WP1 test in vitro e in vivo di nuovi veicolanti del Boro su modelli animali di tumori toracici

NeTTuNO Status Report al 31 12 2014 OBIETTIVI DI NETTUNO Gli obiettivi principali di NETTUNO sono 3 affidati ad altrettanto WP: 1. WP1 test in vitro e in vivo di nuovi veicolanti del Boro su modelli animali di tumori toracici; 2. WP2 misura del boro mediante PET in pazienti trattati con F 18 BPA (Borofenilalanina con F 18); 3. WP3 progetto di un fascio di neutroni per l irraggiamento di pazienti. ATTIVITÀ SVOLTE Nel corso del 2014 sono state svolte le seguenti attività: WP1 test in vitro e in vivo di nuovi veicolanti del Boro su modelli animali di tumori toracici - WP1 1 Irraggiamento di topi sani e con metastasi polmonari trattati con un nuovi veicolanti del boro. Dopo aver completato gli esperimenti in vitro sono state effettuate misure di efficacia della BNCT in vivo e i risultati sono riportati nella pubblicazione uscita nel mese di gennaio 2015 D. Alberti et al. A theranostic approach based on the use of a dual boron/gd agent to improve the efficacy of Boron Neutron Capture Therapy in the lung cancer treatment Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 11 (2015) 741 750. Il veicolante nuovo utilizzato è quello messo a punto dal gruppo di Torino e da noi già testato in vitro: il composto a base di Boro e Gadolinio (AT101) con LDL come veicolante. L efficacia è stata testata su due modelli animali: i topi transgenici EML4 ALK e i topi BALB/c; i primi sviluppano spontaneamente metastasi polmonari (a causa della loro trasgenicità); negli altri il tumore è stato indotto iniettando cellule coltivate di carcinoma mammario (TUBO). Nel primo caso sono stati irraggiati al Lena 10 topi (5

trattati con AT101 prima dell irraggiamento e 5 di controllo); nel secondo caso sono stati utilizzati 40 animali a cui, 3 settimane prima del trattamento BNCT erano state iniettate per via endovenosa 50000 cellule TUBO che hanno indotto varie metastasi polmonari ben visualizzate attraverso l MRI animale. La concentrazione di B 10 nel tumore e nei tessuti sani è stata determinata sempre con MRI (grazie alla presenza del Gd nel composto) ed è risultata pari a 43 ± 10 ppm nel tumore e 16 ± 5 boron ppm nei tessuti circostanti. Due gruppi di animali (n = 15 per ciascun gruppo) sono stati sottoposti ad irraggiamento neutronico; il primo gruppo prima dell irraggiamento è stato trattato con AT101/LDL (0.1 mmol/kg di Gd corrispondente a 10 mg/kg di Boro; il secondo gruppo è stato irraggiato senza composto borato per determinare l effetto indotto dal solo irraggiamento neutronico; un terzo gruppo (n = 10) none stato irraggiato ed è stato usato come gruppo di controllo per verificare la crescita del tumore in assenza di trattamenti. I topi EML4 ALK sono stati seguiti per oltre 40 giorni mentre i topi BALB/c sono stati seguiti per circa 30 giorni sottoponendoli periodicamente a controllo MRI per verificare la crescita delle metastasi. In entrambi i casi, la crescita del tumore negli animali trattati con BNCT è risultata fortemente rallentata rispetto sia ai controlli irraggiati ma non trattati con boro, sia a quelli non irraggiati i cui polmoni risultavano completamente invasi dal tumore (Figg. 1 e 2). Fig. 1 (A) Imagine coronale pesata T2 di un esmplare rappresentativo di topo EML4 ALK di 6 settimane. I tumori disseminati in entrambi i polmoni sono stati evidenziati da frecce. (B) L incremento di volumen tumorale è misurato tramite MRI sia su topi irraggiati ma senza previo trattamento con boro (cerchi) sia sui topi irraggiati dopo trattamento con AT101/LDL (quadrati). Le barre d errore sono la DS.

Fig.2 Valutazione della crescita tumorale dopo irraggiamento neutronico: immagini RARE pesate T2. Polmoni non trattati con AT101/LDL e rraggiati (A e B) e polmoni trattati con AT101/LDL e rraggiati (C e D). A e C sono state acquisite a tempo 0 mentre B e D sono state acquisite dopo 25 giorni. Le frecce indicano i tumori. E) rappresenta la crescita tumorale misurata con MRI su topi non trattati (triangoli vuoti), topi irraggiati ma senza trattamento con boro (quadrati) e topi che hanno ricevuto l intero trattamento BNCT con AT101/LDL (cerchi). Le barre di errore indicano la DS.

- WP1 2 irraggiamento di ratti sani e con metastasi polmonari trattati BPA E proseguita l attività per valutare l efficacia del trattamento di metastasi polmonari mediante BNCT. Questa è stata prevalentemente incentrata sull analisi istologica di sezioni di tessuto prelevato da ratti sani e portatori di neoplasia sottoposti ad irraggiamento neutronico sia in assenza di pretrattamento con boro, che 4 h dopo la somministrazione di BPA (300 mg/kg). L irraggiamento è stato effettuato per tempi di 5, 10 e 15 a 250 kw. I ratti portatori di neoplasia sono stati osservati e sacrificati in un range di tempo post irraggiamento compreso fra 2 e 35 giorni. In assenza di pretrattamento con BPA, le analisi istologiche non hanno evidenziato differenze rispetto ai campioni neoplastici non irraggiati. Fig. 3 Polmone sano, analisi a 2 e 8 giorni dopo l irraggiamento con BPA (300 mg/kg, irraggiamento dopo 4 h, circa 5 ppm di boro 10 nel tessuto): non si evidenziano danni. Fluenza ricevuta: circa 10 13 n/cm 2, dose:7 Gy Eq. Al contrario in presenza di BPA, già con 5 di irraggiamento, il danno cellulare è riscontrabile a partire da 5 giorni post irraggiamento. Si osservano (Fig. 4 centro) inequivocabili segni di danno da irraggiamento: progressivo incremento delle dimensioni cellulari, presenza di cellule giganti multinucleate, micronuclei, apoptosi; inoltre si evidenziano (Fig. 4 destra) zone a bassa densità cellulare. Il danno è più marcato e sono più estese le aree di necrosi a livello dei noduli, in caso di tempi di irraggiamento più prolungati.

Fig. 4 Analisi istologica di polmoni con metastasi a 8 giorni (sinistra), 12 giorni (centro) e 15 giorni (destra), irraggiati con una fluenza di circa 1.5 10 14 n/cm 2, dopo trattamento con BPA a 300 mg/kg. La concentrazione del boro 10 nel tumore era di 17.5 ppm e la dose di 9 Gy Eq. Questi risultati indicano che la BNCT ha un effetto sul tumore, ma anche che è necessaria una escalation di dose per eradicare le metastasi, che in questi esperimenti hanno ricevuto dosi inferiori a 10 Gy Eq. - WP1 3 Modello animale di mesotelioma In collaborazione col Reparto di Pneumologia del Policlinico S. Matteo e l Istituto per la Ricerca e la Cura del Cancro (IRCC) di Torino stiamo cercando di mettere a punto un modello animale di mesotelioma umano. Per produrre questo modello si intende partire da cellule di mesotelioma umano contenute nel liquido estratto durante la toracentesi effettuata su pazienti presso il Policlinico S. Matteo di Pavia; per questo sono già attivi e approvati dai Comitati Etici del S. Matteo e dell IRCC i necessari protocolli. Le cellule neoplastiche estratte dal liquido della toracentesi possono essere coltivate e poi iniettati nei topi per indurre lo sviluppo del mesotelioma umano. Una volta ottenuto il modello animale i topi verranno trattati con BPA e con la nuova formulazione sviluppata a Torino (AT101/LDL) per poi essere irraggiati a Pavia presso il Lena. Lo sviluppo del tumore sia prima che dopo il trattamento BNCT verrà seguito a Torino mediante MRI, come già fatto negli esperimenti delle metastasi polmonari. Questa parte della sperimentazione ha subito un rallentamento a causa di alcune difficoltà tecniche legate alla delicatezza della procedura di estrazione delle cellule dal liquido di toracentesi; sono ancora in corso ulteriori tentativi; tuttavia per evitare di rimanere bloccati su questo punto, abbiamo acquistato una linea di cellule di mesotelioma umano con le quali potremo procedere più speditamente. WP2 la misura del boro mediante PET in pazienti trattati con F 18 BPA (Borophenilalanina con F 18) Su questo fronte, purtroppo, perdurano le difficoltà legate all ottenimento dell autorizzazione da parte dell AIFA ad usare la 18 FBPA sui pazienti; questa mancata autorizzazione sta ostacolando anche la realizzazione di un progetto finanziato dal Ministero della Salute; un sollecito è stato inviato alla ditta ACOM che dovrebbe produrre la 18 FBPA dopo aver ottenuto l autorizzazione dall AIFA. Speriamo che tale situazione possa sbloccarsi nel corso del 2015. WP3 progetto di un fascio di neutroni per l irraggiamento di pazienti In vista della possibile installazione di una sorgente di neutroni per BNCT prodotti mediante un acceleratore di protoni, presso il CNAO, il gruppo sta dedicando parte delle risorse alla progettazione di un fascio di neutroni adeguato. L acceleratore, basato su un quadrupolo a radiofrequenza (RFQ), 5 MeV e 30 ma, è stato realizzato nei Laboratori Nazionali di Legnaro (LNL) e sta per essere completato con di fondi premiali del progetto MUNES.

La produzione dei neutroni è basata sulla reazione 9 Be(p,n) 9 B. Utilizzando il codice di simulazione MCNP6 è stata ottimizzata la sorgente neutronica uscente dal target di Be che era già stata implementata dai ricercatori di Legnaro; in particolare è stata migliorata la distribuzione angolare dei neutroni emessi ed è stata implementa l estrazioni anche ad angoli superiori a 120 fino a 180. La nuova sorgente è stata validata utilizzando i dati sperimentali disponibili e l'accordo è risultato buono (Figg.6 e 7). Con questa sorgente si sta ora cominciando a simulare il cosiddetto Beam Shaping Assembly (BSA) che modera e collima i neutroni in modo da ottenere un fascio adatto per il trattamento BNCT dei pazienti. Questo lavoro sarà completato nel corso del 2015. Fig.6. Esempi di spettro energetico dei neutroni a due angoli (0 a sinistra e 120 a destra): confronto fra dati sperimentali (punti blu) e dati simulati (punti rossi). Fig.7 1 Spettri simulati con MCNP6 a vari angoli, compresi quelli superiori a 120

E stato recentemente pubblicato il lavoro: Exploring Boron Neutron Capture Therapy for non small cell lung cancer (Farias et al., Phys Med., 30(8), 2014, 888 897) in seguito alla ricerca svolta con gli argentini (vedi capitolo collaborazioni ) in cui ci si prefiggeva di studiare le caratteristiche di un fascio neutronico per l irraggiamento di tumori toracici. TAC di pazienti con tumori polmonari di diverso tipo sono state convertite in modelli computazionali e si è proceduto a simulare irraggiamenti con fasci ideali di diverse energie e con diverse configurazioni (variando numero di fasci e direzione di incidenza). E risultato che, contrariamente a quanto pubblicato in letteratura per altri tipi di tumore, in questo caso l energia ideale che il fasci deve avere è introno a 1 kev (normalmente si usano invece fasci di energia intorno a 10 kev). Ottimizzando il set up di irraggiamento e utilizzando fasci di questa energia, con rapporti di concentrazione di boro tra tumore e tessuti sani confrontabili con le sogli di inclusione di pazienti in protocolli attualmente attivi, si è dimostrato che è possibile mantenere la dose assorbita dagli organi a rischio (in particolare, pelle) sotto la dose di tolleranza ottenendo un risultato dosimetrico nel tumore potenzialmente terapeutico. Dai fasci ideali si è passati anche a due fasci realistici, uno da reattore e uno da acceleratore per valutare la loro performance sugli stessi tumori (Fig. 8). Fig.8 Dose Volume Histograms per il tumore (T) e il polmone sano (HL) utilizzando un fascio ideale da 1 kev e due fasci con distribuzione energetica realistica, uno da reattore (MIT SPECT) e uno da acceleratore (MEC CNEA). Questo risultato ci dà il punto di partenza per sapere come dev essere conformato il fascio neutronico da acceleratore RFQ, attraverso il design del Beam Shaping Assembly. COLLABORAZIONE CON CNEA ARGENTINA La collaborazione che portiamo avanti da diversi anni con il gruppo Argentino di BNCT ha visto anche nel 2014 un assiduo scambio di ricercatori e una serie di attività condivise. Come già sottolineato nel paragrafo relativo al WP3, è stato pubblicato un lavoro computazionale relativo al treatment planning per la BNCT dei tumori polmonari con fasci di neutroni esterni. Questo lavoro riassume una serie di simulazioni fatte con un nuovo Treatment Planning System (MultiCell)

sviluppato alla CNEA e tre casi di tumori polmonari di pazienti veri. E stato dimostrato che con fasci di neutroni epitermici di energia intorno a 1 kev è possibile ottenere alti valori di TCP (Tumour Control Probability) sia nel cso di tumore localizzato (profondo oppure vicino alla parete toracica) sia nel caso di metastasi diffuse. Questo risultato è particolarmente incoraggiante considerando che il rapporto di concentrazione del boro tra tumore e tessuti sani è stato ipotizzato uguale alle soglie di accettazione per i pazienti dei clinical trials (2.5 3), dimostrando così la fattibilità della BNCT per tumori polmonari con fasci di questo tipo. Sempre nel campo della dosimetria computazionale è attiva una linea di ricerca che punta ad applicare un nuovo modo di calcolare la dose del campo misto della BNCT, utilizzando il formalismo della isoeffective dose pubblicato da due autori del gruppo argentino su Rad Res nel 2012. Questo approccio supera l utilizzo di RBE fisso per passare a una valutazione della dose da campo misto più consistente con quanto osservato nella clinica, basandosi sul concetto di TCP per confrontare dose da BNCT e dose da radioterapia con fotoni. Il goal è quello di applicare questa nuova tecnica alla ricerca che si sta svolgendo a Pavia sia in ambito polmone che in ambito osteosarcoma. Per poter generare i risultati della dosimetria è necessario avere a disposizione curve di sopravvivenza cellulare in funzione della dose assorbita, e a tal fine abbiamo terminato a Pavia gli esperimenti con le linee cellulari di metastasi polmonari e di osteosarcoma irraggiate con gamma, neutroni e con neutroni in presenza di boro. Questo esperimento ha generato l interesse del gruppo Finlandese di BNCT, che ha intenzione di rifare la dosimetria sui pazienti trattati con BNCT per head and neck; stiamo preparando in queste settimane le cellule provenienti da tre pazienti finlandesi per lo studio dose sopravvivenza. Con il gruppo argentino della CNEA è attiva anche una linea di ricerca riguardante la BNCT del polmone ex situ, cioè espiantato e irraggiato nella colonna termica del reattore RA3 di Buenos Aires con una tecnica analoga a quella messa a punto a Pavia con il progetto TAOrMINA. In questa fase in Argentina si sta portando a termine un lavoro eccezionalmente delicato in quanto utilizza un animale grande (la pecora) per studi di assorbimento del boro e adio tossicità nel polmone sano. I risultati della misura del boro, della messa a punto della tecnica chirurgica di autotrapianto, e di treatment planning per organo espiantato sono riportati nell articolo pubblicato quest anno. Parallelamente si studia la distribuzione del boro e l effetto dell irraggiamento sul tumore utilizzando un modello di ratto fornito dal gruppo di Pavia agli argentini. E stato terminato recentemente un lavoro di inter comparison di techniche di misura che ha visto il confronto di spettrometria alfa e autoradiografia neutronica con CR 39 (a Pavia) e autoradiografia neutronica con Lexan (in Argentina) su tessuti biologici e liquidi borati, utilizzando composti borati in diverse formulazioni molecolari. I risultati sono stati presentati al congresso internazionale di BNCT in finlandia e un paper è stato recentemente inviato a una rivista. Per portare avanti questi lavori, un dottorando (supervisione congiunta italo argentina) e una ricercatrice argentina sono venuti a Pavia a lavorare per un mese presso il nostro laboratorio e una ricercatrice di Pavia (S.B.) si è recata alla CNEA per due volte nel corso del 2014.

COLLABORAZIONE CON UNIVERSITA DI PALERMO In collaborazione con l Università di Palermo (associata alla sezione INFN di Catania) è stata effettuata una campagna di misura della dose gamma all interno della Colonna Termica del Reattore di Pavia, nelle posizioni in cui vengono irraggiate le cellule e gli animali. Sono stati utilizzati dosimetri all alanina calibrati e letti dai ricercatori di Palermo (gruppo di M. Marrale). Con tali dosimetri e col supporto della simulazione effettuata con MCNP è stato possibile separare la dose gamma da quella neutronica; le misure hanno confermato i valori ottenuti prima dell irraggiamento del fegato dei pazienti effettuati col metodo TAORMINA agli inizi degli anni 2000. Pavia 18 marzo 2015 Il Responsabile Nazionale Saverio Altieri