1 Conexio Assign per TruSight HLA - Nozioni di base: Trascrizione della narrazione Benvenuti Obiettivi del corso Benvenuti al corso Conexio Assign per TruSight HLA. Il corso copre gli elementi essenziali del software Conexio Assign per l'analisi dei dati del sequenziamento di nuova generazione ottenuti dal pannello di sequenziamento TruSight HLA su un sequenziatore Illumina. Al termine di questo corso, sarete in grado di: Importare i file del sequenziamento nel software Assign. Navigare nell'interfaccia di Assign. Rivedere l'assegnazione delle coppie di alleli HLA, la qualità del sequenziamento e la profondità del sequenziamento per ciascun locus. Verificare visivamente i dati del sequenziamento ed eseguire modifiche di base. Generare un report. Panoramica del corso Importazione, allineamento e assegnazione degli alleli Layout di Conexio Assign Questo corso tratta 6 elementi, a partire dall'importazione dei file del sequenziamento, che avvia l'allineamento automatico delle letture della sequenza, l'identificazione delle basi e l'assegnazione degli alleli HLA Quindi imparerete le caratteristiche principali e il layout dell'interfaccia Assign. Nelle sezioni tre e quattro imparerete a rivedere velocemente l'assegnazione delle coppie di alleli HLA, la qualità del sequenziamento e la profondità del sequenziamento per ciascun locus. Nella quinta sezione, imparerete a verificare visivamente i dati del sequenziamento e ad eseguire modifiche di base. La sezione finale coprirà la generazione di un report. Dopo aver eseguito il login al software Assign, fate clic su Import and Analyze (Importa e analizza) dalla sezione Data (Dati) della barra multifunzioni Home (Inizio). Andate alla cartella contenente i file FASTQ generati dalla corsa di sequenziamento TruSight HLA e MiSeq. Selezionate tutti i campioni e loci che desiderate importare in questo progetto Assign. Assicuratevi di importare due file FASTQ per locus, uno per ciascuna lettura paired-end. Fate clic su OK. In questo modo verrà lanciata una serie di processi automatizzati a partire dall'allineamento di tutte le letture di sequenziamento. In pratica, una singola corsa MiSeq può produrre fino a 25 milioni di letture della sequenza. Una volta completato questo allineamento iniziale, le posizioni eterozigote delle basi sono sottoposte a determinazione delle fasi (phasing) tra di loro per generare due sequenze per ciascun locus. Le sequenze allineate e sottoposte a determinazione delle fasi (phasing) sono quindi confrontate con tutte le sequenze di riferimento contenute nel database IMGT per assegnare una coppia di alleli per ciascun locus. In base al numero di campioni, alla profondità di sequenziamento e al potere di elaborazione del computer, per completare questo processo sono necessarie dalle 3 alle 4 ore. Prima di analizzare nei dettagli i risultati della tipizzazione, diamo uno sguardo alle diverse sezioni e visualizzazioni disponibili nell'interfaccia Assign. Il pannello dei campioni è visibile su ciascuna schermata e mostra tutti i campioni caricati nel progetto in corso. I loci sequenziati per un campione possono essere visualizzati selezionando uno dei campioni. Il pannello dei campioni comprende inoltre la gerarchia di revisione. La colonna C è utilizzata per aggiungere commenti per gli altri revisori e al report. La colonna A mostra la verifica della conferma di tutte le posizioni delle basi. Le colonne 1 e 2 permettono al primo e al secondo revisore di confermare i risultati e la colonna R indica che le revisioni sono complete e che le tipizzazioni possono essere riportate in un report.
2 Riepilogo dei risultati della tipizzazione HLA In questo video, analizzeremo le visualizzazioni Summary (Riepilogo) e (Copertura). Le visualizzazioni Reads (Letture), Alignment (Allineamento) e Reference (Riferimento) sono affrontate nel video delle caratteristiche avanzate. Valutazione della qualità e della copertura della schermata (Copertura) Dopo aver importato, allineato e assegnato i file del sequenziamento, la prima schermata è la visualizzazione Summary (Riepilogo) che mostra gli alleli assegnati per ciascun locus sequenziato. Un'avvertenza gialla indica un'assegnazione omozigote. Un'avvertenza rossa indica che un locus presenta o qualità di sequenziamento bassa o profondità di sequenziamento bassa oppure entrambe. Due trattini indicano un'ambiguità della sequenza e una X indica un'ambiguità dell'espressione. Nelle successive due sezioni di questo corso, affronteremo come risolvere questi indicatori. Infine, un'assegnazione di alleli senza indicatore rappresenta un risultato privo di ambiguità. Facendo clic sulla freccia blu nella parte superiore destra della visualizzazione Summary (Riepilogo) si passa alla successiva visualizzazione di Summary (Riepilogo) con le percentuali delle basi che superano il punteggio qualitativo di Q30. Un punteggio qualitativo rappresenta una misura della probabilità che una base sia identificata in modo errato. Durante il sequenziamento Illumina, a ciascuna base in una lettura viene assegnato un punteggio qualitativo. Un punteggio qualitativo superiore indica una probabilità di errore inferiore. Ad esempio, un punteggio qualitativo pari a 30, o Q30, rappresenta una percentuale di errore pari a 1 su 1000 con un'accuratezza di identificazione corrispondente del 99,9%. In questo pannello riepilogativo della qualità viene visualizzata un'avvertenza di confidenza per un locus quando la percentuale delle identificazioni delle basi con punteggio Q30 è inferiore al 75%. Come potete vedere, le avvertenze rosse delle tipizzazioni del riepilogo non sono indotte dalla qualità del sequenziamento in quanto tutte le percentuali sono ben al di sopra della soglia del 75%. Facendo nuovamente clic sulla freccia blu, si passerà alla visualizzazione del riepilogo finale che mostra la profondità di sequenziamento media per ciascun locus. La profondità di copertura viene misurata dal numero medio di letture di sequenziamento relativo a ciascuna posizione delle basi in un locus. Mentre a volte è possibile generare una tipizzazione affidabile da un locus con scarsa copertura, l'avvertenza di profondità di sequenziamento si attiverà per i loci che presentano una profondità inferiore a 100X. Come potete vedere qui, l'avvertenza rossa è il risultato di una copertura di sequenziamento bassa. La copertura di sequenziamento bassa a un singolo locus è generalmente il risultato di una scarsa amplificazione o di una qualità bassa del DNA. La visualizzazione (Copertura) è usata per visualizzare le coppie di alleli che corrispondono più da vicino alla sequenza campione. Questa visualizzazione permette inoltre di visualizzare ciascuna singola base, le identificazioni delle basi e la profondità di sequenziamento per una data posizione. Per andare alla visualizzazione (Copertura), fate clic sulla tipizzazione che desiderate investigare o utilizzate il menu a discesa View () e selezionate (Copertura). Analizziamo ciascun componente della visualizzazione della copertura a partire dalla parte superiore dello schermo per scendere verso il basso. struttura e coordinate del gene Le prime due righe mostrano la copertura e la struttura del locus selezionato. La riga superiore mostra la copertura dell'amplicone per i diversi componenti strutturali mostrati nella seconda riga. Le regioni in bianco presentano una profondità di copertura elevata, le regioni in nero non presentano profondità di copertura e le regioni in rosso presentano una profondità di copertura bassa o indicano posizioni per la revisione manuale. Come potete vedere, l'amplicone
3 HLA-B inizia nell'esone 1 e si estende all'esone 7. Le regioni oltre questi esoni sono nere in quanto non sono coperte. Le regioni all'inizio e alla fine degli ampliconi presentano una profondità di copertura inferiore che è mostrata mediante questo gradiente dal rosso al bianco. Una sezione di nero entro l'amplicone indica di solito una delezione in un campione piuttosto che un problema con il sequenziamento. Le regioni entro l'amplicone evidenziate in rosso indicano le posizioni delle basi che possono richiedere ispezione manuale. Più avanti in questo video vedremo degli esempi. La riga successiva rappresenta una visualizzazione più granulare delle coordinate. Queste tre righe superiori possono essere utilizzate per andare alle posizioni all'interno del locus. Facendo clic su una regione nelle due righe superiori, la visualizzazione della copertura si sposta in quella posizione. La finestra nella riga delle coordinate può essere trascinata per regolare la posizione di interesse. Sequenze consenso La riga successiva rappresenta la sequenza consenso del locus. Ciascun locus presenta almeno una sequenza consenso. Le letture di sequenziamento sono allineate rispetto alle sequenze consenso. Le sequenze consenso utilizzano le designazioni delle basi degenerate IUPAC. Ad esempio, una T nella sequenza consenso del locus indica che solo una timina è stata riportata in questa posizione. In alternativa, una K indica che sia T che G sono state individuate in questa posizione. È possibile visualizzare un elenco completo delle designazioni IUPAC mediante il menu a discesa del navigatore. La sequenza consenso del locus è codificata a colori. Le regioni gialle rappresentano la sequenza codificante. Le regioni bianche rappresentano la sequenza non codificante e le regioni blu evidenziano la sequenza che non è presente in tutti gli alleli indotti da inserzioni e/o delezioni. Le due righe successive rappresentano le sequenze di riferimento IMGT/HLA per gli alleli uno e due nel pannello dei risultati. Una base viene visualizzata in questa riga quando la sequenza di alleli differisce dalla sequenza osservata per il campione o se la posizione è eterozigote. Gli asterischi o le posizioni vuote indicano che la sequenza di riferimento è mancante per l'allele selezionato. Un punto indica che la sequenza di alleli è identica alla sequenza osservata alla posizione selezionata. La riga successiva rappresenta la sequenza consenso del campione e mostra la sequenza generata dal sequenziatore Illumina a partire da una libreria TruSight HLA. La sequenza consenso del campione utilizza le stesse designazioni IUPAC utilizzate per la sequenza consenso del locus. La riga successiva rappresenta l'indicatore di confidenza. La confidenza di una identificazione delle basi in qualsiasi posizione data può variare in base a diversi fattori, compresi frequenza degli alleli, soglia del rumore, profondità di copertura e qualità della sequenza. Un indicatore di confidenza bianco denota una identificazione delle basi con elevata confidenza. Un indicatore di confidenza rosso acceso denota identificazioni delle basi nelle quali la copertura della sequenza a Q30 è sotto 100x, il punteggio qualitativo medio è basso, una base sopra la soglia del rumore non è identificata nel consenso del campione e/o una base sotto la soglia del rumore è identificata nel consenso del campione. Le frecce di navigazione possono essere utilizzate per spostarsi velocemente tra
4 queste posizioni evidenziate. Le due righe successive rappresentano le tracce della determinazione delle fasi (phasing). Per le posizioni eterozigote, queste righe mostrano a quale allele è stata assegnata una base. Identificazione delle basi La parte restante di questa area centrale della visualizzazione (Copertura) fornisce informazioni dettagliate sulle identificazioni delle basi e sulla profondità del sequenziamento. In questa sezione, i nucleotidi identificati sono evidenziati in quattro colori. A è verde, C è blu, G è nero e T è rosso. La riga superiore indica l'identificazione delle basi che si verifica più di frequente per quella posizione. Le identificazioni delle basi secondarie sono visualizzate sotto e la loro frequenza è mostrata mediante la scala logaritmica sulla sinistra. Da zero a uno percento, da uno percento a dieci percento e da dieci percento a cento percento. Alle posizioni omozigote, o non era presente alcuna identificazione delle basi secondarie o l'identificazione delle basi secondarie è considerata rumore e non è stata identificata. Per una posizione eterozigote, l'identificazione delle basi secondarie sarà presente alla o accanto alla frequenza mostrata dalla linea rosa alla posizione selezionata. Il rumore è un comune sottoprodotto di fedeltà dell'amplificazione, specificità e allineamento della sequenza. L'assegnazione dinamica imposta una soglia per il rumore a ciascuna posizione delle basi. La soglia del rumore approssimativa è indicata da questa linea rosa tratteggiata. Di solito, le identificazioni delle basi al di sotto della soglia del rumore non vengono identificate. Le barre grigie sono utilizzate per mostrare la profondità di copertura per ciascuna posizione delle basi. Queste utilizzano la scala logaritmica mostrata sulla sinistra tra parentesi. Da 0 a 10x, da 10x a 100x e da 100x a 1000x. In questo modo a questa posizione delle basi, la profondità di copertura supera 300x con una leggera variabilità da base a base. Risultati della tipizzazione HLA e mancate corrispondenze di riferimento La sezione finale di questa visualizzazione mostra le letture delle sequenze che contengono le identificazioni che non sono incluse nella sequenza consenso del campione. Sotto la sequenza si trova un indicatore di qualità di colore rosso accesso che denota la qualità più bassa e uno di colore rosa chiaro che denota la qualità più elevata. La sezione sulla destra della visualizzazione (Copertura) è il pannello dei risultati. Questo pannello mostra tutte le coppie di alleli IMGT/HLA che corrispondono esattamente o corrispondono più da vicino alla sequenza consenso del campione. La riga superiore indica la coppia di alleli che meglio corrisponde alla sequenza consenso del campione. Le coppie di alleli sotto questa coppia sono le successive migliori in ordine di corrispondenza. Oltre all'assegnazione degli alleli, queste colonne presentano due informazioni importanti. Gli alleli in grassetto evidenziano CWD o alleli comuni ben documentati. La codifica a colori in queste caselle indica la copertura della sequenza di riferimento. La casella contenente la nomenclatura è direttamente proporzionale al locus. Il grigio evidenzia le regioni che presentano la sequenza di riferimento e l'arancione evidenzia le regioni che non presentano la sequenza di riferimento. Ad esempio, questo allele è completamente sequenziato nel database IMGT e questo allele presenta il riferimento solo per la sequenza dell'esone 2 e 3. Fate attenzione che, in questi casi, non visualizziamo la sequenza introne mancante e che questi dettagli possono essere visualizzati
5 utilizzando le righe delle sequenze di riferimento. A destra delle coppie di alleli si trovano le colonne delle mancate corrispondenze. Sono disponibili cinque colonne per le possibili mancate corrispondenze. La prima colonna, etichettata Core (Principale), evidenzia le mancate corrispondenze negli esoni principali e le varianti dell'espressione CWD. Gli esoni principali sono gli esoni 2, 3 e 4 di Classe I e gli esoni 2 e 3 di Classe II. La seconda colonna, etichettata Exons (Esoni), mostra le mancate corrispondenze nella rimanente sequenza codificante del locus. La terza colonna, denominata NC (Non codificante), mostra le mancate corrispondenze nella rimanente sequenza non codificante dell'amplicone. Le ultime due colonne mostrano le mancate corrispondenze relative alla determinazione delle fasi (phasing). Per impostazione predefinita, le prime due colonne della mancata corrispondenza e le colonne della mancata corrispondenza della determinazione delle fasi (phasing) sono sempre presenti. È sufficiente fare clic sull'intestazione della colonna Exons (Esoni) per visualizzare la colonna NC (Non codificante). È possibile modificare i campi di risoluzione visualizzati mediante il menu a discesa. Le opzioni sono: due campi, tre campi e tutti i campi disponibili. Generazione di un report L'ultima porzione del pannello dei risultati è la colonna Differences (Differenze). Questa colonna indica la posizione delle basi che portano le differenze rispetto alla coppia con la corrispondenza più vicina. In questo esempio, la differenza tra la coppia di alleli superiore e la successiva si trova nell'esone 2. Nella sezione finale di questo tutorial, imparerete come generare un report dei risultati. I report possono essere generati in formato XML, Excel, testo e FASTA. Per questa dimostrazione utilizzeremo il formato Excel. Il report più semplice è il report di riepilogo che ricrea la visualizzazione Summary (Riepilogo) in formato Excel. Per generare questo rapporto, selezionate il pulsante di scelta Summary (Riepilogo) e fate clic su Report (Report). Come potete vedere, abbiamo generato un report nel quale ciascuna pagina del riepilogo viene riportata in una scheda separata di Excel. È disponibile anche un report di genotipizzazione più dettagliato. Questo report può essere filtrato per campione o per locus. Il report completo comprende cinque sezioni possibili. La sezione Summary (Riepilogo) riporta le coppie di alleli dal pannello dei risultati e può essere modificata per ridurre il numero di campi da riportare, le opzioni del riepilogo e i limiti di mancata corrispondenza. Per la maggior parte delle applicazioni, riporteremo tre campi, l'elenco completo degli alleli e solo la coppia di alleli con la corrispondenza migliore. Altre opzioni per il report completo comprendono la sezione di auditing che mostra le date, gli orari e gli utenti che hanno superato o non superato i risultati. L'opzione di sequenza stampa la sequenza consenso del campione come è stata modificata. L'elenco delle modifiche mostra le posizioni modificate, le modifiche eseguite e l'utente che ha eseguito la modifica. L'elenco delle mancate corrispondenze mostra qualsiasi mancata corrispondenza rispetto alla coppia di alleli riportata. Dopo aver impostato le opzioni, fate clic su Report (Report) per generare il report. Il report completato si aprirà automaticamente in Excel.
6 Conclusioni Anteprima tutorial avanzato Questo completa il tutorial delle caratteristiche di base di Conexio Assign per TruSight HLA. In questo tutorial abbiamo affrontato l'importazione, l'allineamento, l'identificazione delle basi, l'interfaccia utente, le visualizzazioni di riepilogo, la visualizzazione delle coperture e la generazione di report. Nel successivo video tutorial ci concentreremo su caratteristiche e applicazioni più avanzate di Conexio Assign per TruSight HLA che comprende un'analisi attenta delle rimanenti visualizzazioni, letture, allineamenti e riferimenti. La visualizzazione delle letture fornisce una panoramica su ciascuna singola lettura che copre una posizione delle basi. La visualizzazione degli allineamenti fornisce un confronto della sequenza consenso del campione con ciascuna coppia di alleli elencata nei risultati. La visualizzazione dei riferimenti fornisce una panoramica completa del database IMGT/HLA e dei riferimenti utilizzati per ottenere i risultati. Oltre a una panoramica dettagliata di queste caratteristiche, il tutorial avanzato affronterà anche le applicazioni specifiche comprese ambiguità, alleli di espressione, alleli nuovi e alleli terzi.