La spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) è una tecnica analitica strumentale che permette di ottenere dettagliate informazioni sulla struttura molecolare dei composti in esame. La spettroscopia NMR misura l assorbimento di radiazione elettromagnetica di frequenza radio in molecole immerse in un forte campo magnetico. Queste radiazioni provocano transizioni di spin nucleare in particolari atomi (tipicamente 1 H o 13 C). Quindi, con la spettroscopia NMR, le informazioni sulla struttura molecolare vengono dedotte osservando il comportamento dei nuclei atomici.
I nuclei più studiati sono il protone 1 H, il più diffuso nei sistemi biologici, il 13 C, ed il 31 P. Analisi di molecole semplici di interesse chimico organico, ma anche peptidi, polipeptidi, proteine, nucleotidi ed acidi nucleici. Studio delle modificazioni della struttura proteica a seguito di denaturazione, la conformazione del sito attivo degli enzimi, i legami con substrati, inibitori e ligandi, i meccanismi di reazione.
The process of determining a solution structure by NMR is one of measuring many (hundreds/thousands) of short proton proton distances and angles, and restraining the protein structure with these computationally. Modern NMR spectroscopic studies of proteins rely on multidimensional experiments involving 1 H, 13 C, and 15 N nuclei in isotopically labeled proteins. These methods provide for signal selection (selectivity) and a means to reduce signal overlap.
Ubiquitina (8,5 kda): 1D spectra
Citocromo c (12,5 kda): 2D spectra
Sono state messe a punto metodiche per la determinazione nei liquidi biologici (siero, urine, liquido cefalo rachidiano) di metaboliti quali glucosio, acido lattico, creatina, creatinina, glutatione, amminoacidi. Segnali NMR ottenuti dalle molecole di acqua: si hanno segnali diversi da molecole di acqua libera o legate; si hanno tempi di rilassamento più brevi per molecole d acqua legate alle proteine o trattenute da sali presenti in soluzione.
La rapida evoluzione della strumentazione ha permesso di ottenere segnali in vivo e sono state messe a punto diverse metodiche, che possono essere ricondotte a due modalità principali: -Spettroscopia di Risonanza in vivo- o NMR in vivo, o MRS e comunemente specificata 1 H- MRS, 13 C-MRS, 31 P-MRS. -Risonanza magnetica imaginig - o MRI.
La condizione da soddisfare per effettuare un MRS è quella di poter localizzare un campo magnetico omogeneo in una zona ristretta e specifica del corpo. Con la MRS è possibile studiare reazioni metaboliche in vivo in tempo reale. Esempio: spettri di fosforo rilevabili nell avambraccio a riposo ed in contrazione, che consentono di valutare le variazioni del fosfato inorganico, dell ATP, e della fosfocreatina indotte dall attività muscolare.
Con la MRS si analizzano spettri del fosforo-31, del carbonio-13, oppure dell idrogeno legato alle molecole organiche, che possono avere funzione di marker di specifiche attività metaboliche. La MRS, tecnica non invasiva, analizza volumi di tessuto da 15 a 40 ml. Il dosaggio dei metaboliti fosforilati è utile in svariate condizioni: Medicina sportiva (x valutare l efficienza del tessuto muscolare sano); Distrofie muscolari; Ischemia miocardica e cerebrale (x valutare la capacità di recupero); Valutazione della vitalità degli organi da utilizzare per il trapianto.
La MRI si fonda esclusivamente sulla risonanza dei nuclei di idrogeno dell acqua presente nei tessuti. Gradiente di intensità di campo magnetico. La MRI sfrutta il fatto che dai nuclei presenti nel campione derivano segnali distinti con diverso valore di radiofrequenza per ottenere informazioni sulla localizzazione spaziale dei protoni che risuonano.
I parametri dello spettro che vengono utilizzati per costruire l immagine sono l intensità dei segnali, che dipende dal numero dei nuclei per unità di volume, ed i tempi di rilassamento, che dipendono dalla mobilità del mezzo in cui si trovano. Tutti i dati vengono raccolti e elaborati da un computer con un software dedicato che costruisce l immagine della regione spaziale esaminata. E un indagine tomografica che analizza cioè sezioni del soggetto in esame, operando come uno scanner.
La MRI da immagini molto più chiare della TAC, rispetto alla quale presenta il vantaggio di non usare radiazioni, come i raggi X. L TAC è sensibile agli ispessimenti, mentre MRI è invece sensibile alla fluidità dei liquidi. Questa caratteristica ne fa uno strumento indispensabile per l esame ad es. della funzionalità cerebrale con l applicazione detta Risonanza Magnetica Funzionale o fmri (Functional Magnetic Resonance Imaging).
http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extaction / http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/ http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/ http://telstar.ote.cmu.edu/biology/lab/index.html#pr oteins