi (presente o assente) RICERCA DELL OSSIDASI Colorazione assunta dal dischetto Enzima ossidasi (presente o assente) RICERCA DELLA CATALASI Sviluppo di ossigeno dall acqua ossigenata Enzima catalasi (presente o assente) AGAR AMIDO (AM) AGAR CASEINA (AC) BRODO UREA (BU) BRODO INDOLO NITRATO (BIN) AGAR TRIPTONE SOIA (ATS) AGAR TRIPTONE SOIA (ATS)