SAGGIO DI LEGAME AI RIBOSOMI: SE L AMMINOACIL-tRNA RICONOSCE LA TRIPLETTA, VI SI LEGA E NON RIESCE A PASSARE IL FILTRO CHE, COSì, DIVIENE RADIOATTIVO.

TRADUZIONE

LA TRADUZIONE E QUEL PROCESSO ATTRAVERSO CUI SI PASSA DAL LINGUAGGIO RIBONUCLEOTIDICO DELL RNA A QUELLO AMINOACIDICO DELLE PROTEINE. IL CODICE GENETICO E L INSIEME DI CODONI (TRIPLETTE NUCLEOTIDICHE) A CUI CORRISPONDONO I VARI AMINOACIDI PIU I CODONI DI TERMINE (CODONI NON SENSO). SUE PROPRIETA FONDAMENTALI SONO: i) CONTINUITA (Eccezione di alcuni fagi es.: fx174- in cui il codice è embricato); ii) DEGENERAZIONE; iii) UNIVERSALITA (Ad eccezione di alcuni codoni mitocondriali cha hanno un significato diverso rispetto agli mrna citoplasmatici)

ESPERIMENTO DI BRENNER E CRICK: L UNITA ELEMENTARE CODIFICANTE E UNA TRIPLETTA! ABC ABC ABC ABC ABC i) 1 delezione (B della 1 tripletta) ACA BCA BCA BCA BC ii) 2 delezione (C della 2 tripletta) ACA BAB CAB CAB C iii) 3 delezione (A della 4 tripletta) ACA BAB CBC ABC DOPO LA TERZA MUTAZIONE (DELEZIONE IN QUESTO CASO) RIAPPARE LA TRIPLETTA ABC, SI RIPRISTINA LA CORRETTA CORNICE DI LETTURA

ESPERIMENTI DI NIREMBERG, LEDER E KHORANA: LA DECIFRA= ZIONE DEL CODICE SAGGIO DI LEGAME AI RIBOSOMI: SE L AMMINOACIL-tRNA RICONOSCE LA TRIPLETTA, VI SI LEGA E NON RIESCE A PASSARE IL FILTRO CHE, COSì, DIVIENE RADIOATTIVO.

IL CODICE GENETICO (Khorana; Ochoa; Niremberg; Matthaei; Leder) I CODONI 5 -UGA-3 E 5 -UAG-3 OLTRE AD ESSERE NON SENSO, POSSONO CODIFICARE PER SELENOCISTEINA E PIRROLISINA, RISPETTIVAMENTE. 61 CODONI CODIFICANTI PER 20 aa. 3 SEGNALI DI STOP

I RIBOSOMI I Ribosomi hanno un diametro di circa 15-30 nm (Procarioti ed Eucarioti, rispettivamente), sono costituiti da proteine ed rrna. Sia nei Procarioti che negli Eucarioti, sono costituiti da una subunità maggiore e da una subunità minore.

PROCARIOTI SUBUNITA MAGGIORE = 50S (rrna 23S e 5S + 34 proteine) SUBUNITA MINORE = 30S (rrna 16S + 21 proteine) EUCARIOTI SUBUNITA MAGGIORE = 60S (rrna 28S, 5.8S e 5S + 45 proteine) SUBUNITA MINORE = 40S (rrna 18S + 33 proteine) 70S 80S

I RIBOSOMI EUCARIOTICI POSSONO ARRIVARE AD ESSERE CENTINAIA DI MIGLIAIA IN UNA CELLULA IN ATTIVA SINTESI PROTEICA. SI POSSONO TROVARE: 1) LIBERI NEL CITOPLASMA (SINTETIZZANO PROTEINE CHE RIMARRANNO ALL INTERNO DEL CITOSOL); 2) ADERENTI ALLE MEMBRANE DEL RER (RETICOLO ENDOPLA= SMATICO RUVIDO) O DEL NUCLEO (SINTETIZZANO PROTEINE CHE VERRANNO SECRETE DALLA CELLULA O CHE RIMARRANNO RACCHIUSE IN VESCICOLE ALL INTERNO DEL CITOPLASMA CELLULARE)

MATURAZIONE DEGLI rrna EUCARIOTICI

trna Assumono una conformazione secondo il modello a trifoglio Le differenze nelle sequenze nucleotidiche determinano la capacità di legare un amminoacido specifico L ansa II contiene la sequenza di 3 nucleotidi detta ANTICODONE che si appaia, durante la traduzione al codone dell mrna Questo appaiamento è fondamentale per l inserimento dell amminoacido corretto,come specificato dall m-rna, nella catena polipeptidica in crescita.

STRUTTURA DELL mrna MATURO 5 Cap 7mGppp 5 untranslated region initiation AUG translated region 3 untranslated region UGA termination polyadenylation signal AAUAAA (A) ~200 poly(a) tail 3

NOTA: DISPOSIZIONE ANTIPARALLELA TRA CODONE DELL mrna ED ANTICODONE DEL trna

Attivazione dell aminoacido (Fase ATP-dipendente) ATP + Aminoacido = Aminoacido adenilato + 2P Aminoacido adenilato + trna = AminoaciltRNA + AMP Azione dell aminoacil- trna -sintetasi Anidride acida (legame ad alta energia acil-fosfato) Aminoacil-tRNA

TRADUZIONE NEI PROCARIOTI

Fase GTP-dipendente Inizio Sequenza di Shine- Dalgarno: facilita il riconoscimento dell mrna da parte della subunità minore del Ribosoma. In particolare la sequenza consenso 5 -AGGAGGU-3 dell mrna (che si trova in prossimità della tripletta di inizio AUG) complementarizza con la sequenza 3 -UCCUCCA-5 dell rrna 16S (subunità minore del ribosoma)!

Fase GTP-dipendente Inizio IF1 ED IF3 HANNO IL COMPITO DI STABILIZZARE LA SUBUNITA MINORE DEL RIBOSOMA CHE, COSì TENDERà A NON LEGARSI CON LA SUBUNITà MAGGIORE. IF2, GRAZIE ALL IDROLISI DI GTP, PORTA IL PRIMO aa. (f-met) SPECIFICATO DA AUG.

fmet: il primo aa. ad essere incorporato nella catena aa. nascente

Fase GTP-dipendente Inizio Assemblaggio del Ribosoma

Fase GTP-dipendente Inizio (Assemblaggio del Ribosoma) SITO P (PEPTIDICO) = Vi si trova legato il f-met-trnatrna SITO A (AMINOACIDICO) = Accoglie l aa. Successivo che si legherà ad f-met SITO E (USCITA)

Fase GTP-dipendente Inizio Ricapitolando 1. Il trna iniziatore portante la formil-metioninametionina si lega alla subunità minore del ribosoma assieme a dei fattori d inizio (IF1, IF2 ed IF3). 2. Si lega l mrna, la subunità minore del ribosoma scorre sull mrna fino a quando non incontra il codone d inizio AUG. 3. Si instaura il legame tra l AUG e l anticodone del trna iniziatore. 4. Si associa la subunità maggiore. 5. Il trna iniziatore occupa il sito P, al sito A è presente il secondo codone dell mrna

Fase GTP-dipendente Procarioti: 20 aa al secondo Eucarioti: 2 aa al secondo Allungamento ALLUNGAMENTO MEDIATO DAI FATTORI EF-Ts-TuTu ed EFG. Tu SI DISSOCIA DA Ts E, UTILIZZANDO GTP, PORTA L AMINOACIL AMINOACIL-tRNA SUL MESSAGGERO. DOPO AVER LIBERATO L AA. Tu SI RICONGIUNGE A Ts IL CICLO RIPRENDE PER LA TRIPLETTA SUCCESSIVA.

Fase GTP-dipendente Allungamento Formazione del legame peptidico mediante reazione di transpeptidazione. NOTA: Il legame Si forma sfruttando l energia contenuta nel legame estere tra trna ed aa. (formatosi durante l attivazione dell aa.)!!!

Formazione del legame peptidico L attività catalitica peptidiltransferasica è contenuta nella subunità maggiore del ribosoma (rrna 23S)

Fase GTP-dipendente Allungamento Al sito A si lega il trna acilato (portante il secondo aminoacido della catena polipeptidica). Si forma il legame peptidico tra l estremità COOH terminale della Metionina e l estremità NH2 terminale del secondo aminoacido ad opera dell attività enzimatica della subunità maggiore del ribosoma. L energia necessaria è data dall attivazione aminoacidica.

TRASLOCAZIONE Il trna scarico che occupava il sito P occuperà il sito E il trna portante il dipeptide che occupava il sito A occuperà il sito P al sito A sarà presente il terzo codone dell mrna pronto ad ospitare un nuovo trna acilato

Fase GTP-dipendente Terminazione La presenza di più segnali di STOP stimola la comparsa di fattori di rilascio RF1, RF2 ed RF3. Quando al sito A sarà presente uno dei 3 segnali di arresto (UAA, UGA, UAG), si legheranno dei fattori di terminazione e la sintesi sarà bloccata

I fattori di rilascio si legano a qualunque ribosoma col segnale di stop nel sito A, forzando la peptidil transferasi a ad aggiungere una molecola di acqua invece di un aminoacido al peptidil trna. Questo libera l estremità carbossilica della catena polipepptidica. Vi sono due classi di fattori di rilascio. I fattori di classe I riconoscono i segnali di stop e innescano l idrolisi della catena polipeptidica. I fattori di classe II (regolati da GTP) stimolano la dissociazione dei fattori di classe I dal ribosoma. I fattori di rilascio di classe I simulano un trna dal punto di vista strutturale possedendo un peptide anticodone (SPF) che riconosce il segnale di stop ed un motivo GGQ, vicino al sito peptidiltransferasico che stimola l idrolisi del peptide. Il fattore RRF favorisce il disassemblaggio delle due subunità ribosomali!

I ribosomi scorrono numerosi l uno dietro l altro, sull mrna formando i POLISOMI, al fine di sfruttare numerose volte la stessa molecola di mrna che ha una emivita di poche ore!

Traduzione - Inizio fmet Large subunit 5 E Small mrna subunit P A UAC GAG...CU-AUG--UUC--CUU--AGU--GGU--AGA--GCU--GUA--UGA-AT GCA...TAAAAAA 3

Traduzione - Allungamento Met Polypeptide Phe Leu Ser Gly Arg Aminoacyl trna Ribosome E P A 5 CCA GAG...CU-AUG--UUC--CUU--AGU--GGU--AGA--GCU--GUA--UGA-AT GCA...TAAAAAA mrna 3

Traduzione - Allungamento Met Polypeptide Phe Leu Ser Gly Arg Aminoacyl trna 5 P A Ribosome E CCA UCU GAG...CU-AUG--UUC--CUU--AGU--GGU--AGA--GCU--GUA--UGA-AT GCA...TAAAAAA mrna 3

Traduzione - Allungamento Met Polypeptide Phe Leu Ser Gly Arg Ribosome E P A CCA UCU GAG...CU-AUG--UUC--CUU--AGU--GGU--AGA--GCU--GUA--UGA-AT GCA...TAAAAAA 5 mrna 3

Traduzione - Allungamento Met Polypeptide Phe Leu Ser Gly Arg Ala Aminoacyl trna Ribosome E P A CCA 5 UCU GAG...CU-AUG--UUC--CUU--AGU--GGU--AGA--GCU--GUA--UGA-AT GCA...TAAAAAA mrna 3

Traduzione - Allungamento Met Polypeptide Phe Leu Ser Gly Arg Ala 5 P A Ribosome E UCU CGA GAG...CU-AUG--UUC--CUU--AGU--GGU--AGA--GCU--GUA--UGA-AT GCA...TAAAAAA mrna 3

TRADUZIONE NEGLI EUCARIOTI PRINCIPALI DIFFERENZE CON I PROCARIOTI

1) Fase di inizio regolata da una decina di fattori 2) Aminoacido iniziatore è la Met (e non la f-met). Esistono due Met-tRNAtRNA diversi: uno che riconosce il codone di inizio e l altro che riconosce i codoni successivi 3) Non c è una Sequenza Shine-Dalgarno: la subunità minore del ribosoma dopo aver riconosciuto il 5 cap, inizia uno scanning della molecola di mrna fino ad incontrare (dopo in media 100 nt. Dall inizio) l AUG 4) Mancando la sequenza Shine-Dalgarno, a livello degli mrna eucariotici l AUG viene individuato poiché all interno di una sequenza (GCCGCCA/G CCAUGG) G) detta di Kozak 5) Gli mrna eucariotici sono detti monocistronici 6) I Fattori di rilascio sono 3 nei Procarioti contro 1 (erf3) degli Eucarioti NOTA: La conoscenza approfondita delle differenze dei processi molecolari coinvolti nella traduzione pro- ed eucariotica ha portato alla produzione di molecole antibiotiche quanto più selettive possibile e pertanto meno tossiche per le cellule eucariotiche! (Es: Antibiotici Eritromicina e Streptomicina)

QUESTO MECCANISMO RENDE PIU EFFICIENTE LA TRADUZIONE ED AVVIENE SOPRATTUTTO IN MITOSI, DOPO LA METAFASE!

Il Genoma cellulare specifica inoltre: La struttura primaria delle proteine Destinazione delle proteine all interno della cellula Presenza o assenza della proteina in un determinato tipo cellulare o in un determinato momento della vita cellulare La struttura primaria di RNA non tradotti

Modificazioni post-traduzionalitraduzionali Glicosilazione Acetilazione Fosforilazione