SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO ATOMICO

SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO ATOMICO Questa tecnica è la più utilizzata nella chimica analitica per la determinazione quali quantitativa di specie inorganiche; è basata sull esame dell assorbimento di una radiazione elettromagnetica dopo che questa passa in un mezzo in cui il campione sia presente come atomi o ioni monoatomici. Quando un atomo viene posto nelle condizioni di acquistare energia elettromagnetica di intensità adeguata, uno o più elettroni esterni posso infatti abbandonare gli orbitali in cui abitualmente si trovano, per venire promossi ad orbitali più ricchi di energia. Di conseguenza l atomo, che si trovava nella sua configurazione elettronica normale (o stato energetico fondamentale) raggiunge un livello energetico più ricco di energia e quindi meno stabile (stato eccitato). Da questo stato eccitato l atomo decade rapidamente, tornando allo stato fondamentale e restituendo all ambiente l energia appena acquistata. Questo processo di decadimento energetico, che consiste nel ritorno degli elettroni eccitati agli orbitali primitivi, avviene prevalentemente per via termica, nel senso che l energia accumulata viene dispersa mediante urti con particelle che si trovano nelle vicinanze degli elettroni eccitati: questo è dunque un meccanismo di rilassamento non radiante (quenching)! Dato che ogni atomo dispone di un numero suo proprio di elettroni, situati su determinati orbitali, è possibile spettri di assorbimento atomico caratteristici, costituiti da una serie di righe, dette righe di risonanza, la cui intensità è proporzionale alla probabilità della transizione elettronica corrispondente. Il termine riga di risonanza sta ad indicare in generale tutte le transizioni che partono dal livello fondamentale. Le righe di risonanza primaria per metalli alcalini come Li, Na e K sono, ad esempio, costituite da doppietti che corrispondono alla transizione dell elettrone dall orbitale s all orbitale p ( s p). Il motivo per cui si osservano doppietti e non semplici linee risiede nello spin dell elettrone, che viene associato abitualmente al suo movimento di rotazione. Dato che gli spin possibili sono 2, abbiamo anche due livelli energetici possibili, molto vicini, per l elettrone nell orbitale da cui si effettua il salto. Le righe che si osservano, inoltre, non sono veramente monocromatiche ma hanno un un ampiezza di circa 2*10-3 nm, e l allargamento della riga spettrale deriva dalla somma di tre contributi: 1

ALLARGAMENTO DI LORENZ: gli atomi si urtano continuamente e le collisioni fanno variare, anche se di poco, i livelli energetici degli atomi stessi (di conseguenza l assorbimento delle radiazioni avviene a frequenze non rigorosamente esatte, ma entro una ristrettissima gamma di queste). Dato che gli urti sono casuali, si avrà una banda (banda molto ristretta di frequenze) con andamento gaussiano. ALLARGAMENTO DOPPLER: gli atomi assorbono stando in movimento; ne consegue, in base all effetto Doppler, una variazione nella frequenza della radiazione assorbita. Gli atomi, più precisamente, hanno velocità diverse, così vedranno i fotoni spostati verso il rosso o verso il blu, assorbendo fotoni di energie diverse nel sistema di riferimento dell'osservatore. Più è alta la temperatura alla quale è sottoposto l atomo, più è grande la differenza di velocità, e più larga sarà la linea. L'effetto Doppler è un cambiamento apparente della frequenza o della lunghezza d'onda di un'onda percepita da un osservatore che si trova in movimento rispetto alla sorgente delle onde. Quindi, se la sorgente della radiazione è in movimento rispetto all'osservatore, allora le righe dello spettro si spostano in funzione della velocità relativa. Questo avviene perché cambia il numero di onde intercettate nell'unità di tempo, come si vede dalla figura in basso. Se la sorgente si avvicina all'osservatore, la frequenza osservata aumenta (osservatore a sinistra). Se invece si allontana, allora la frequenza osservata diminuisce (osservatore a destra). ALLARGAMENTO NATURALE: secondo il principio di indeterminazione di Heisenberg (il principio sostiene che non è possibile conoscere simultaneamente la posizione e la velocità di un dato oggetto con precisione arbitraria; inoltre quantifica esattamente l'imprecisione) esiste una precisa relazione tra il tempo che unatomo trascorre in un determinato stato quantico e l energia di tale stato. L energia non ha un valore ben definito, ma si colloca in un intervallo di possibili valori: h E t 2π E 0 per t ----------- stato eccitato E per t 0 ----------- stato eccitato SPETTRI A RIGHE 2

Una linea spettrale è una linea scura o chiara in uno spettro altrimenti uniforme e continuo, è la conseguenza di un assorbimento o emissione di fotoni in una stretta gamma di frequenza. Le linee spettrali sono il risultato di interazioni tra un sistema quantistico (di solito atomi, ma qualche volta molecole o nuclei atomici) e singoli fotoni. Quando un fotone ha l'energia corretta per permettere un cambio nello stato energetico del sistema (nel caso di un atomo è solitamente un salto orbitale di elettrone), il fotone è assorbito. Poi sarà riemesso spontaneamente, o nella stessa frequenza dell'originale o in cascata, dove la somma dell'energia dei fotoni emessi sarà la stessa del fotone assorbito. La direzione dei nuovi fotoni non sarà in relazione alla direzione del fotone originale. A seconda della geometria dell atomo, della fonte del fotone e dell osservatore, sarà prodotta o una linea di assorbimento. Se l atomo è tra la fonte del fotone e l'osservatore, si osserverà un calo nell'intensità di luce nella frequenza del fotone incidente, poiché i fotoni riemessi saranno in direzioni diverse dell'originale. Questa è una linea di assorbimento. Le linee d'assorbimento sono estremamente atomo-specifiche, e possono essere usate per identificare facilmente la composizione chimica di tutti i mezzi che la luce può attraversare. Altri meccanismi, oltre l'interazione atomo-fotone, possono produrre linee spettrali. A seconda dall'interazione fisica (con molecole, singole particelle, ecc.) la frequenza dei fotoni coinvolti varia ampiamente, e le linee possono essere osservate lungo tutto lo spettro elettromagnetico, dalle onde radio ai raggi gamma. Una linea spettrale si espande su una serie di frequenze, non su una sola frequenza. Le ragioni di questo allargamento sono diverse: allargamento naturale, allargamento doppler, allargamento di Lorenz. LO SPETTRO DEL SODIO Abbiamo detto che ogni elemento ha un determinato numero di elettroni, che lo caratterizza. Poiché nello stato fondamentale gli elettroni occupano gli orbitali disponibili secondo una specifica configurazione (quella di minima energia), l insieme delle possibili transizioni elettroniche verso orbitali più esterni è caratteristico di ciascun elemento. 3

Ogni transizione corrisponde all assorbimento di una precisa energia e produce una riga spettrale con una caratteristica lunghezza d onda. Prendiamo ad esempio le transizioni che si osservano per sodio, potassio e litio. Ora, lo spettro emesso dai vapori caldi di una sostanza può essere costituito da un singolo colore, come accade per il giallo nelle lampade a vapore di sodio, il rosso nelle lampade al neon, il bluverde nelle lampade a vapori di mercurio. In questi casi lo spettro consiste di varie righe, ciascuna relativa a una specifica lunghezza d'onda, separate una dall'altra da regioni di completa oscurità. Prendiamo in considerazione lo spettro caratteristico dei vapori di sodio (Na, 11 elettroni, configurazione: 1s 2 2s 2 2p 6 3s 1 ; l elettrone interessato alla transizione è quello di valenza, ovvero quello che si trova nel guscio più esterno) Questo contiene il cosiddetto doppietto: due righe di lunghezza d'onda molto simile, 588,99 e 589,59 nm, dette rispettivamente D 2 e D 1, non distinguibili dall'occhio umano, ma osservabili con uno spettroscopio ad alta risoluzione. 4

In questi casi solo uno spettrografo ad alta risoluzione riesce a distinguere le righe, strettissime ed estese a una percentuale molto ridotta dello spettro, che per il resto appare completamente buio. La maggior parte dell'intensità dello spettro dei vapori di sodio è concentrata nel doppietto. Tuttavia, ad alte temperature, quali quelle indotte da un arco elettrico o da una scintilla elettrica, nello spettro compaiono numerose altre righe più deboli, determinate da stati atomici eccitati, ovvero corrispondenti a transizioni elettroniche fra orbitali più periferici rispetto al nucleo. 5

Parlando della serie principale, responsabile dello spettro più importante del sodio, vediamo che le linee tendono ad accumularsi e a farsi meno intense nella parte dello spettro a λ inferiori a 590 nm. Questo perché è la transizione 3s 3p la transizione più probabile, essendo gli orbitali più vicini. Gli orbitali più esterni, invece, sono lontani dall orbitale occupato dall elettroni di valenza e molto vicini tra di loro; l energia necessaria per simili transizioni è molto più elevata rispetto a quella principale e questo le rende, appunto, transizioni via via meno probabili. 6

RELAZIONE TRA ASSORBIMENTO ATOMICO E CONCENTRAZIONE Per determinare la quantità di un elemento si può atomizzare il campione in cui è contenuto, eccitare i suoi atomi con radiazioni di opportuna lunghezza d onda e misurare l entità della radiazione assorbita (più precisamente, flusso radiale). Alle normali temperature di esercizio(che sono relativamente basse) la maggior parte degli atomi si trova nello stato fondamentale e una parte, sia pur minima, può trovarsi uno stato termicamente eccitato; questi atomi, perciò, non partecipano al processo di assorbimento che si intende misurare. In particolare, l entità degli atomi eccitati alla temperatura operativa è data dall espressione: Tale percentuale è però bassissima! E % N eccitati 100 = KT atomi eccitati = e 100 N stato fondamentale L assorbimento, che dipende dal numero di atomi nello stato fondamentale, è direttamente proporzionale all intera popolazione di atomi presenti sul cammino ottico della radiazione e quindi alla concentrazione dell elemento nel campione ( se l atomizzazione viene ottenuto con una fiamma) oppure alla quantità dell elemento (se l atomizzazione viene ottenuta con sistemi senza fiamma). In queste condizioni l assorbimento atomico sia pure in un intervallo di linearità abbastanza ristretto segue una legge analoga alla legge di Beer, descritta per l assorbimento molecolare. Per un generico elemento eccitato da una radiazione monocromatica i cui atomi siano dispersi in fase gassosa abbiamo che: Dove: A = x b N x è il coefficiente spettrale di assorbimento atomico b lo spessore dello strato assorbente ( il cammino ottico) N il numero totale di atomi liberi Ovviamente: I I A 0 = log I 0 = radiazione entrante (riferimento) I = radiazione uscente 7

CONSIDERAZIONI GENERALI Gli spettri a righe vengono oggi impiegati non solo per condurre un analisi qualitativa, essendo tali spettri caratteristici per ogni atomo (e questo è dovuto alla specifica distribuzione energetica degli orbitali), ma soprattutto per condurre un analisi quantitativa. In particolare, ricordiamo che la spettroscopia di assorbimento atomico viene impiegata nell analisi farmaceutica per effettuare la determinazione dei metalli residui nei farmaci provenienti da processi di fabbricazione. Questa tecnica è altamente specifica (e questo è un indubbio vantaggio), ma ha dei limiti: è applicabile solo ad elementi metallici ciascun elemento richiede una diversa sorgente di radiazione (lampada a catodo cavo) 8

Gli spettrometri di assorbimento atomico (AAS) La spettrometria di assorbimento atomico (AAS) è ancora oggi, a più di 40 anni dalla sua introduzione come procedura analitica, una tecnica irrinunciabile per qualunque laboratorio di analisi, nonostante l'introduzione di tecniche alternative basate sull'emissione in plasma (ICP). Questo è dovuto principalmente alla sua elevata specificità e selettività, nonché al fatto che è una strumentazione d'uso relativamente semplice. Nella spettrometria AAS, l'intervallo utile di lunghezze d'onda dipende dalla sorgente della radiazione, dai componenti del cammino ottico e dal rivelatore. In pratica il campo spettrale va da 852,1 nm, la lunghezza d'onda più sensibile per il cesio, a 193,7 nm, la lunghezza d'onda più usata per l'arsenico: lo spettrometro per AAS opera perciò nel campo spettrale degli spettrofotometri UV-vis. L'insieme di tutte le parti ottiche e meccaniche necessarie a generare, guidare, disperdere, selezionare e rivelare l'energia radiante viene definito SPETTROMETRO. Nella versione monoraggio la sorgente emette solo le radiazioni (pressoché monocromatiche) dell elemento che ci interessa. Nello strumento a doppio raggio le differenze sono limitate alla presenza ed alla funzione del raggio di riferimento. Come si noterà, qui il raggio di riferimento non passa attraverso la zona di atomizzazione! Il suo compito, infatti, non è quello di passare attraverso il bianco (il che sarebbe impossibile perché la fiamma non è assolutamente uniforme in ogni suo punto, quanto quello di compensare le variazioni di intensità della sorgente o di sensibilità del rivelatore o, infine, le fluttuazioni del sistema elettronico in genere. 9

La qualità di uno spettrometro è, in gran parte, funzione del rapporto segnale/rumore (S/N), che dipende principalmente dalla capacità di trasmettere la radiazione; la qualità dipende perciò dalla capacità di adattare il fascio luminoso: alle dimensioni della sorgente luminosa, al sistema di atomizzazione e all'apparato di dispersione spettrale, nonché dal numero e dalla qualità dei pezzi che compongono il sistema ottico. LE SORGENTI In AAS la sorgente di radiazioni è un dispositivo in grado di generare radiazione elettromagnetica, generalmente mediante una scarica elettrica nel vuoto o in un plasma a bassa pressione. Le sorgenti poste in contenitori sigillati con un gas di riempimento stazionario sono chiamate lampade. In AAS si preferiscono sorgenti che generano radiazioni a linee discrete in grado di emettere le linee spettrali di uno o più elementi: di questo tipo le più usate sono le lampade a catodo cavo e lampade a scarica senza elettrodi. Le sorgenti a spettro continuo trovano applicazioni, in genere, solo nella correzione del fondo. La predilezione per le sorgenti a spettro discontinuo è essenzialmente dovuto al fatto che con sorgenti a spettro continuo in genere si ottengono bande molto larghe rispetto alle bande di assorbimento atomico. 10

Se la sorgente è continua l energia della radiazioni che raggiungono il rivelatore (energia proporzionale alle aree S e S 0 ), in presenza o meno di assorbimento atomico, è praticamente uguale! In queste condizioni risulta difficile misurare con adeguata precisione l entità dell assorbimento. Quando invece la sorgente emette uno spettro a righe, la misura dell assorbimento non comporta problemi perché S e S 0 sono molto diverse fra loro. I tipi di sorgente discontinua (o meglio di radiazioni il più monocromatiche possibili) sono tre: LAMPADE A CATODO CAVO LAMPADE A SCARICA ELETTRONICA DI GAS LAMPADA A SCARICA DI RADIOFREQUENZA Da sempre le sorgenti più usate. LAMPADE A CATODO CAVO (HLC) Esse contengono un catodo cavo, generalmente cilindrico, composto dallo stesso elemento da analizzare, o da una sua lega. L'anodo è in genere di tungsteno o nichel. Il cilindro di vetro porta una finestra di quarzo trasparente, ed è riempito con un gas inerte (neon o argon) a una pressione di 1 kpa. Il meccanismo di funzionamento è semplice. Se si applica agli elettrodi una differenza di potenziale di 100-200 V si verifica una parziale ionizzazione del gas di riempimento (ad esempio Argon). Gli ioni positivi Ar +, accelerati dal campo elettrico, urtano il catodo e provocano l espulsione di atomi di metallo (cioè analita) allo stato fondamentale: questo fenomeno è detto sputtering e porta alla formazione di atomi vaporizzati, i quali collidono successivamente con altri atomi di Ar +, eccitandosi. In seguito all eccitazione e al conseguente rilassamento questi atomi energia luminosa come banda spettrale a righe discrete. 11

Nelle moderne lampade HCL si ottiene un aumento di intensità di emissione, separando il processo di sputtering catodico dal processo di eccitazione degli atomi. In commercio esistono due tipi di lampade a catodo cavo: LAMPADE A SINGOLO ELEMENTO: con queste si possono effettuare analisi di singoli elementi, e per questo sono adatte ad analisi di routine. LAMPADE A MULTIELEMENTO: con queste è possibile analizzare più elementi in successione. Il catodo in questo caso è ricoperto da più elementi (ovviamente compatibili) in lega. Sono più versatili delle prime perché consentono un certo risparmio, ma comportano anche una diminuzione della sensibilità dell analisi e danno anche origine, talvolta, a problemi di sovrapposizione delle righe spettrali. L invecchiamento delle lampade e il loro esaurimento dipende ovviamente dalla velocità con cui l elemento vaporizza. Dal punto di vista analitico, è importante che il rivelatore possa legger soltanto l intensità luminosa uscente, e non anche quella che si genera inevitabilmente nella fiamma (in seguito alla riemissione energetica di tipo radiante da parte degli atomi o delle molecole eventualmente presenti nella fiamma stessa). Tale emissione indesiderata è ovviamente continua, e rappresenta perciò un problema. Il rivelatore viene messo in condizione di riconoscere solo la radiazione che ci interessa effettuando una modulazione del segnale entrante; questa modulazione può essere ottenuta o per mezzo di un settore rotante (chopper, cioè per via meccanica) o alimentando la sorgente con corrente alternata. In conseguenza di ciò la corrente di alimentazione prevista per ogni lampada: è continua per gli strumenti a modulazione meccanica (monoraggio con chopper) alternata nell altro cado (biraggio) LAMPADE A SCARICA ELETTRODICA DI GAS Sono costituite da un ampolla di vetro in cui è posto il metallo insieme a due elettrodi. Una adeguata differenza di potenziale fra i due elettrodi fa scaturire una scarica elettrica che provoca la vaporizzazione del metallo e ne eccita gli atomi, i quali emettono le relative righe spettrali. Attualmente sono state soppiantate dalle lampade a catodo cavo 12

LAMPADE A SCARICA I N RADIOFREQUENZE Sono costituite da un bulbo di vetro nel quale si trova la bobina di un generatore di radiofrequenza. All interno del generatore si trova poi un bulbo di quarzo sigillato contenente a sua volta l elemento da analizzare. L energia generata dal campo di radiofrequenza vaporizza l elemento e ne eccita gli atomi provocando l emissione dello spettro caratteristico con una intensità superiore a quello generato dalle lampade a catodo cavo. ATOMIZZAZIONE IN FIAMMA GLI ATOMIZZATORI La tecnica di atomizzazione in fiamma è la più antica tra le tecniche AAS ed è ancora indispensabile in qualunque laboratorio di routine. Il dispositivo più utilizzato è un bruciatore a premiscelazione e a flusso laminare. Il processo si basa sulla nebulizzazione di una aliquota di campione(sempre in soluzione) in una fiamma, la quale deve avere abbastanza energia per vaporizzarlo e atomizzarlo il campione. La soluzione viene aspirata attraverso un nebulizzatore pneumatico, la cui velocità di aspirazione deve essere regolata ed ottimizzata ogni qualvolta si inizi un analisi; la velocità non deve superare un certo valore perché altrimenti si avrebbe un abbassamento della temperatura della fiamma, riducendo così l efficienza dell atomizzazione e quindi, la sensibilità dell analisi. 13

Dal nebulizzatore la soluzione viene introdotta come spray di aerosol fine nella camera di premiscelazione. dove l'aerosol del campione viene mescolato con una miscela combustibile comburente. Il gas comburente (rappresentato da aria o protossido di azoto) serve per mantenere viva la fiamma, ma funge anche da gas di trasporto per il nebulizzatore; esso ha quindi due entrate, una nella camera di premiscelazione e una nel nebulizzatore: ciò consente di variare il flusso del nebulizzatore senza variare il flusso alla testata. Ricordiamo che l'uso di una camera di premiscelazione evita di avere linee che portano il combustibile e l'ossidante insieme; inoltre nella camera di premiscelazione è presente un dispositivo che serve per abbattere le goccioline di soluzione troppo grosse. La miscela ottenuta viene quindi trasferita nel bruciatore vero e proprio dove avviene la volatilizzazione e l'atomizzazione. I materiali con cui sono costruiti i dispositivi del bruciatore sono studiati per essere i più inerti possibili, così il nebulizzatore è di acciaio inox mentre la testata è di titanio. Possono essere usati vari tipi di fiamma a seconda dell elemento da analizzare: aria-acetilene (2300 C), aria-idrogeno (2050 C), protossido d azoto-acetilene (2800 C) e aria/argon-idrogeno (300-800 C). TIPO DI FIAMMA TEMPERATURE RAGGIUNTE ELEMENTI ANALIZZABILI Aria acetilene 2300 C La più usata, è per tutti i metalli Aria idrogeno 2050 C Metalli alcalini Protossido d azoto acetilene 2800 C Per elementi difficilmente ionizzabili perché tendono a dare composti indissociati (ossidi) Aria - propano 1900 C abbandonata I requisiti di un bruciatore devono essere i seguenti: sicurezza operativa in un ampio intervallo di rapporto ossidante/combustibile alta stabilità termica e ridotto tempo di riscaldamento resistenza alla corrosione geometria della fiamma stabile e conforme alla geometria del fascio lunghezza massima possibile per sfruttare al massimo la legge di Lambert-Beer bassa tendenza a formare incrostazioni anche con soluzioni con solidi sospesi. FORNETTO DI GRAFITE 14

Questo sistema di atomizzazione senza fiamma è chiamata a fornetto di grafite. Si tratta di un sistema interamente automatizzato, che consente di abbassare notevolmente (1000 volte) i limiti di rivelabilità, inoltre consente di lavorare su aliquote molto piccole di campione. Un piccolo volume di campione (20 100 µl) viene introdotto nel tubo di grafite, posto sul cammino ottico della radiazione emessa dalla sorgente. Nel tubo fluisce un gas inerte, che espelle l aria rendendo l atmosfera non ossidante e quindi adatta a far rimanere gli atomi del campione allo stato fondamentale. Il tubo (essendo di grafite, cioè un materiale inerte ad alta conducibilità) viene riscaldato elettricamente secondo un programma a tre stadi, condotti a temperature crescenti, che portano in successione a: evaporazione del solvente incenerimento atomizzazione La misura di assorbimento viene fatta sui vapori atomici che si liberano rapidamente nello stadio finale del riscaldamento. Il segnale che si ottiene è un picco la cui area (altezza) è direttamente proporzionale alla concentrazione dell analita presente allo stato atomico nel tubo di grafite. I vantaggi associati all impiego di questa tecnica sono: aliquote molto piccole di campione limiti di rivelabilità ridotti tempi brevi di analisi (da 2 min a 30 sec) 15

SISTEMA A VAPORI FREDDI Il campione viene fatto reagire con un potente riducente (SnCl 2 o NaBH 4 ). Gli atomi di mercurio (Hg 0 ) vengono allontanati dalla soluzione facendovi gorgogliare dell aria, che viene successivamente essiccata e indirizzata sulla cella a tubo orizzontale di uno spettrofotometro attraversata dalla radiazione. Con questo metodo è possibile rilevare tracce di mercurio fino a 9 ng/l. SISTEMA DI CAMPIONAMENTO A IDRURI VOLATILI Si preparano gli idruri dei metalli da determinare (As, Se, Sb, Bi, Ge, Pb, Sn, Te) per reazione con NaBH 4 in recipienti sigillati. Gli idruri vengono trascinati, mediante correnti di Argon, su una fiamma argon-idrogeno su cui vengono bruciati. Il segnale è un picco, la cui altezza è direttamente proporzionale alla concentrazione del metallo nel campione. Con questa tecnica: i limiti di rivelabilità si abbassano fino al di sotto dei µg/l. si riducono le interferenze dovute alle matrici 16

SISTEMI DI CORREZIONE DELL ASSORBIMENTO DI FONDO Come noto, affinché si realizzi il processo di assorbimento atomico è necessario che la specie chimica interessata venga trasformata in atomi individuali, a partire da ioni. Il campione nebulizzato viene aspirato nel bruciatore dove si miscela con il combustibile e il comburente. Sulla fiamma il solvente evapora ed il sale disciolto fonde, evaporando poi a sua volta. Fino a questo punto l elemento in esame si trova legato ad un anione, risultando una molecola che non presenta il fenomeno dell assorbimento atomico. L energia della fiamma (o del fornetto) permette però la dissociazione in atomi, e la successiva eccitazione. L energia termica fornita acquista perciò un importanza fondamentale. La fiamma aria acetilene è in genere sufficiente per atomizzare la maggior parte degli elementi determinabili via assorbimento atomico. Fiamme meno calde aumentano le interferenze perché l energia che forniscono è insufficiente all atomizzazione completa. Il numero di atomi che si formano nella fiamma determina la quantità di luce assorbita. Se un componente qualsiasi presente nella soluzione modifica il comportamento (e il numero) degli atomi che arrivano alla fiamma, le letture di assorbanza possono risultare anche molto diverse. 17

È quindi molto importante che le soluzioni standard usate per costruire la retta di taratura siano il più possibile simili alla soluzione da analizzare. Abbiamo capito che durante un'analisi mediante spettrofotometria di assorbimento atomico possono verificarsi numerose interferenze; queste vengono distinte in: interferenze spettrali interferenze non spettrali. INTERFERENZE NON SPETTRALI Queste interferenze vengono distinte in interferenze chimiche, fisiche e da ionizzazione Le interferenze chimiche Le interferenze chimiche sono spesso dovute a reazioni indesiderate quali: la formazione di sali insolubili nella fiamma,che non rendono possibile l'atomizzazione del metallo in esame, perché termicamente molto stabili l incompleta atomizzazione dovuta a inadeguate condizioni della fiamma. Se si conduce un analisi spettroscopica mediante utilizzo di atomizzatore a fiamma, questo tipo di interferenza può essere eliminato: 1) scegliendo la fiamma che meglio si adatta al problema del momento, in modo da ottenere la temperatura ideale e creare intorno all'analita l'ambiente più idoneo 2) usando un metallo che fornisca uno ione competitivo. In questo caso le soluzioni dell'analita vengono addizionate cioè con un catione che, rispetto al catione in esame, subisca preferibilmente l'azione dell'anione interferente rendendo così disponibile l'analita. 3) proteggendo l'elemento in esame mediante formazione di un complesso organico assai stabile (spesso con EDTA) che impedisca, o comunque riduca, le reazioni parassite tra il catione e gli anioni interferenti. Il complesso così trattato, al momento dell'atomizzazione nella fiamma, sarà così circondato da una nube di sostanze riducenti che vanificherà le aggressioni da parte di anioni interferenti. Un esempio è dato dal fatto che la presenza di fosfati interferisce nella determinazione del calcio, perché si forma il pirofosfato, che non si dissocia (l assorbimento diminuisce). Questa interferenza può essere eliminata: usando una fiamma più calda aggiungendo una piccolissima quantità di lantanio, che dà un fosfato più stabile di quello di calcio. aggiungendo un eccesso di EDTA che complessa il calcio, dando il chelato Ca- EDTA che si decompone facilmente e rapidamente in fiamma, e quindi non interferisce. Se invece si ha la formazione di composti refrattari all atomizzazione quando si conduce un analisi mediante impiego di fornetto di grafite, tale interferenza può essere eliminata mediante: uso di grafite trattata piroliticamente 18

aggiunta di un modificatore, cioè un reagente che rende più volatile la matrice e meno l analita Le interferenze fisiche matrice analita matrice analita + NH 4 NO3 NaNO3 + NH Cl 1400 C 210 C 380 C 330 C NaCl 4 Queste derivano dalle caratteristiche fisiche della matrice in cui si trova l elemento da analizzare. Se la soluzione è più o meno viscosa degli standard, o se ha una tensione superficiale diversa, il comportamento nella fase di nebulizzazione sarà differente. Di conseguenza non sarà possibile stabilire una correlazione fra il numero di atomi che raggiungono la fiamma provenendo dal campione o dalle soluzioni standard. Sapendo che gli acidi (es. H 3 PO 4 ) o il saccarosio fanno aumentare la viscosità, e che i solventi organici (es. etanolo) fanno diminuire la viscosità, migliorando la resa di nebulizzazione, ci si può comportare di conseguenza, preparando gli standard opportunamente, in modo che siano il più possibile simili al campione (questo mediante l impiego del metodo dell aggiunta). Le interferenze da ionizzazione La fiamma aria acetilene, avendo elevate temperature, può causare una parziale ionizzazione degli atomi di elementi alcalini e alcalino terrosi. Per ovviare a questo problema si usa aggiungere al campione e agli standard un diverso metallo alcalino (agente schermante) in concentrazione massiccia; in tal modo sarà quest ultimo a ionizzarsi principalmente, creando al contempo, a causa del grande eccesso di elettroni nella fiamma, un atmosfera riducente che inibirà la ionizzazione dell elemento che interessa. INTERFERENZE SPETTRALI Le interferenze spettrali sono date da sovrapposizioni di segnali di assorbimento da parte del campione e delle eventuali sostanze interferenti alla lunghezza d'onda desiderata (per esempio interferenze date da altri metalli che presentano una linea spettrale situata in prossimità della riga di risonanza propria dell'elemento in analisi). Anche fumi e sostanze organiche causano un assorbimento non riconducibile solo all'analita, e quindi possono comportare errori notevoli. Possono essere di vario tipo: 1) interferenze spettrali da emissione 2) interferenze spettrali atomiche 3) interferenze spettrali molecolari 4) interferenze spettrali di scattering 5) interferenze non specifiche 19

Interferenze spettrali da emissione Avvengono quando la radiazione emessa dall elemento eccitato sovrappone quella della lampada. Questo si può evitare usando luce pulsata. Interferenze spettrali atomiche Avvengono quando nella matrice si trova un elemento, diverso dall analita, che dà una riga spettrale vicino alla riga analitica; questo causa un aumento dell assorbanza. Le sovrapposizioni non sono molto frequenti perché la lampada fornisce bande passanti molto strette (0,002 nm). Interferenze spettrali molecolari La presenza di specie molecolari presenti nella fiamma può generare notevoli errori nell analisi. Per esempio la presenza di calcio nella matrice di un campione di bario può provocare un errore (in eccesso) nella determinazione del bario. Infatti, la specie molecolare CaOH assorbe 554 nm, molto vicino alla riga di assorbimento del bario (553,6). Questo tipo di interferenza può essere minimizzato usando fiamme con temperature più elevate, migliorando l efficienza di atomizzazione. Interferenze spettrali di scattering Nella fiamma possono esservi particelle solide o gocce di soluzione non perfettamente vaporizzate che provocano fenomeni di diffusione della luce (scattering), aumentando l assorbimento. L intensità della radiazione diffusa è inversamente proporzionale alla quarta potenza della lunghezza d onda. Questo fatto può creare problemi a lunghezze d onda piccole (< 250 nm). Questo tipo di interferenza può essere minimizzato cambiando il rapporto combustibile comburente Per ottenere una completa distribuzione della matrice. Non si può ovviare a questo problema in caso di analisi di un metallo volatile in matrice termoresistente. Interferenze non specifiche (disturbo di fondo) Le interferenze derivanti dall'assorbimento di radiazioni da parte di molecole e radicali presenti nella fiamma sono dette anche non specifiche. Questo assorbimento si somma a quello specifico del solo analita ed è detto assorbimento del fondo. L'assorbimento di fondo si manifesta sulla radiazione di risonanza emessa dalla lampada, quindi risulta modulata dal chopper: l'unico modo per eliminarlo è l'utilizzo della lampada al deuterio nel caso che la lunghezza d'onda dell'analisi sia nell'uv, o mediante l'effetto Zeeman nel caso che si lavori con il fornetto di grafite munito dell'apposito dispositivo, o più semplicemente con il metodo delle aggiunte. Metodo delle linee Correzione dell assorbimento di fondo Per eliminare il rumore di fondo (r.d.f) si misura il segnale del r.d.f. misurando l assorbanza vicino al picco dell analita. 20

Per ottenere il valore di assorbanza dell analita ripulito dal r.d.f si sottrae l assorbanza del r.d.f all assorbanza dell analita misurata. Sistema a sorgente continua Si colpisce il campione con radiazioni pulsate emesse da una sorgente continua (bande passanti di 0,2 nm) e da una lampada a catodo cavo (bande passanti di 0,002 nm). Il rivelatore legge sia il valore di assorbanza dell analita, colpito dalla radiazione proveniente dalla lampada a catodo cavo, insieme al rumore di fondo; sia il valore di assorbanza dell analita colpito dalla radiazione emessa dalla lampada continua, che avendo bande passanti grandi, legge solo l assorbanza dovuta al valore del r.d.f e non quello dell analita che è troppo piccolo, quindi insignificante. Effetto Zeeman Quando si applica un forte campo magnetico alla radiazione emessa o assorbita, si ottiene uno sdoppiamento della riga caratteristica. Dopo l azione del campo magnetico si ottengono due picchi in più a distanza simmetrica dalla riga caratteristica, tutti e tre sono di luce polarizzata. La luce polarizzata avendo una sola componente, si misura direttamente al luce depurata dal r.d.f.. Sistema Smith Se aumento il flusso della corrente alla lampada, essa aumenterà la propria luce (fino ad un valore massimo). Aumentando di colpo la corrente alla lampada, otterrò uno sdoppiamento della lunghezza d onda di lavoro dell analita, che adesso assumerà valore molto basso, quindi non misurerò l assorbanza dell analita, bensì il r.d.f.. Basta sottrarre all assorbanza del campione il segnale del r.d.f misurato, e otterremo il segnale pulito. 21

Determinazione del Ca e del Mg presenti in una soluzione per emodialisi PESO ATOMICO Ca 40 PESO ATOMICO Mg 24 (METODO DELLA CURVA DI TARATURA) CONCENTRAZIONE SOLUZIONE STANDARD Ca 10,7 mg / 100 ml CONCENTRAZIONE SOLUZIONE STANDARD Mg 11,4 mg/ 100 ml DILUIZIONI: 10 ml di entrambe le soluzioni vengono diluiti a 100 ml (soluzioni standard diluite) Vengono preparate almeno tre soluzioni standard di riferimento dell elemento che deve essere determinato, diluendo le soluzioni standard già diluite come segue: VOLUME PRELEVATO (ml) VOLUME FINALE (ml) LETTURE AAS CA ++ LETTURE AAS MG ++ 0 100 0,002 0,005 5 100 0,154 0,168 10 100 0,310 0,341 15 100 0,379 0,519 20 100 0,619 0,685 25 100 0,772 0,835 Conoscendo questi valori di assorbimento e conoscendo le concentrazioni dei diversi campioni di soluzione standard posso costruire una retta di taratura. la soluzione per emodialisi è stata diluita da 5 a 250 ml prima dell analisi per il Ca: si effettua la lettura dell assorbimento atomico del calcio dandoci un valore di 0,343 la soluzione per emodialisi viene diluita da 10 a 100 ml prima dell analisi per il Mg: si effettua la lettura dell assorbimento atomico del magnesio dandoci un valore di 0,554 CALCOLI Inizialmente entrambe le soluzioni erano state diluite da 10 a 100 ml (fattore di diluizione = 10), quindi la concentrazione del Ca 2+ nella soluzione standard diluita è di 1,07 mg/ 100 ml: ottengo così il primo punto della retta di taratura, ottenuta diagrammando l assorbimento in funzione della concentrazione. Per il secondo punto della retta consideriamo che 5 ml della soluzione standard sono stati diluiti a 100 ml (fattore di diluizione = 20), quindi la concentrazione del calcio in questa soluzione è di (1,07 / 20) = 0,0535 mg / 100 ml. 22

Si procede così per i punti 3, 4, 5 e 6, ricavando i seguenti valori, posti in funzione di quelli di assorbimento: CONCENTRAZIONE ASSORBIMENTO (mg / 100 ml) 0 0,002 0,0535 0,154 0,107 0,310 0,160 0,379 0,214 0,619 0,267 0,772 RETTA DI TARATURA 1 ASSORBIMENTO 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 CONCENTRAZIONE L equazione di questa retta è: y = 2,664 x 0,007 Dall equazione e dalla lettura dell assorbimento del calcio nella soluzione per emodialisi (0,343), abbiamo che la concentrazione del calcio nella soluzione campione è: 0343 = 2,664 x 0,0007 x = 0,1314 mg /100 ml La soluzione per emodialisi però era stata diluita da 5 a 250 ml (fattore di diluizione = 50), per cui la concentrazione di Ca nella soluzione iniziale non diluita è: [( 0,1314mg /100ml) 50] = 6,57 mg /100ml = 65,7 mg / l 2+ 65,7 mmol ( Ca )/ l = = 1,643mmol / l 40 La concentrazione della soluzione iniziale è quindi 1,643 mmol/l. 23

Determinazione del Pb nel mannitolo (METODO DELL INCREMENTO STANDARD) H H HO HO CH 2 OH OH OH H H CH 2 OH Si conduce la determinazione del piombo (Pb) nel mannitolo, il cui limite FU è di 0,5 ppm. Per prima cosa si deve preparare una soluzione standard contenente 104 mg / 100 ml di piombo in HNO 3 0,01 M. 10 ml di questa soluzione si diluiscono a 100 ml (fattore dil. = 10) Si prepara una soluzione sciogliendo 100 mg mannitolo in 250 ml di H 2 O. 4 aliquote da 50 ml ciascuna di questa soluzione si mescolano con 0 ml, 0.5 ml, 1 ml e 1.5 ml di soluzione standard diluita. A ciascun campione vengono aggiunti 2 ml di una soluzione satura di pirrolidin ditio carbammato di ammonio (APDC) I campioni vengono estratti con 10 ml di metil isobutil chetone. La fase organica si separa e si analizza con AAS Si ottengono le seguenti letture: CAMPIONE LETTURA 1 0,057 2 0,104 3 0,156 4 0,217 CALCOLI La soluzione standard diluita di Pb contiene: 104 [ Pb] sol. standard = mg /100 ml = 0,0104 mg /100ml = 10,4 µ g / 100 ml 10 100 g di mannitolo sono stati disciolti in 250 ml di acqua; di questa soluzione vengono prelevate 4 aliquote da 50 ml che contengono ciascuna 20 g di mannitolo. La quantità di piombo aggiunto ai 4 campioni è: 1) 0 10,4 = 0 µ g 2) 0,5 10,4 = 5,2 µ g 3) 1 10,4 = 10,4 µ g 4) 1,5 10,4 = 15,6 µ g 24

L equazione della retta ottenuta ponendo le quantità di Pb aggiunte (y) in funzione della lettura (x) è: LETTURA QUANTITÀ DI Pb AGGIUNTO (x) (y) 0,057 0 µg 0,104 5,2 µg 0,156 10,4 µg 0,217 15, 6 µg y = 0,010 x + 0,054 Il valore di x per (y = 0 ) ci da il contenuto di Pb nel campione: 0,054 x = = 5,4 µ g di Pb in 20 g di mannitolo 0,01 In ppm (cioè in 1µg per grammo di sostanza) vediamo che il campione contiene (5,4/ 20) 0,27 ppm di piombo, ed è quindi conforme alla Farmacopea ufficiale. 25