GLICOLISI. fruttoso 6-P. fruttoso 1,6-P. gliceraldeide 3-P (2 molecole) Pi 2 NADà 2 NADH+H + 1,3 BPG (2) 2 ADPà 2 ATP. 3 fosfoglicerato (2)

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1 GLICOLISI glucosio, fruttosio, galattosio, mannosio ATPà ADP glucoso 6-P fruttoso 6-P Glicogeno Pi Glucoso 1-P FASE PREPARATORIA ATPà ADP fruttoso 1,6-P SPESA ENERGETICA diidrossiacetone-p gliceraldeide 3-P (2 molecole) Pi 2 NADà 2 NADH+H + 1,3 BPG (2) 2 ADPà 2 ATP 3 fosfoglicerato (2) FASE DI RECUPERO ENERGETICO 2 fosfoglicerato (2) PEP (2) 2 ADPà 2 ATP piruvato (2) LDH lattato (2)

2 Lipidi (trigliceridi)

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5 da: Nelson & Cox 2 H 2 O

6 Il ciclo dell acido citrico collega le vie cataboliche dei carboidrati, dei grassi e delle proteine...inizia con la molecola di acetil coenzima A (acetil-coa), la forma attivata dell acetato. L acetil-coa deriva da: ossidazione degli acidi grassi; ossidazione di alcuni amminoacidi; decarbossilazione ossidativa del piruvato.

7 Il gruppo acetilico dell acetil-coa formatosi dal piruvato, insieme con quello che si forma nel processo della β ossidazione degli acidi grassi e nel catabolismo degli aminoacidi, viene ossidato nel ciclo di Krebs. Gli enzimi del ciclo di Krebs sono localizzati nel mitocondrio in prossimità della catena respiratoria dove vengono convogliati gli elettroni sottratti ai metaboliti intermedi del ciclo.

8 Il Piruvato (formato direttamente dalla glicolisi o indirettamente dal lattato) entra nel mitocondrio tramite carrier specifico, attraversa le 2 membrane e nella matrice viene ossidato dal complesso Piruvato deidrogenasi = PDH Piruvato + coenzima A+ NAD + AcetilCoA + NADH+H + + CO 2

9 Ossidazione del piruvato = Decarbossilazione ossidativa La decarbossilazione ossidativa è: un processo di ossidazione irreversibile in cui il gruppo carbossilico del piruvato viene rimosso sotto forma di molecola di CO2 e i due atomi di carbonio residui diventano il gruppo acetilico legato al CoA. un processo che avviene ad opera del complesso multienzimatico della piruvato deidrogenasi.

10 Complesso multienzimatico della piruvato deidrogenasi si trova nella porzione interna della membrana mitocondriale interna Il complesso enzimatico della piruvato deidrogenasi è formato da 3 unità o attività enzimatiche: E 1, E 2 ed E 3 e 5 coenzimi. E 1 : piruvato deidrogenasi con coenzima legato, TPP (tiamina pirofosfato) E 2 : diidrolipoil transacetilasi con coenzima legato, l acido lipoico E 3 : diidrolipoil deidrogenasi con coenzima legato, il FAD per la reazione complessiva sono necessari altri due coenzimi: coenzima A, come substrato di E2; NAD+, come substrato di E3. Le vitamine coinvolte in questa reazione sono: Tiamina (vit B1) per la TPP. Riboflavina (vit B2) per il FAD. Niacina o ac. nicotinico (vit B3)per il NAD. Ac.Pantotenico (vit B5) per il CoA. Nelle cellule degli organismi superiori fanno parte del complesso due proteine regolatrici della PDH: una chinasi e una fosfatasi:la PDH fosforilata è inattiva. Il Ca ++ attiva la PDH fosfatasi

11 Coenzima A forma un legame tioestere con gruppi acilici di vari composti da: Nelson & Cox V Ed.

12 TPP = tiaminpirofosfato = forma coenzimantica della Vit B1 C2 è l atomo di carbonio reattivo di TPP

13 Ac.lipoico: ac.ditioottanoico L acido lipoico è unito da un legame ammidico alla catena laterale di un residuo di Lys di E2 L acido lipoico può essere presente in forma ossidata o in forma ridotta. Nei mammiferi sono presenti anche due proteine regolatrici, una proteina chinasi e una fosfoproteina fosfatasi. da: Nelson & Cox V Ed.

14 Ossidazione del piruvato = Decarbossilazione ossidativa

15 Meccanismo di azione del complesso della piruvato deidrogenasi Reazione 1, decarbossilazione: il piruvato viene decarbossilato da E 1 (piruvato deidrogenasi), legandosi con il TPP e formando idrossietil-tpp, mentre la CO2 si libera come primo prodotto. Reazione 2, ossidazione: catalizzata da E 1 : il gruppo idrossietilico legato al TPP viene trasferito al 1 braccio mobile lipoammidico su E 2 ed ossidato a gruppo acetilico. Si forma l acetillipoamide. Reazioni 3 e 4, formazione di acetil CoA: catalizzate da E 2 (diidrolipoil transacetilasi). Il gruppo acetilico viene trasferito prima al 2 braccio mobile lipoammidico e poi al CoA-SH, formando acetil CoA.. Riossidazione della diidrolipoamide a lipoamide Reazione 5: catalizzata da E 3 (diidrolipoil deidrogenasi) ossida il braccio lipoammidico ridotto trasferendo 2 H al FAD. Reazione 6: NAD + ossida FADH 2.

16 Lipidi (trigliceridi)

17 Ciclo dell acido citrico o Ciclo di Krebs (Premio Nobel,1953) o Ciclo degli acidi tricarbossilici (TCA). Ha luogo nei mitocondri.

18 Il Ciclo dell acido citrico avviene nella matrice mitocondriale. Il ciclo è costituito da 8 reazioni. Il ciclo è deputato alla demolizione di acetil-coa in CO2. In ogni giro del ciclo entra una molecola di acetil-coa ed escono 2 molecole di CO2. In ogni giro del ciclo viene utilizzata una molecola di ossalacetato che alla fine del ciclo viene rigenerato, quindi non vi è consumo netto di ossalacetato. N.B. L ossalacetato è presente nella cellula in basse concentrazioni.

19 Reazione 1: formazione del citrato dalla condensazione dell acetil-coa con l ossalacetato. Enzima: citrato sintetasi (regolazione allosterica: inibita da NADH e succinil-coa). La reazione è irreversibile. L acetil-coa opera un attacco nucleofilo sul carbonio carbonilico dell ossalacetato: Durante la reazione si forma un intermedio transitorio (citril-coa), un tioestere con elevata energia di idrolisi. L idrolisi di questo intermedio fornisce energia per la reazione di condensazione.

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21 Reazione 2: Formazione dell isocitrato: isomerizzazione (reversibile) del citrato a isocitrato (citrato isocitrato). La reazione procede con la rimozione di una molecola di H2O dal citrato, formazione di un intermedio (cis-aconitato) e aggiunta di una molecola di H2O. La reazione è catalizzata dall aconitasi che possiede un centro ferro-zolfo [4Fe-4S ] importante per il legame del substrato e per la catalisi Il cis-aconitato rimane legato all Enzima

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23 Reazione 3: Decarbossilazione ossidativa dell isocitrato ad α chetoglutarato e CO 2. isocitrato + NAD+ alfa-chetoglutarato + CO2 + NADH + H+ L alfa-chetoglutarato si forma in una reazione irreversibile catalizzata dalla isocitrato deidrogenasi mitocondriale che ha come coenzima il NAD (regolazione allosterica: inibita da NADH e ATP). NADH prodotto cede gli elettroni alla catena trasporto di elettroni (complesso I).

24 Reazione 3: isocitrato deidrogenasi I fase: l'enzima catalizza l'ossidazione dell'isocitrato ad ossalsuccinato, che genera una molecola di NADH a partire da NAD+ II fase: decarbossilazione che porta alla formazione di α-chetoglutarato

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26 Reazione 4: decarbossilazione ossidativa dell α chetoglutarato in succinil-coa e CO 2 da parte del complesso enzimatico α chetoglutarato deidrogenasi (complesso simile alla piruvato deidrogenasi, con analoghi coenzimi e con funzione regolatrice: TPP, acido lipoico, FAD, NAD + e CoA). La reazione è irreversibile. Il complesso dell a-chetoglutarato DH non è regolato covalentemente come il PDH che occupa una posizione metabolicamente più centrale Il succinil-coa è un tioestere ad alta energia come l acetil-coa

27 Reazione 5: fosforilazione a livello del substrato Conversione del succinil-coa a succinato per azione della succinil-coa sintetasi. L idrolisi del legame tioestere del succinil-coa fornisce energia per la sintesi di GTP che viene utilizzato per le reazioni GTP-dipendenti: 1. formazione del fosfoenolpiruvato dall ossalacetato; 2. reazione finale della sintesi proteica. 3. formazione di ATP: reazione della difosfonucleoside chinasi (GTP-ADP fosfotrasferasi).

28 Reazione 6: ossidazione del succinato a fumarato tramite la succinato deidrogenasi, una flavoproteina della membrana interna mitocondriale in grado di trasferire direttamente gli elettroni alla catena respiratoria. succinato + FAD fumarato + FADH2 La reazione è catalizzata dalla succinato deidrogenasi, il cui coenzima è il FAD. La succinato deidrogenasi è legata alla membrana mitocondriale interna; gli altri enzimi del ciclo si trovano nella matrice mitocondriale. Il FADH2 cede gli elettroni alla catena di trasporto degli elettroni (complesso II). Il complesso II è un punto di contatto tra ciclo di Krebs e catena respiratoria

29 Reazione 7: idratazione di un doppio legame C=C del fumarato a malato per azione della fumarasi. Reazione stereospecifica: si produce solo l enantiomero L- malato Reazione 8: deidrogenazione (ossidazione) del malato in ossalacetato tramite la malato deidrogenasi (NAD + dipendente). Si rigenera il prodotto di partenza del ciclo...reazione endoergonica!!!!

30 ² La [ossalacetato] è molto bassa rispetto al [malato] all equilibrio e nelle condizioni cellulari. ² L ossalacetato è il substrato della citrato sintasi che catalizza una reazione fortemente esoergonica. ² Prorio la reazione citrato sintasica mantiene molto bassi i livelli di ossalacetato intramitocondriali. ² L ossalacetato viene continuamente sottratto all equilibrio e la reazione catalizzata dalla malatodeidrogenasi può procedere nella direzione in cui è scritta mantenendo attivo il ciclo.

31 Funzione del ciclo di Krebs oltre a ossidare un numero illimitato di gruppi acetilici con rigenerazione dell ossalacetato che ha un ruolo catalitico u Produzione di ATP u Smistare i metaboliti intermedi ad altre vie metaboliche...come? Reazione netta del ciclo: Acetil-CoA+3H NAD + + FAD + GDP +Pi à 2CO 2 +3 NADH+FADH 2 +GTP+CoA-SH

32 ...Produzione di ATP= FUNZIONE CATABOLICA IL ciclo produce 3 di NADH e 1 FADH2. NADH/FADH2 = trasportatori di elettroni che verranno riossidati per produrre ATP (Fosforilazione ossidativa)

33 RESA ENERGETICA DEL CICLO DI KREBS accoppiata con la fosforilazione ossidativa

34 RESA ENERGETICA NETTA IN ATP DAL METABOLISMO AEROBIO DEL GLUCOSIO 32 (o 30) ATP * *il numero dipende da quale sistema navetta è stato utilizzato per trasferire gli equivalenti riducenti all interno dei mitocondri.

35 navetta malato/ossalacetato malato deidriogenasi malato deidriogenasi navetta diidrossiacetone-fosfato/glicerolo 3-fosfato glicerolo 3P deidriogenasi *glicerolo 3P deidriogenasi *G3PDH mitocondriale ha FAD come coenzima

36 ...Smistare i metaboliti intermedi ad altre vie metaboliche = FUNZIONE ANABOLICA citrato, α-chetoglutarato, ossalacetato, succinil-coa possono essere impiegati per la sintesi di glucidi, lipidi, proteine ed altri composti azotati

37 Quindi nello stesso ciclo si ha: Produzione di ATP= FUNZIONE CATABOLICA Smistare i metaboliti intermedi ad altre vie metaboliche = FUNZIONE ANABOLICA... il ciclo dell acido citrico è pertanto una VIA METABOLICA ANFIBOLICA poiché prende parte sia a processi catabolici che a processi anabolici....come VIENE REGOLATO IL CICLO DI KREBS???

38 REGOLAZIONE del ciclo di Krebs: STATO ENERGETICO La produzione di ATP, e il fornire i metaboliti intermedi ad altre vie metaboliche sono due funzioni regolate proprio dall ATP. Disponibilità di ATP = potenziale energetico: Il potenziale energetico è rappresentato dai rapporti: NADH/NAD +, ATP/ADP+AMP, acetil-coa/coa, succinil-coa/ CoA. Una richiesta di ATP esalta la funzione energetica (catabolica) e richiama intermedi da altre vie metaboliche; la disponibilità di ATP rallenta il ciclo e spinge alcuni intermedi nelle vie metaboliche connesse con il ciclo, rallentando o interrompendo la produzione di ATP.

39 REGOLAZIONE del ciclo di Krebs Quando al ciclo dell acido citrico vengono sottratti intermedi da utilizzare come precursori in altre vie metaboliche, il ciclo rallenta per deficienza degli intermedi. Intervengono le reazioni anaplerotiche (o di riempimento) con il compito di rifornire il ciclo di intermedi mancanti o deficitari. Molto importanti sono le reazioni anaplerotiche che riforniscono il ciclo di ossalacetato. La reazione più importante (fegato, rene), è la carbossilazione del piruvato ad ossalacetato, catalizzata dalla piruvato carbossilasi.

40 REAZIONI ANAPLEROTICHE Altre reazioni anaplerotiche: reazioni di transaminazione alfa-chetoglutarato/glutammato ossalacetato/aspartato

41 REAZIONI ANAPLEROTICHE Piruvato carbossilasi Catalizza la carbossilazione (reversibile) del piruvato ad ossalacetato (una delle prime reazioni della gluconeogenesi). È un complesso enzimatico formato da quattro subunità identiche, ciascuna ha un gruppo prostetico di biotina legato covalentemente ad un residuo di lisina. Piruvato + HCO ATP biotina piruvato carbossilasi ossalacetato + ADP + Pi

42 L'ATP fosforila il bicarbonato. Il carbossifosfato formatosi trasferisce il gruppo carbossilico alla biotina formando carbossibiotina. Quest'ultima, dopo aver spostato il gruppo carbossilico ad un secondo sito attivo dell'enzima, lo trasferisce al piruvato trasformandolo in ossalacetato.

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44 Piruvato carbossilasi: REGOLAZIONE L'enzima è attivato dall acetilcoa, è completamente inattivo senza acetilcoa. L aumento di Acetil-CoA attiva la piruvato carbossilasi (REGOLAZIONE ALLOSTERICA), che rifornisce il ciclo di ossalacetato. La diminuzione della velocità del ciclo causata da una quantità insufficiente di ossalacetato o di altri intermedi provoca un aumento della concentrazione dell Acetil-CoA. Quando l Acetil-CoA è in eccesso, stimola la reazione della piruvato carbossilasi a produrre più ossalacetato, consentendo quindi al ciclo di utilizzare più acetil-coa nella reazione della citrato sintasi.

45 REAZIONI ANAPLEROTICHE PEP-carbossichinasi Questa reazione genera ossalacetato, ma il ruolo principale dell enzima PEPcarbossichinasi si esplica nella gluconeogenesi.

46 REAZIONI ANAPLEROTICHE Enzima malico o MalatoDH decarbossilante Citoplasmatico Reazione di carbossilazione riduttiva del piruvato a dare malato. il malato rientra nel mitocondrio e quindi nel ciclo di krebs E la maggior fonte di NADPH per le biosintesi riduttive (vedi biosintesi degli ac.grassi) insieme al ciclo dei pentosi

47 REAZIONI ANAPLEROTICHE Reazioni coinvolgenti aminoacidi, non sono classificate come reazioni anaplerotiche ma si comportano come tali! Le reazioni di transaminazione sono reazioni reversibili in grado di produrre intermedi del ciclo di Krebs (alfa-chetoglutarato e ossalacetato). In una transaminazione, un amminoacido trasferisce il proprio gruppo amminico ad un chetoacido subendo a propria volta la conversione in chetoacido. N.B: Per la sintesi di α chetoglutarato si può anche partire da glutammato come substrato della glutammato deidrogenasi.

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49 Regolazione del ciclo di Krebs La regolazione del ciclo di Krebs avviene: a livello dell entrata del carburante metabolico: acetil-coa (da carboidrati tramite PIR- DH, da lipidi tramite beta-ox, da aminoacidi) è modulato in modo da non consentirne un accumulo. Regolazione della PDH E 1 : piruvato deidrogenasi con coenzima legato, TPP (tiamina pirofosfato) E 2 : diidrolipoil transacetilasi con coenzima legato, l acido lipoico E 3 : diidrolipoil deidrogenasi

50 Regolazione del ciclo di Krebs Regolazione del complesso della piruvato deidrogenasi due tipi di controllo 1 - inibizione allosterica Il complesso è inattivato dai prodotti della reazione, acetil-coa e NADH ed è inattivato dall ATP (carica energetica alta). Il complesso PDH è attivato da AMP, ADP, NAD+ (carica energetica bassa). 2 - modificazione covalente (nei mammiferi) della componente E1 (piruvato deidrogenasi) dell enzima piruvato deidrogenasi. E1 esiste: in forma attiva (defosforilata), reazione catalizzata da una fosfatasi in forma inattiva (fosforilata), reazione catalizzata da una chinasi NB: chinasi e fosfatasi sono parte integrante del complesso. (Il Ca++ attiva la PDH fosfatasi) Il livello di ATP regola la PDH

51 Regolazione del ciclo di Krebs Regolazione della PDH Il complesso della piruvato deidrogenasi nei vertebrati è fortemente inibito da ATP, acetil-coa e NADH, ossia i prodotti della reazione catalizzata dal complesso. L inibizione della ossidazione del piruvato è più grande quando sono disponibili acidi grassi a lunga catena poichè l ossidazione degli acidi grassi produce una grande quantità di gruppi acetili legati al CoA. Di contro l AMP, il CoA libero e il NAD+, quando si accumulano per la assenza di gruppi acetili da immetere nel ciclo di Krebs, attivano la piruvato deidrogenasi. Cioè questo enzima viene spento quando il carburante metabolico (gruppi acetili) sono disponibili e quando il rapporto intracellulare ATP/ADP e NADH/NAD è alto, e nuovamente acceso quando la domanda di energia è alta ed è richiesta un entrata veloce di acetil-coa nel ciclo di Krebs.

52 REGOLAZIONE del ciclo di Krebs Disponibilità di ATP = potenziale energetico: un valore elevato del potenziale energetico rallenta il ciclo. Il potenziale energetico è rappresentato dai rapporti: NADH/ NAD +, ATP/ADP+AMP, acetil-coa/ CoA, succinil-coa/coa.

53 Regolazione del ciclo di Krebs 3 TAPPE IRREVERSIBILI Le tre reazioni chiave del ciclo sono quelle fortemente esoergoniche catalizzate dagli enzimi: citrato sintasi, è inattivata da citrato, NADH, succinil-coa, ATP isocitrato deidrogenasi è inattivata da NADH, ATP. alfa-chetoglutarato deidrogenasi è inattivata da NADH, succinil- CoA, ATP.

54 Regolazione del ciclo di Krebs 3 TAPPE IRREVERSIBILI In determinate condizioni questi passaggi possono divenire gli step che limitano la velocità dell intero processo. La citrato sintasi è inibita da ATP ed attivata da ADP: nei muscoli dei vertebrati un aumento di Ca++ (il segnale per la contrazione e la richiesta di energia sottoforma di ATP) attiva anche la isocitrato deidrogenasi e l achetoglutarato deidrogenasi oltre che il complesso PDH. In sintesi la concentrazione di alcuni intermedi e substrati regola finemente la velocità e il flusso del ciclo regolando finemente le concentrazioni cellulari necessari di ATP e NADH

55 Regolazione del ciclo di Krebs Altri siti chiave di regolazione allosterica sono le reazioni catalizzate da: isocitrato DH (attivata da ADP). alfa-chetoglutarato DH (inibita da succinil CoA, NADH).

56 Regolazione del flusso attraverso il ciclo dell acido citrico Regolatori fondamentali del ciclo: -Disponibilità dei substrati: ossalacetato e acetil-coa. -Disponibilità di NAD+, perché NAD+ è substrato per tre enzimi del ciclo oltre che per PDH.