DESTINI METABOLICI DEL PIRUVATO FOSFOENOLPIRUVATO GLUCOSIO ASPARTATO OSSALACETATO Metabolismo amminoacidi ALANINA Metabolismo lipidici Sintesi acidi grassi e steroidi PIRUVATO ACETIL-CoA CICLO DI KREBS ETANOLO LATTATO Ossidazione aerobica del glucosio) FERMENTAZIONI (ossidazione anaerobica del glucosio)
Glicolisi Piruvato Metabolismo aerobico: il piruvato entra nel mitocondrio Acetil-CoA Ciclo di Krebs Catena di trasporto degli elettroni Piruvato Complesso della Piruvato deidrogenasi (PDH) Acetil-CoA La reazione produce oltre all acetil-coa anche un equivalente riducente di NADH che può essere indirizzato alla catena di trasporto di e - mitocondriale.
Complesso della Piruvato deidrogenasi (PDH) Complesso multienzimatico contenente copie multiple di 3 distinte attività enzimatiche (E 1 - E 2 - E 3 ) E 1 = piruvato deidrogenasi (in E. coli 24 subunità) E 2 = diidrolipoammide acetiltransferasi (24 subunità) E 3 = diidrolipoammide deidrogenasi (12 subunità) Decarbossilazione ossidativa del piruvato. È un processo irreversibile.
Subunità E 1 Contiene come cofattore la TPP. Catalizza la decarbossilazione del piruvato e la formazione dell intermedio idrossietil- TPP _ La forma carbanionica dell Idrossietil-TPP è quella più reattiva ed entra in gioco nella reazione successiva D. Voet C. W. Pratt J. G. Voet, FONDAMENTI DI BIOCHIMICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2013 17 4
Subunità E 2 Contiene come cofattore la Lipoammide. La subunità E 1 trasferisce il gruppo idrossietilico dalla TPP sulla lipoammide della subunità E 2 : nel trasferimento l idrossietile è OSSIDATO a gruppo Acetilico e il ponte disolfuro della lipoammide viene ridotto. Si forma un legame tioestere ad alta energia. La subunità E 2 catalizza poi la transacetilazione del gruppo acetilico dalla Lipoammide al Coenzima A con conseguente formazione di Acetil-CoA. La lipoammide rimane nella forma ridotta.
Ciascuno porta un braccio di lipoammide che può caricare un gruppo acetilico Dominio della subunità periferica Il movimento del braccio mobile della lipoammide garantisce una canalizzazione dei prodotti da una reazione all altra, il processo è più efficiente e non si verifica perdita di intermedi metabolici, o la formazione di prodotti secondari Mike Williamson, COME FUNZIONANO LE PROTEINE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2013 10 6
H + H + _ HS S O =C-CH 3 HS S ACETIL DIIDROLIPOAMIDE Mike Williamson, COME FUNZIONANO LE PROTEINE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2013 10 7
Subunità E 3 Contiene come cofattore il FAD. Catalizza l ossidazione della lipoillisina (si riforma il ponte disolfuro) con riduzione del FAD a FADH 2 il quale trasferirà poi 2 e - sul NAD + con conseguente produzione finale di NADH. D. Voet C. W. Pratt J. G. Voet, FONDAMENTI DI BIOCHIMICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2013 17 8
LIPOAMMIDE RIDOTTA HS SH Cys Cys FAD S S OSSIDORIDUZIONI NELLA SUBUNITA E3 FAD FADH 2 NAD + SH SH S S FAD S S + NADH LIPOAMMIDE OSSIDATA Il NADH è un trasportatore mobile di e-, nella forma ridotta lascia il complesso della piruvato deidrogenasi per dirigersi alla catena respiratoria mitocondriale
Piruvato deidrogenasi https://www.youtube.com/watch?v=ysvvryqfqio
reazione irreversibile REGOLAZIONE DEL COMPLESSO DELLA PIRUVATO DEIDROGENASI DISPONIBILITA DEL SUBSTRATO MODULAZIONE ALLOSTERICA MODIFICAZIONI COVALENTI (fosforilazione/defosforilazione) I prodotti della reazione funzionano da modulatori allosterici negativi: Acetil-CoA (sulla transacetilasi, E 2 ) NADH (sulla diidrolipoil deidrogenasi, E 3 ) alte concentrazioni di Acetil-CoA e NADH informano l enzima che non è più necessario metabolizzare il piruvato (le esigenze cellulari sono soddisfatte) L attività della PDH è connessa anche al metabolismo dei lipidi: una elevata degradazione dei lipidi che incrementa il livello di Acetil-CoA e NADH rallenta la PDH e porta al risparmio di glucosio.
ALTE CONCENTRAZIONI DI NADH e Acetil-CoA nel mitocondrio attivano la piruvato deidrogenasi chinasi che fosforilando il complesso lo rende inattivo In condizioni di elevato apporto glucidico, sotto stimolo dell Insulina, è attivata una fosfatasi specifica che defosforila il complesso rendendolo attivo e permettendo quindi l ingresso di piruvato nel ciclo di Krebs D. Voet C. W. Pratt J. G. Voet, FONDAMENTI DI BIOCHIMICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2013 17 12
CICLO DI KREBS (o DELL ACIDO CITRICO) È un processo ossidativo che ha un ruolo centrale nel metabolismo energetico delle cellule eucariotiche. Avviene nella matrice mitocondriale. È alimentato soprattutto dall Acetil-CoA, metabolita chiave prodotto dal catabolismo ossidativo dei carboidrati, dei lipidi, di vari amminoacidi. L energia rilasciata dalle ossidazioni del ciclo di Krebs è conservata come potere riducente (NADH e FADH 2 ) che alimenta la sintesi di ATP mitocondriale.
Per ogni molecola di Acetil-CoA che viene ossidata nel ciclo vengono prodotti: 3 NADH 1 FADH 2 1 GTP (ATP) D. Voet C. W. Pratt J. G. Voet, FONDAMENTI DI BIOCHIMICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2013 17 14
L acetil-coa entra nel ciclo di Krebs nella reazione di condensazione con l ossalacetato che produce il CITRATO liberando CoA-SH ACETIL-CoA CITRATO SINTASI CITRATO OSSALACETATO
SITO ATTIVO DELLA CITRATO SINTASI:I residui di Asp375 e His274 attivano l Acetil-CoA, l His320 attiva l ossalacetato L O carbonilico diventa ossidrile (strappa un H + all His320) D. Voet C. W. Pratt J. G. Voet, FONDAMENTI DI BIOCHIMICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2013 17 16
ISOMERIZZAZIONE: Il gruppo OH deve essere spostato sul carbonio 2 3 2 ACONITASI ACONITASI CITRATO Cis-ACONITATO 3 2 ISOCITRATO Nella cellula, in condizioni reali la reazione è esoergonica, è spinta in avanti dal consumo di isocitrato nella reazione successiva.
H F C C H O - Na + O FLUOROACETIL-CoA: INIBITORE SUICIDA DELL ACONITASI È un metabolita del FLUOROACETATO (Tossina usata come pesticida) Reagisce con l ossalacetato per formare FLUOROCITRATO Il fluoroacetil-coa entra quindi nel ciclo di Krebs, è trasformato dalla citrato-sintasi in FLUOROCITRATO ma quando entra nel sito attivo dell ACONITASI interagisce fortemente con essa inibendola in modo definitivo e bloccando quindi tutto il ciclo e la respirazione cellulare
L ACONITASI è una proteina multifunzionale (moonlighting), ha nel sito attivo un centro ferro-zolfo [4Fe-4S] CARENZA: rende non funzionali le proteine SENSORE DEL FERRO contenenti ferro ECCESSO: tossico per cuore, fegato, pancreas (emocromatosi) Assunzione del Ferro: - Trasportato dalla TRANSFERRINA nel sangue e captato dalle cellulare tramite il RECETTORE DELLA TRASNFERRINA - Ogni eccesso di ferro sequestrato dalla FERRITINA CARENZA DI FERRO L ACONITASI perde il suo centro 4Fe-4S e si trasforma nella PROTEINA REGOLATRICE DEL FERRO 1 (IRP1) Si lega all mrna che codifica per il RECETTORE DELLA TRANSFERRINA e a quello che codifica per la FERRITINA Aumenta la sintesi del RECETTORE e diminuisce la sintesi della FERRITINA Aumenta la CAPTAZIONE di FERRO e la quota di FERRO LIBERO nel citosol
Decarbossilazione ossidativa dell isocitrato Il gruppo OH in C-2 dell isocitrato subisce un ossidazione che porta alla produzione di NADH (NADPH) e alla formazione di un α-chetoacido H + rilasciato dall ossigeno CO 2 Isocitrato ISOCITRATO DEIDROGENASI :H - (ione idruro trasferito sul NAD + ) α-chetoglutarato
SITO ATTIVO DELL ISOCITRATO DEIDROGENASI: MECCANISMO 1 ione idruro è ceduto dal C-2 al NAD +, il gruppo ossidrilico in posizione 2 diventa un carbonile, L intermedio ossalosuccinato interagisce con uno ione Mn 2+ che destabilizza il gruppo carbossilico in C-3 Il gruppo carbossilico in posizione 3 esce come CO 2 Si forma un intermedio enolato, stabilizzato dallo ione Mn 2+ Entra un H + che va a legarsi al C-3 e si ottiene un alfa-chetoacido. D. Voet C. W. Pratt J. G. Voet, FONDAMENTI DI BIOCHIMICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2013 17 21
Ossidazione dell α-chetoglutarato: questa reazione porta alla formazione di un legame TIOESTERE ad alta energia e alla produzione di NADH TPP Lipoammide FAD α-chetoglutarato Complesso dell αchetoglutarato deidrogenasi Succinil-CoA
Complesso dell αchetoglutarato deidrogenasi Simile per struttura e funzione al complesso della piruvato deidrogenasi (sono utilizzati gli stessi coenzimi e avviene la decarbossilazione ossidativa di un α-chetoacido) Intermedio carbanionico Diidrolipoil deidrogenasi (E3) _ OH α-chetoglutarato deidrogenasi (E1) Diidrolipoiltransacetilasi (E2) Succinil-CoA Succinil-diidrolipoammide
L idrolisi del legame tioestere ad alta energia è accoppiata alla fosforilazione di un nucleoside-difosfato (GDP, nei mammiferi, o ADP, piante e batteri). Si ottiene GTP o ATP. Succinil-CoA Succinil-CoA sintetasi Legame tioestere ad alta energia Succinato
SITO ATTIVO DELLA SUCCINIL-CoA SINTETASI: MECCANISMO anidride mista D. Voet C. W. Pratt J. G. Voet, FONDAMENTI DI BIOCHIMICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2013 ADP GDP + ATP 17 25
Ossidazione del succinato a fumarato COMPLESSO II della catena di trasporto di e - mitocondriale Q QH2 Trasferisce gli e - al complesso III SUCCINATO SUCCINATO DEIDROGENASI FUMARATO
FUMARASI FUMARATO Aggiunta STEREOSPECIFICA TRANS di acqua al doppio legame. Quando il fumarato è nel sito attivo dell enzima l aggiunta della molecola d acqua può avvenire solo in una direzione. Stato di transizione carbanionico FUMARASI L-MALATO
Il ciclo di Krebs si conclude con un ossidoriduzione che riforma l ossalacetato e produce NADH L-MALATO MALATO DEIDROGENASI OSSALACETATO Nelle cellule la reazione è fortemente spinta in avanti perché l ossalacetato è continuamente rimosso dalla citrato sintasi la quale mantiene bassa la concentrazione di ossalacetato nel mitocondrio.
BILANCIO ENERGETICO: Se partiamo dall ossidazione di 1 molecola di glucosio possiamo ottenere energia sufficiente a sintetizzare 36 (o 38) molecole di ATP citosol glucosio Glicolisi 2 ATP + 2 NADH sistema navetta del NADH diidrossiacetone-fosfato/glicerolo 3-fosfato: 2 FADH 2 sistema navetta del NADH malato/aspartato: 2 NADH mitocondrio 2 piruvato 2 Acetil-CoA (PDH) 2 NADH Ciclo di Krebs TOTALE: 4 ATP 10 NADH >>>> ~ 30 ATP 2 FADH 2 >>>> ~ 4 ATP 2 x (3 NADH + 1 FADH 2 + 1 GTP(ATP)) TOTALE: 4 ATP 8 NADH >>>> ~24 ATP 4 FADH 2 >>>> ~ 8 ATP ~ 38 ATP ~ 36 ATP
Regolazione del ciclo di KREBS: basata sul fabbisogno di ATP da parte della cellula. -disponibilità substrato -inibizione da accumulo di prodotti -inibizione allosterica Enzimi regolati allostericamente: Citrato sintasi, Isocitrato deidrogenasi e α-chetoglutarato deidrogenasi Inibitori: ATP, NADH, SUCCINIL- CoA, CITRATO Attivatori: Ca 2+, ADP La succinato deidrogenasi risente della velocità con cui procede la fosforilazione ossidativa, e quindi della disponibilità di OSSIGENO D. Voet C. W. Pratt J. G. Voet, FONDAMENTI DI BIOCHIMICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2013 17 30
Negli organismi areobici il ciclo di KREBS s interseca con diverse altre vie anaboliche e cataboliche. Alcuni intermedi del ciclo di Krebs sono precursori nelle vie di biosintesi e diverse vie cataboliche producono intermedi del ciclo attraverso reazioni anaplerotiche Ac. Grassi Ac. grassi, amminoacidi D. Voet C. W. Pratt J. G. Voet, FONDAMENTI DI BIOCHIMICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2013 17 31