Materiale genetico e Caratteri

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1 Materiale genetico e Caratteri Come l informazione genetica contenuta nel DNA sito nel nucleo condiziona la sintesi delle catene polipeptidiche che avviene nel citoplasma

2 Materiale genetico e Caratteri Elementi fondamentali DNA contiene l informazione genetica L informazione genetica deve essere contenuta nella sequenza delle basi In assenza di DNA (DNA-asi) la sintesi proteica si arresta.. se si aggiunge RNA la sintesi ricomincia

3 Materiale genetico e Caratteri Deduzioni RNA è coinvolto nella sintesi proteica La formazione dell RNA dipende dal DNA L RNA, a differenza del DNA, si trova prevalentemente nel citoplasma, in corrispondenza dei ribosomi (RNA + Proteine) Esisterà una molecola che funge da mediatore capace di trasportare l informazione genetica dal DNA del nucleo ai ribosomi nel citoplasma

4 Materiale genetico e Caratteri La sintesi dell RNA è catalizzata da un enzima la RNA polimerasi RNA polimerasi agisce solo in presenza di DNA L RNA dopo la sintesi si trasferisce dal nucleo al citoplasma dove ha luogo la sintesi proteica Trascrizione Traduzione Proteina DOGMA CENTRALE DELLA BIOLOGIA MOLECOLARE

5 Materiale genetico e Caratteri Caratteristiche dell RNA - 4 basi azotate: Timina Uracile - nessun rapporto di complementarietà tra le basi (quantità di A U e G C) - struttura a filamento singolo (no doppia elica) Sintesi dell RNA A è tradotta in U (non in T) - RNA polimerasi - DNA stampo (1 filamento) - Ribonucleosidi trifosfati - Ribonucleotidi legati in direzione Ribonucleotidi complementari ai nucleotidi DNA L informazione genetica contenuta nel DNA viene TRASCRITTA nell RNA

6 Materiale genetico e Caratteri L RNA polimerasi non necessita di inneschi: sintesi direzione 5 3 La trascrizione dell RNA avviene lungo un solo filamento di DNA

7 Materiale genetico e Caratteri Trascrizione dell RNA

8 Materiale genetico e Caratteri Esistono 3 differenti tipi di RNA RNA ribosomiale (rrna): Costituente dei ribosomi dove avviene la sintesi proteica RNA messaggero (mrna): Trascrive il messaggio genetico dal DNA e lo trasferisce nel citoplasma nei ribosomi RNA transfer (trna): Traduce il messaggio genetico trasportando gli aminoacidi sui ribosomi dove avviene la sintesi della catena polipeptidica I 3 tipi di RNA sono sintetizzati da 3 differenti RNA polimerasi RNA polimerasi I = rrna (ad alto PM) RNA polimerasi II = mrna RNA polimerasi III = trna e rrna (a basso PM)

9 Materiale genetico e Caratteri RNA ribosomiale (rrna) Costituente dei ribosomi insieme alle proteine (rapporto 2:1) I ribosomi sono costituiti da 2 subunità (80s e 40S negli eucarioti) La subunità 50S: 2 molecole di rrna + 34 proteine specifiche La subunità 30S: 1 molecola di rrna + 21 proteine specifiche Non chiara la funzione specifica nella sintesi proteica

10 Materiale genetico e Caratteri RNA messaggero (mrna) Responsabile del trasporto del messaggio genetico dal nucleo al citoplasma Possiede una parte iniziale (leader) e una finale (trailer) che non vengono tradotte Le molecole di mrna hanno una lunghezza e un peso molecolare variabile da cui dipende la grandezza della catena polipeptidica La molecola di mrna può essere tradotta in una sola catena o in una serie di catene polipeptidiche differenti Una volta tradotta l mrna viene distrutta e sostituita da altre molecole

11 Materiale genetico e Caratteri RNA transfer (trna) L informazione genetica trascritta nell RNA deve essere tradotta in una sequenza di aminoacidi Come??????? trna funge da molecola adattatrice che ha la capacità di legare un aminoacido specifico e di stabilire legami con l mrna

12 Materiale genetico e Caratteri RNA transfer (trna) - 80 nucleotidi (basso peso molecolare) - struttura a trifoglio (legami H tra le basi) - 3 lobi e 1 gobba: - mancata complementarietà - presenza di basi diverse (modificazione enzimatica) - Estremità 3 : sequenza finale CCA - Estremità 5 : sempre G Trifoglio

13 Materiale genetico e Caratteri RNA transfer (trna) Come si lega ad un amminoacido specifico???? Come riconosce e come si lega all mrna????

14 Materiale genetico e Caratteri RNA transfer (trna) Attivazione dell aminoacido tramite l azione dell enzima Aminoalcetilsintetasi Aminoacido + ATP = Aminoacido + ATP = Aminoacido~AMP + P~P

15 Materiale genetico e Caratteri RNA transfer (trna) Attivazione dell aminoacido tramite l azione dell enzima Aminoalcetilsintetasi Aminoacido~AMP + trna = Aminoacido~AMP + trna = Aminoacido~t-RNA + AMP Reazione altamente specifica = 20 aminoacidi 20 aminoacetilisintetasi trna

16 Materiale genetico e Caratteri RNA transfer (trna) Ogni molecola di trna deve possedere almeno 2 siti di riconoscimento LOBO 1 Unione con la superficie del ribosoma LOBO 2 Anticodone: specifico per l mrna LOBO 3 Unione con l aminoacetilsintetasi

17 Sintesi proteica Materiale genetico e Caratteri Ad una certa sequenza di nucleotidi nell mrna corrisponde una precisa sequenza di aminoacidi nella catena polipeptidica 4 nucleotidi 20 aminoacidi

18 Sintesi proteica Materiale genetico e Caratteri Ad una certa sequenza di nucleotidi nell mrna corrisponde una precisa sequenza di aminoacidi nella catena polipeptidica 4 nucleotidi 20 aminoacidi Codice a lettere singole (4 parole) A G C T Codice a 2 lettere (16 parole) A G C T A AA AG AC AT G GA GG GC GT C CA CG CC CT T TA TG TC TT Codice a 3 lettere (64 parole)

19 Materiale genetico e Caratteri Sintesi proteica UNITA D INFORMAZIONE = 3 BASI = 3 NUCLEOTIDI = TRIPLETTA TRIPLETTA DNA = CODOGENO TRIPLETTA mrna = CODONE TRIPLETTA trna = ANTICODONE IL CODONE DIRIGE L INSERIMENTO DI UN AMINOACIDO NELLA CATENA POLIPEPTIDICA

20 Sintesi proteica Materiale genetico e Caratteri UNITA D INFORMAZIONE = 3 BASI = 3 NUCLEOTIDI = TRIPLETTA

21 Materiale genetico e Caratteri Sintesi proteica La traduzione deve iniziare e finire in modo preciso INIZIO = CODONE AUG = ANTICODONE UAC = METIONINA MODIFICATA IN fmet (N-formilmetionina) Metionina N-formilmetionina No legame peptidico

22 Materiale genetico e Caratteri Sintesi proteica La traduzione deve iniziare e finire in modo preciso INIZIO = CODONE AUG = ANTICODONE UAC = 3 fattori di inizio (IF1,2,3): IF3 si lega con la subunità 30S del ribosoma e poi si lega l mrna Formazione complesso IF2 - trna+fmet Guanosintrifosfato o GTP attraverso la partecipazione del IF1

23 Sintesi proteica Materiale genetico e Caratteri La traduzione deve iniziare e finire in modo preciso Unione della subunità 50S con la 30S per dare origine al ribosoma funzionale così il GTP è idrolizzato e i IF vengono rilasciati

24 Sintesi proteica Materiale genetico e Caratteri La traduzione deve iniziare e finire in modo preciso Sito Peptilico (P) Sito Aminoacilico (A)

25 Sintesi proteica Materiale genetico e Caratteri La traduzione deve iniziare e finire in modo preciso 2 trna Legame peptidico Sito P Sito A Si lega il trna successivo nel sitoa Sito P Sito A Formazione del legame peptidico tra i 2 amminoacidi (peptidiltransferasi sito nella subunità 50S) Sito P Sito A Il ribosoma si muove sull mrna in direzione 5 3 TRASLOCAZIONE (GTP e traslocasi)

26 Sintesi proteica Materiale genetico e Caratteri La traduzione deve iniziare e finire in modo preciso Codone di terminazione (non senso) Sito P

27 Sintesi proteica Materiale genetico e Caratteri La traduzione deve iniziare e finire in modo preciso

28 Sintesi proteica Materiale genetico e Caratteri La traduzione deve iniziare e finire in modo preciso

29 Materiale genetico e Caratteri Sinetesi proteica

30 Sintesi proteica Materiale genetico e Caratteri

31 Codice Genetico Materiale genetico e Caratteri Esiste una corrispondenza tra TRIPLETTE e AMINOACIDI ð CODICE GENETICO 1961 Nirenberg e Mattei Preparazione di un mrna sintetico costituito solo da U Aggiunto ad una miscela con i 20 amminoacidi di cui uno soltanto radioattivo Fenilalanina

32 Materiale genetico e Caratteri Codice Genetico Nirenberg e Mattei dimostrarono certamente l esistenza di un codice genetico ma non precisarono il n di nucleotidi che in sequenza costituivano l UNITA DI INFORMAZIONE in grado di codificare una amminoacido Crick e collaboratori: dimostrazione che il codice genetico funziona a triplette 1) Mutazione singole (perdita o aggiunta di un nucleotidi nella molecola di DNA) rendono inoperante il messaggio ereditario Aggiunta di 1 nucleotide G CAT-CAT-CAT-CAT-CAT-CAT CAT-CGA-TCA-TCA-TCA-TCA 2) Doppie mutazioni di tipo opposto (perdita e aggiunta di un nucleotide) possono ristorare o non l attività del gene Aggiunta di un altro nucleotide G CAT-CGA-TCA-TCA-TCA-TCA CAT-CGA-TCA-TGC-ATC-ATC- 3) La ristorazione avviene solo se i due nucleotidi interessati sono vicini lungo la molecola Aggiunta di un altro nucleotide G CAT-CGA-TCA-TGC-ATG-CAT-CAT

33 Codice Genetico Materiale genetico e Caratteri Quali sono le triplette che codificano i singoli amminoacidi??? A cosa servono le altre 44 triplette? (64 combinazione - 20 amminoacidi) 3 triplette non senso = non codificano alcun aminoacido Solo Met e Trp sono codificate da 1 tripletta Molte codificano lo stesso amminoacido (in genere i primi 2 nucleotidi sono identici) Il CODICE GENETICO si dice DEGENERATO perché in esso un aminoacido può essere codificato da più di una tripletta

34 Materiale genetico e Caratteri Codice Genetico Corrispondenza tra CODONE e ANTICODONE Si riteneva che esistessero 64 trna differenti di cui 3 non senso Si notò che alcuni trna potevano riconoscere codoni differenti Inoltre alcuni presentavano una base nell anticodone non classica inosina VACILLAMENTO DELL ANTICODONE La base azotata all estremità 5 dell anticodone del trna non è spazialmente confinata come le altre 2 ed è per questo in grado di formare legami H con una qualsiasi delle basi del codone (riguarda solo 1 base del codone e dell anticodone) Base dell'anticodone G C A U I Base del codone U o C G U A o G A, U o C

35 Codice Genetico Materiale genetico e Caratteri Il codice genetico viene letto senza SOVRAPPOSIZIONI mrna Es: senza sovrapposizione 5 AGCUUAGAC.3 AGC-UUA-GAC Es: sovrapposizione AGC-GCU-CUU-UUA-UAG. Es: altre letture AGC-UUA-GAC.. GCU-UAG-AC CUU-AGA-C La fase di lettura può cambiare con la conseguenza che una stessa regione del DNA può codificare per differenti catene polipeptidiche Il codice gentico è UNIVERSALE cioè il codice ed il linguaggio genetico è lo stesso in tutte le specie esistenti sulla terra

36 Mendel Materiale genetico e Caratteri Esistenza di unità ereditarie (geni) preposte al controllo dei singoli caratteri Certi individui che possedevano certi geni manifestavano certi caratteri Materiale ereditario (DNA) e i caratteri non possono collegati in un modo semplice e diretto Una serie di reazioni a catena e di interazioni chimico-ambientali partendo dal materiale ereditario conducono al fenotipo finale UN GENE - UN CARATTERE UN GENE - UN ENZIMA UN GENE UNA CATENA POLIPEPTIDICA

37 Schema semplificato del metabolismo della fenilalanina e della 3rosina

38 Analisi del colore dell occhio in Dosophila melanogaster

39 Nel 1961, alla Cambridge University, Brenner e Crick eseguirono l'esperimento decisivo che dimostro come il codice fosse basato su triplede. Con un uso intelligente di mutageni chimici, essi riuscirono a cancellare o a inserire delle coppie di basi nel DNA. Scoprirono così che l'inserzione o la delezione di una singola coppia di basi dava luogo a una pericolosa mutazione deda frameshi1, ossia a uno spostamento del quadro di ledura: tudo il codice a valle della mutazione risultava alterato.

40 Immaginate un codice cos3tuito da parole di tre ledere come segue: CON DUE ALI NEL BLU. Ora immaginate di far cadere la «D». Se si deve preservare la strudura della frase, cos3tuita da parole di tre ledere, ci ritroveremo così: CON UEA LIN ELB LU, ossia con una sequenza priva di senso a par3re dal sito della delezione.

41 La stessa cosa accade quando si inseriscono o si cancellano due coppie di basi: rimuovendo la «D» e la «U», odeniamo CON EAL INE LBL U: un'altra sequenza priva di senso. Ora, che cosa accade se inseriamo o cancelliamo tre ledere? Rimuovendo la «D», e poi «U» ed «E», odeniamo CON ALI NEL BLU: sebbene si sia persa una «parola» - DUE -, abbiamo ciò nondimeno mantenuto il senso del resto della frase.

42 E anche se la delezione interessasse più parole - per esempio se togliessimo la «U», la«e» e infine la «A» - perderemmo solo due parole, e saremo ancora in grado di recuperare la frase desiderata a valle della mutazione: CON DLI NEL BLU. Lo stesso avviene con una sequenza di DNA: una inserzione/delezione singola devasta completamente la proteina a causa dell' effedo frameshix, che modifica ogni amminoacido a valle della mutazione; e altredanto avviene con una inserzione/delezione doppia.

43 Una delezione/inserzione tripla lungo la molecola di DNA non avrà invece necessariamente effe[ catastrofici: comporterà l'aggiunta o la perdita di un amminoacido, ma senza compromedere necessariamente tuda l'a[vità biologica della proteina risultante.

44 Materiale genetico e Caratteri Che cosa è un GENE???? Il segmento di della molecola del DNA (tratto continuo di DNA) che codifica per una catena polipeptidica completa (o per una molecola di RNA) prende il nome di GENE Per potersi esprimere il gene deve essere prima trascritto nel corrispondente mrna il quale viene poi tradotto nel polipeptide In considerazione della quantità di DNA e del n di proteine sintetizzate si deduce che parte del DNA presente nella cellula non venga espresso in proteine

45 Materiale genetico e Caratteri Che cosa è un GENE???? Il segmento di della molecola del DNA (tratto continuo di DNA) che codifica per una catena polipeptidica completa (o per una molecola di RNA) prende il nome di GENE Per potersi esprimere il gene deve essere prima trascritto nel corrispondente mrna il quale viene poi tradotto nel polipeptide In considerazione della quantità di DNA e del n di proteine sintetizzate si deduce che parte del DNA presente nella cellula non venga espresso in proteine

46 Colinearità tra i codogeni del DNA e gli amminoacidi nella catena polipeptidica. Un gene nel nel DNA specifica gli amminoacidi di una catena polipeptidica.

47 Materiale genetico e Caratteri Che cosa è un GENE???? Una unità genica di trascrizione consiste di sequenze di DNA che vengono trascritte e di sequenze di DNA che non vengono trascritte; quelle non trascritte hanno funzione di regolazione. Sequenze non trascritte costituiscono il promore che dirige a RNA polimerasi sul punto di inizio della trascrizione. Il segnale di inizio è dato da una corta sequenza di basi del DNA nelle regioni del promotore, costituita da sette nucleotidi (pribnow box TATAATG) per i procarioti e da quattro nucleotidi (TATA box) per gli eucarioti. L m-rna che si ottiene con la trascrizione e di dimensioni superiori rispetto alla sequenza di amminoacidi che verrà tradotta. Il segmento traducibile in amminoacidi (il gene vero e proprio) inizia sempre con AUG (codone start) e termina con tre triplette di terminazione (codoni stop) UAA, UAG, UGA

48 Materiale genetico e Caratteri Che cosa è un GENE???? Negli eucarioti esistono sequenze di bp, a monte o a valle del promotore capaci di modulare in senso positivo (enhancer) o negativo (silencer) la frequenza della trascrizione. Tali basi non codificano proteine. Geni discontinui. Parte del DNA presente nella cellula non viene espresso in proteine Negli eucarioti il DNA viene trascritto nel nucleo in molecole di RNA messaggero precursore che vengono eleborate e ridotte di dimensioni fino a formare l m- RNA maturo che migra nel citoplasma e viene tradotto in proteine. Il processo di maturazione (accorciamento) può spiegare alcune delle discrepanze tra la quantità di DNA e quella di RNA messaggero.

49 Materiale genetico e Caratteri Geni discontinui. La scoperta dei geni discontinui porta alla deduzione che parte dei geni corrispondente alle zone non appaiate non compare nell RNA messaggero quindi il gene è discontinuo. Le parti del gene che trovano un corrispettivo nell RNA messaggero vengono chiamate esoni, le altre introni. Durante la maturazione l m-rna subisce tagli ad opera di enzimi, le sequenze esoniche vengono ricucite e lrna messaggero risulta più corto.

50 Materiale genetico e Caratteri Geni discontinui Una ipotesi vorrebbe che le sequenze di introni funzionino come distanziatrici degli esoni e aumenterebbero la frequenza delle mutazioni presenti negli esoni cuciti successivamente a formare un gene. Regolazione dell espressione genica L espressione del gene è regolata da meccanismi dipendenti sia dal controllo genetico interno che dall ambiente esterno alla cellula (fattori induttori e inducili). Il prodotto terminale del gene è regolato dall azione di enzimi chiamati reprimibili la cui attività diminuisce in presenza dei loro metaboliti terminali chiamati correpressori.

51 Materiale genetico e Caratteri Regolazione dell espressione genica I geni della sintesi proteica sono soggetti ad azione di altri geni chiamati regolatori. I sistemi inducibili, quando i geni regolatori hanno subito una mutazione non sono più in grado di codificare repressori funzionali nei sistemi inducibili e producono proteine anche quando non c e ne bisogno

52 Filamento stampo (viene trascri,o nel corrispondente RNA) Filamento senso (la sua sequenza e quella che si trova nel RNA messaggero che codifica la proteina) Diversi 3pi di RNA RNA ribosomale rrna (98 %) deriva dal 1% DNA totale - cosetuisce i ribosomi cioe i sie citoplasmaeci dove avviene la sintesi proteica. RNA di trasferimento - trna ha la funzione di tradurre il messaggio geneeco trasportando gli amminoacidi sui ribosomi. RNA messaggero mrna- ha la funzione di trascrivere il messaggio geneeco dal DNA e di trasferirlo nel citoplasma sui ribosomi. RNA piccoli small RNA intervengono nella regolazione della espressione genica RNA di varia dimensione non codificane snrna

53 Rapido turnover e sosetuzione nei ribosomi da altri mrna. RNA messaggero Le molecole di RNA hanno una lunghezza e un peso variabile ed e quindi da ritenere che cio rifle,a la variabilita nelle dimensioni polipepediche. MeEl Guanilato mrna 5 UTR UTR 3 Regione Leader 5 UTR (Untranslated). Al leader si aggiunge il cap (7- meel guanilato) Regione Trailer 3 UTR (Untranslated) (si lega catena polia). AAAAAAA Nei procarioe una singola molecola di mrna dirige la sintesi di piu catene polipeediche con funzioni correlate. Negli eucarioe l mrna va incontro ad un processo di maturazione.

54 Piccoli RNA Recentemente e stato scoperto che quasi tutti gli eucarioti producono piccole molecole di RNA, lunghe nucleotidi. Questi piccoli RNA intervengono nella regolazione di numerosi processi cellulari, impedendo la traduzione dell mrna.

55 Gene: un segmento di DNA che codifica per una catena polipetidica completa o per una molecola di RNA. Alle triplette presenti nel DNA, chiamate codogeni, corrispondono codoni nell RNA messaggero, anticodoni nel trna e aminoacidi specifici nella catena polipetidica in maniera tale che la sequenza dei codogeni nel DNA e colineare con la sequenza degli aminoacidi nella catena polipeptidica che essa codifica. Il gene e trascritto in mrna e tradotto nel polipeptide.

56 Gene: un segmento di DNA che codifica per una catena polipetidica completa o per una molecola di RNA. Alle triplette presenti nel DNA, chiamate codogeni, corrispondono codoni nell RNA messaggero, anticodoni nel trna e aminoacidi specifici nella catena polipetidica in maniera tale che la sequenza dei codogeni nel DNA e colineare con la sequenza degli aminoacidi nella catena polipeptidica che essa codifica. Il gene e trascritto in mrna e tradotto nel polipeptide.

57 I promotori E la porzione del gene dalla parte 5 che dirige la RNA polimerasi sul punto esatto per l inizio della trascrizione. Sito di inizio della trascrizione Regione codificante Esoni TATA box Regione 5 UTR Introni Regione 3 UTR Gene Negli eucarioti, la sequenza che determina il sito di legame della RNA polimerasi inizia circa a 35 nucleotidi a monte dal sito di inizio: TATA (detta TATA box). Nei procarioti TATAAT a 10. Negli eucarioti e frequente la sequenza CAAT (-100).

58 I geni sono discontinui Se si confronta la quantita di DNA con il numero di proteine si deduce che la maggior parte del DNA presente nella cellula non viene espresso in proteine. Mediante osservazioni al microscopio elettronico, e stato osservato che l appaiamento del RNA con il DNA corrispondente generava anse corrispondenti a regioni non ibridate di DNA. Alcune parti del DNA non compaiono nel RNA e quindi la parte codificante del gene e discontinua. Le parti trascritte del gene sono dette esoni, quelle non trascritte introni

59 La Regolazione dell Espressione Genica Quali sono i meccanismi che determinano l accensione o lo spegnimento dell espressione di un gene?

60 Regolazione della Espressione Genica Gli organismi pluricellulari sono costituiti da cellule differenziate che esprimono geni diversi a seconda della loro funzione ed e per questo necessaria una accurata regolazione delle espressione genica in base alle diverse condizioni fisiologiche e stress ambientali. Le conoscenze acquisite finora sulla regolazione genica riguardano i microorganismi ed in particolare E.coli. In particolare e stato studiato il gene Beta-galattosidasi che scinde il lattosio in glucosio e galattosio. La cellula esprime il gene beta-gal a seconda della concentrazione di lattosio nel suo substrato. Induttore o Repressore: molecola che aumenta o diminuisce la quantita di un enzima specifico (Inducibile o Reprimibile)

61 La regolazione dell espressione genica Nei procarioti: Un espressione genica selettiva permette alle cellule di risparmiare energia La regolazione avviene prevalentemente a livello trascrizionale Negli eucarioti: L espressione genica selettiva permette alle cellule di svolgere ruoli specializzati La regolazione avviene a vari livelli

62 Regolazione genica nei procarioti Geni costitutivi: sono costantemente attivi (es. geni che codificano per gli enzimi della glicolisi) Geni regolati: la loro espressione è regolata in modo tale che che la quantità del corrispondente prodotto (proteina o RNA) è controllata in relazione al fabbisogno cellulare (es. sintesi adattativa di enzimi)

63 I repressori e gli attivatori sono molecole proteiche che legano il DNA

64 Le sequenze nucleotidiche del DNA che si legano ad induttori o repressori sono dette operatori.

65 Differenze della regolazione genica fra procarioti ed eucarioti Dimensione e complessità del genoma Compartimentazione del genoma Organizzazione strutturale del genoma Stabilità dell mrna Modificazione post-traduzionale delle proteine Turnover delle proteine

66 Regolazione Genica negli Eucarioti La regolazione genica negli eucarioti e piu complessa e dipende non solo dalla sequenza del DNA ma anche da: 1) Condizioni diverse di avvolgimento e organizzazione del DNA 2) Maturazione del mrna 3) Separazione spaziale tra trascrizione e traduzione. L espressione genica e controllata a livello: -post-trascrizionale, traduzionale e post-traduzionale. Cromatina: Complesso costituito da DNA e proteine (istoni). La trascrizione dipende dalla capacita della RNA polimerasi di legarsi al promotore.

67 Cellula umana contiene circa geni Geni RNA Geni per proteine Ogni cellula in un determinato momento esprime solo una piccola parte di questo potenziale ( 5000 geni) Geni housekeeping metabolismo biosintesi membrana istoni ribosomali Geni tessuto - specifici DIFFERENZIAMENTO CELLULARE A QUESTA ESPRESSIONE SELETTIVA NON CORRISPONDE (IN GENERE) UNA VARIAZIONE DEL CONTENUTO DI DNA

68 Livelli multipli di regolazione dell espressione genica degli eucarioti

69 Esistono molteplici livelli di regolazione dell espressione genica negli eucarioti controllo trascrizionale: legame di fattori trascrizionali tessuto specifici, legame diretto di ormoni, fattori di crescita o elementi intermedi a elementi risponsivi di geni inducibili CITOPLASMA NUCLEO controllo traduzionale traduzione DNA Trascritto primario (precursore) controllo post-trascrizionale: splicing alternativo, polya alternativo, RNA editing tessutospecifico mrna mrna Meccanismi epigenetici: controllo a lungo raggio mediante rimodellamento della struttura della cromatina controllo del trasporto controllo della stabilità degradazione PROTEINA PROTEINA attiva o inattiva controllo post-traduzionale (es. catabolismo)

70 CROMATINA EUCROMATINA -> TRASCRIZIONE POTENZIALE a) geni housekeeping b) geni tessuto-specifici ETEROCROMATINA FACOLTATIVA -> inattiva quando condensata. Fornisce un meccanismo di compensazione: rapporto geni autosomici/geni X-linked maschi = 2/1 donne = 1/1 ETEROCROMATINA COSTITUTIVA -> sempre inattiva; Localizzata nelle regioni peri - e centromeriche

71 Meccanismi epigenetici Fattori che vengono trasmessi alla progenie, ma che non sono direttamente attribuibili alla sequenza del DNA. Metilazione del DNA; Nelle cellule eucariotiche la metilazione è a carico della C. Solo il 3% delle C sono metilate ed in genere è bersaglio della metilazione la C della doppietta CpG. Modificazioni degli istoni; Acetilazioni, fosforilazioni e metilazioni, responsabili di cambiamenti conformazionali della cromatina.

72 Meccanismi epigenetici: Metilazione del DNA La metilazione del DNA è un processo post-replicativo. L estensione delle modificazioni riguardanti la metilazione del DNA è fondamentalmente decisa durante lo sviluppo. La metilazione del DNA è quindi uno dei meccanismi correlati con il differenziamento cellulare, tramite l inibizione dell espressione genica a livello trascrizionale.

73 Meccanismi epigenetici: Modificazioni degli Istoni I residui amminoacidici all N-terminale di ciascun istone (20-60 residui) si estendono al di fuori della superficie del nucleosoma. Queste regioni sono particolarmente ricche in lisina (K) che può essere reversibilmente modificata mediante acetilazione, fosforilazione e metilazione."

74 Modificazioni degli istoni H3 e H4 La lisina 9 di H3 può essere sia acetilata che metilata. L acetilazione è associata alla cromatina trascrizionalmente attiva, ma se la regione cromatinica viene metilata a livello del DNA (CpG), le proteine che si legano al DNA metilato richiamano le deacetilasi istoniche, che rimuovono i gruppi acetile e le metil transferasi istoniche, legate alle CpG binding protein, metilano gli istoni. Il risultato è la condensazione della cromatina.

75 CARATTERISTICHE DELLA CROMATINA Caratteristica Cromatina attiva Cromatina inattiva Conformazione della cromatina Estesa, aperta Condensata Metilazione del DNA Acetilazione degli istoni Poco metilata specialmente nelle regioni del promotore Istoni acetilati Metilata Istoni non acetilati

76 Repressori e attivatori possono dirigere la deacetilazione/acetilazione degli istoni a livello di specifici geni" Importanza della struttura modulare e delle interazioni proteina-proteina

77 Una serie di fattori trascrizionali deve legarsi al promotore prima che possa farlo la RNA polimerasi. Quindi se la RNA polimerasi potrà iniziare la trascrizione dipenderà anche dal legame di proteine regolatorie, attivatori e repressori. Elementi distali Elementi prossimali Promotore basale

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80 Le modificazioni degli istoni e della cromatina inducono cambiamenti reversibili dello stato della cromatina che hanno un ruolo importante nel controllo della espressione genica. L epigenetica studia i cambiamenti ereditabili della espressione geneica che non dipendono dalla sequenza del DNA. Imprinting genomico o parentale: E un tipo di regolazione in cui l espressione di un gene dipende dal gamete di origine. Sintesi degli antociani nell endosperma di mais: Rr (R di orgine materna, r paterna): cariossidi pigmentate Rr (R di orgine paterna, r materna): non pigmentate.

81 Regolazione Trascrizionale Il controllo trascrizionale dipende da proteine regolatrici (Fattori di regolazione) capaci di legarsi a specifiche sequenze di DNA presenti nella regione del promotore e di esercitare un controllo positivo (attivazione) o negativo (disattivazione). Regolazione Post-trascrizionale L aggiunta selettiva della guanosina metilata alla estremita 5 (sito CAP), la poliadenilazione alla estremita 3, la maturazione mediante leliminazione degli introni, il trasporto selettivo dal nucleo al citoplasma e la degradazione selettiva del mrna. Splicing alternativo.

82 Silenziamento dell RNA Regolazione mediante piccoli RNA che degradano l mrna causando il silenziamento del gene (RNA silencing).

83 Quando coinvolge i microrna si parla di RNA interference. Il silenziamento puo avvenire anche attarverso il blocco della trascrizione causato dalla interazione del piccolo RNA con il promotore del gene (transcriptional gene silencing). Ai mirna viene attribuito un significato evolutivo molto importante: l uomo e lo scimpanze hanno genomi al 99% uguali ma di recente e stato scoperto che lo scimpanze non ha molti geni codificanti mirna presenti nell uomo. Ciò è probabilmente alla base delle differenze tra noi e gli scimpanze. Gli sirna sono invece utilizzati nella difesa degli attacchi virali, nella risposta a stress, nel controllo dall azione mutagena dei trasposoni.

84 Regolazione Traduzionale Presenza di fattori di inzio, di allungamento e di terminazione per la sintesi proteica, sulla capacita dei ribosomi di legarsi alle molecolae di mrna, sulla vita media delle molecole di mrna, sulle concentrazioni di trna, e sull azione dei piccoli RNA. Regolazione Post-Traduzionale Tagli della estremita della catena polipetidica per permettere il trasporto della proteina in uno specifico comparto cellulare. La vita di una proteina puo essere piu o meno lunga e regolata dalla addizione di diversi aminoacidi alla estremita amminica. Ad es. Met e Gly stabilizzano la proteina mentre Arg, Asp provocano la sua degradazione.

85 Catabolismo delle proteine Un modo per regolare la attivita delle proteine è il controllo della loro degradazione mediante la via ubiquitina-proteosoma. Il proteosoma e un complesso proteico di 700kDa presente nel nucleo e nel citoplasma. L ubiquitina, scoperta nel 1975, e una proteina di 76 aminoacidi e peso molecolare di 8.5 kda altamente conservata. Il suo legame alle proteine le indirizza alla degradazione da parte del proteosoma.

86 Il Dogma Centrale della Biologia Molecolare Alla luce delle conoscenze disponibili oggi, lo schema proposto negli anni 50 del XX secolo si e molto modificato.