Scuola di Scienze mediche e Farmaceutiche HERPESVIRUS Prof. Oliviero E. Varnier www.microbiologia.unige.it 2014 Sezione di Microbiologia Dipartimento di Scienze Chirurgiche R Diagnostiche Integrate (DISC)
INTRODUZIONE! Gli Herpesvirus sono una delle principali cause di malattie virali umane, secondi solo ai virus influenzali e del raffreddore.! Sono in grado di causare malattie sintomatiche o di rimanere silenti per molti anni in attesa di essere riattivati.! Il nome herpes deriva dal latino herpes che, a sua volta, deriva dalla parola greca herpein che significa diffondersi. La natura di avanzare e diffondersi è caratteristica delle lesioni della cute causate da molti herpesvirus. 2 di 44
SONO NOTE 25 FAMIGLIE DI HERPESVIRUS MA SOLO 8 SONO CAPACI DI INFETTARE L UOMO TIPI DI HERPESVIRUS CHE INFETTANO L UOMO Virus Herpes simplex di Tipo 1 (HSV-1) Virus Herpes simplex di Tipo 2 (HSV-2) Virus Varicella Zoster (VZV) Virus di Epstein Barr (EBV) Citomegalovirus (CMV) Herpes virus umano 6 (esantema subitum o sesta malattia) Herpes virus umano 7 Herpes virus umano 8 (associato al sarcoma di Kaposi) 3 di 44
PROPRIETÀ DEGLI HERPESVIRUS Herpes Virus Umano Tipo Nome Sub Familia Cellule Bersaglio Latenza Trasmissione 1 Herpes simplex-1 (HSV-1) Alphaherpesvirinae Mucose epiteliali Neuroni Contatto stretto 2 Herpes simplex-2 (HSV-2) Alphaherpesvirinae Mucose epiteliali Neuroni Contatto stretto di solito sessuale 3 Varicella Zoster virus (VZV) Alphaherpesvirinae Mucose epiteliali Neuroni Contatto o via respiratoria 4 Epstein-Barr Virus (EBV) Gammaherpesvirinae Linfociti B, epiteliali Linfociti B Saliva 5 Cytomegalovirus (CMV) Betaherpesvirinae Epiteliali, monociti, linfociti Monociti, linfociti e altre Contatto, trasfusioni di sangue, trapianti, congenita 6 Human herpes virus-6 (HHV-6) Betaherpesvirinae Linfociti T e altre Linfociti T e altre Contatto, via respiratoria 7 Human herpes virus-7 (HHV-7) Betaherpesvirinae Linfociti T e altre Linfociti T e altre Sconosciuta 8 Human herpes virus-8 (HHV-8) Kaposi's sarcoma- associated herpes virus (KSHV) Gammaherpesvirinae Cellule endoteliali sconosciuta Scambio di liquidi corporei? 4 di 44
HERPESVIRUS: GENERALITÀ! Gli Herpesvirus sono classificati in base alla loro localizzazione nello stato di latenza.! Quando un soggetto viene infettato da un virus erpetico, l infezione rimane per tutta la vita.! L infezione primaria può essere seguita da una latenza con successive riattivazioni.! Gli herpesvirus infettano la maggior parte della popolazione umana e le persone di mezza età quasi sempre hanno anticorpi verso la maggior parte degli herpesvirus ad eccezione di HHV-8. 5 di 44
HERPES VIRUS: CAPSIDE E PERICAPSIDE Virus Herpes Simplex tipo 1 Un capside (400kV Spot-scan Electron Cryomicroscopy) Virus Herpes Simplex tipo 1 Colorazione negativa Il CAPSIDE è icosaedrico composto da 162 capsomeri, che hanno una forma a ciambella 6 di 44
RICOSTRUZIONE 3-D AL COMPUTER DA MICROFOTOGRAFIE CRIO-ELETTRONICHE DI CAPSIDI DI VIRUS HERPES SIMPLEX Gli Herpesvirus hanno un pericapside che circonda un capside icosaedrico, circa 100nm di diametro, che contiene il genoma a DS DNA. Quando il pericapside si rompe e collassa allontanandosi dal capside, i virioni colorati negativamente hanno un tipico aspetto di un uovo all occhio di bue. 7 di 44
HERPES VIRUS: PERICAPSIDE Gli Herpesvirus hanno il pericapside: gemmano dalla membrana nucleare, che è stata modificata con l inserzione di glicoproteine erpetiche (nel virus maturo, queste glicoproteine funzionano da antirecettori per i recettori cellulari e determinano il tropismo). 8 di 44
HERPES VIRUS: PERICAPSIDE! Il pericapside è molto fragile e un virus con un pericapside danneggiato non è infettivo.! La principale implicazione è la trasmissibilità: il virus può essere preso solo per contatto diretto con le superfici mucose o con le secrezioni di un soggetto infetto.! Il virus è sensibile a: disidratazione, acidi, detergenti e solventi organici per la presenza di lipidi nel pericapside. 9 di 44
HERPES VIRUS: PERICAPSIDE Le glicoproteine (spikes) sulla superficie di HSV: la glicoproteina B (gb) è chiaramente visualizzata in clusters di spine lunghe circa 10 nm. Tegumento: è lo spazio tra pericapside e capside. Contiene proteine virali ed enzimi necessari nelle prime fasi della replicazione. 10 di 44
HERPES VIRUS: MORFOLOGIA Genoma: un DNA a doppio filamento: il CMV ha il genoma di maggiori dimensioni 11 di 44
ANIMAZIONE DELL INFEZIONE E REPLICAZIONE DI HSV MORFOLOGIA del VIRUS HERPES SIMPLEX HSV è un virus a DNA, che si replica nel nucleo, con un capside e pericapside. Il pericapside contiene almeno 8 glicoproteine. La matrice o tegumento, che aderisce sia al capside sia al pericapside, contiene almeno 15-20 proteine. 12 di 44
AZIONE DELL INFEZIONE E REPLICAZIONE DI HSV Il genoma di HSV deve entrare nella cellula per iniziare l infezione. L adsorbimento avviene tra i proteoglicani della superficie cellulare e la glicoproteina gc. Questo evento è seguito da una specifica interazione con uno o più recettori cellulari chiamati "HVEM" (Herpes Virus Entry Mediators), che sono simili ai recettori i nerve growth factors e il tumor necrosis factor. È necessaria la specifica interazione con la glicopoteina gd seguita dalla fusione con la membrana cellulare. La fusione richiede l intervento dellee glicoproteine virali: gb, gh, gi e gl. 13 di 44
ANIMAZIONE DELL INFEZIONE E REPLICAZIONE DI HSV! Il capside virale con alcune proteine del tegumento migra verso i pori nucleari attraverso microtubuli cellulari utilizzando il sistema di trasporto cellulare.! Questo attracco dovrebbe comportare l iniezione del DNA virale dentro i pori, mentre il capside rimane nel citoplasma. Alcune proteine del tegumento (alfa-tif) entrano nel nucleo con il genoma virale. 14 di 44
ANIMAZIONE DELL INFEZIONE E REPLICAZIONE DI HSV La trascrizione del genoma HSV utilizza l apparato trascrizionale cellulare e promotori virali che impiegano i siti leganti dei fattori trascrizionali cellulari. Ci sono due fasi principali della trascrizione: v PRECOCE, che avviene prima della replicazione del genoma, v TARDIVA, che avviene dopo la formazione di copie di genomi nelle aeree di replicazione virale nel nucleo cellulare infettato. 15 di 44
ANIMAZIONE DELL INFEZIONE E REPLICAZIONE DI HSV La trascrizione PRECOCE si divide in due fasi: 1. PRECOCISSIMA: dopo l entrata del genoma virale nel nucleo, nel quale l alfa-tif associato al virione si lega al recettore cellulare Oct-1, che ha legato le sequenze TAATGARAT nella parte upstream degli enhancers dei promotori precoci immediati. Questo evento causa un efficiente assemblaggio del complesso di preiniziazione nella TATA box e nella trascrizione mediata da pol II. I trascritti precocissimi sono trasportati nel citoplasma, tradotti e le proteine precocissime migrano nel nucleo. 16 di 44
ANIMAZIONE DELL INFEZIONE E REPLICAZIONE DI HSV. PRECOCE Tutta la successiva trascrizione richiede l azione delle proteine precoci: in particolare la proteina alfa 4, che è un attivatore generico della trascrizione, funziona legandosi a siti multipli del genoma, interagisce con le vicine TATA boxes e facilita l assemblaggio dei complessi di preiniziazione. 17 di 44
ANIMAZIONE DELL INFEZIONE E REPLICAZIONE DI HSV La trascrizione PRECOCE procede e le proteine precoci sono tradotte nel citoplasma, migrano nel nucleo e mediano la replicazione del genoma virale (DNA-polimerasi). Con la replicazione dei genomi, si concentrano in aree delimitate dove inizia la TRASCRIZIONE TARDIVA. La trascrizione precoce si esaurisce con la replicazione del genoma. 18 di 44
ANIMAZIONE DELL INFEZIONE E REPLICAZIONE DI HSV I trascritti TARDIVI sono divisi in due gruppi generali: PARZIALMENTE TARDIVI e STRETTAMENTE TARDIVI. Essi differiscono per la quantità di trascrizione osservata prima della replicazione del genoma. Sono controllati da promotori con diverse architetture funzionali. Alcuni promotori STRETTAMENTE TARDIVI contengono un elemento DAS (Downstream Activating Sequence) che interagisce con uno o più fattori cellulari DBF (DAS Binding Factor) per mediare la formazione efficiente di complessi tardivi di trascrizione. 19 di 44
ANIMAZIONE DELL INFEZIONE E REPLICAZIONE DI HSV Le proteine procapsidiche (UL18, UL19 e UL38) si assemblano attorno alle proteine di uno scheletro (UL26 e UL26.5), che successivamente sono eliminate. I capsidi vuoti incorporano il DNA mediante l azione di proteine di clivaggio e di assemblaggio. I capsidi migrano verso la membrana nucleare e gemmano nel lume dei due foglietti della membrana. Questo virione con pericapside entra nel cito-plasma mediante uuna fusione con la membrana esterna. 20 di 44
L INFEZIONE E REPLICAZIONE DI HSV 21 di 44
LATENZA VIRALE. 22 di 44
Percorso dell Infezione Erpetica L Herpesvirus entra nell organismo L Herpesvirus è latente nei nervi L Herpesvirus viene riattivato L Herpesvirus entra nell organismo attraverso la cute o le membrane mucose Dopo l infezione primaria, l herpesvirus rimane latente nei nervi spinali L herpesvirus viaggia lungo i nervi, ritornando nella cute dove forma nuove vescicole 23 di 44
I siti nei quali HSV-1 e HSV-2 causano malattia nell uomo 24 di 44
MALATTIE CAUSATE DA HSV I virus Herpes simplex 1 e 2 sono frequentemente asintomatici, ma possono anche causare gravi malattie. La lesione iniziale è la stessa. Un vescicola trasparente su una base eritematosa contenente virus infettivo. Questa è spesso indicata come una goccia di rugiada su un petalo di una rosa, che si trasforma in pustola e poi in ulcera, che infine si ricopre di croste. 25 di 44
PROGRESSIONE DELLE LESIONI DA ALFA HERPESVIRUS Arrossamento con rigonfiamento Vescicole trasparenti contenenti liquido e pustole Risoluzione delle vescicole, erosioni e ulcere 26 di 44
PROGRESSIONE DELLE LESIONI DA ALFA HERPESVIRUS Formazione di croste Lesione coperta di croste guarigione 27 di 44
ERPES ORALE MALATTIE CAUSATE DA HSV Può essere il risultato di una infezione da HSV-1 o da HSV-2. Poichè l HSV-2 è trasmesso sessualmente, le infezioni nei bambini sono quindi causate da HSV-1. Nella gengivostomatite erpetica primaria, le lesioni iniziano come vescicole chiare che si trasformano rapidamente in ulcere, caratterizzate da un aspetto biancastro. L infezione inizia sulle labbra, poi si diffonde intorno alla bocca, e raggiunge palato,faringe, gengive e la lingua. La riattivazione dai gangli del trigemino può dare manifestazioni mucocutanee ricorrenti (ulcere fredde). La faringite erpetica è spesso associata ad altre infezioni virali delle vie aeree superiori. La malattia è più grave nei soggetti immunosoppressi. 28 di 44
MALATTIE CAUSATE DA HSV CHERATITE ERPETICA La cheratite erpetica, principalmente causata da HSV-1, è quasi sempre limitata ad un solo occhio. Può dare episodi ricorrenti causando cicatrici permanenti, danno corneale e cecità. 29 di 44
HERPES ORALE Il virus herpes simplex può iniziare un infezione primaria nelle labbra e quindi raggiungere il ganglio trigemino, dove rimane latente. Il virus può successivamente riattivarsi, ritornare nel sito originario dell infezione e indurre le lesioni tipiche della febbre erpetica labbiale. 30 di 44
EPIDEMIOLOGIA! Le infezioni da HSV 1 e 2 durano tutta la vita e sebbene l instaurarsi della latenza sia iniziale, il soggetto infetto può trasmettere l infezione ad altri durante la riattivazione.! Il virus si trova nelle lesioni della cute, ma può essere presente anche in numerosi liquidi biologici (saliva e secrezioni vaginali).! Entrambi I virus possono infettare le mucose orali e genitali: HSV-1 di solito si diffonde bocca-bocca (con il bacio e l uso di utensili contaminati da saliva) o con il traferimento di virus infettivo con le mani e la sua entrata nell organismo attraverso qualsiasi lesione o la mucosa degli occhi.! La maggior parte della popolazione ha contratto l infezione da HSV-1, come dimostrato dalla presenza di anticoopri specifici. Oltre il 90% dei bambini hanno anticorpi anti HSV-1 per la scarsa igiene dei paesi in via di sviluppo. 31 di 44
EPIDEMIOLOGIA L HSV-2 si trasmette per via sessuale e si ritrova nell ano, retto, e apparato digerente e nell area genitale. Un neonato può essere infettato alla nascita dalla madre con un infezione genitale, ma anche in utero se la madre ha una infezione sistemica. Poichè il neonato ha un sistema immune immaturo, l infezione può essere grave e talvolta letale. Tutti coloro che vengono a contatto con un liquido contenente virus infettivo sono a rischio d infezione. Il PATERECCIO erpetico è una infezione delle dita e l herpes dei GLADIATORI è una infezione del corpo. Il virus penetra attraverso tagli o abrasioni della cute. Il personale sanitario spesso contrae il patereccio da pazienti con infezioni erpetiche. Le infezioni da HSV-2 sono prevalenti negli adulti con l aumento dell attività sessuale con percentuali dell 80% nelle prostitute. 32 di 44
PATOGENESI L esposizione al virus di superfici mucose o di cute abrasa ne permette l inizio della replicazione all interno delle cellule del derma e dell epidermide. Una replicazione virale sufficiente per permettere l infezione delle terminazioni nervose sensoriali e autonome si può verificare in presenza e in assenza di lesioni clinicamente evidenti. Si pensa che il virus o più probabilmente il nucleocapside, sia successivamente trasportato, per via intraassonale, nella cellula nervosa, a livello dei gangli. Nell uomo non è conosciuto l intervallo che intercorre fra l inoculazione del virus in un tessuto periferico e la sua diffusione ai gangli. 33 di 44
PATOGENESI Durante le fasi iniziali dell infezione, la replicazione virale avviene a livello dei gangli e nel tessuto nervoso adiacente. Il virus diffonde poi ad altre superfici mucose e cutanee con una migrazione di tipo centrifugo dei virioni infettanti attraverso il sistema nervoso periferico. Questa diffusione del virus dai nervi sensoriali alla cute aiuta a spiegare la vasta superficie e l elevata frequenza di nuove lesioni distanti dalla sede iniziale dell infezione, caratteristiche in pazienti con infezione primaria da HSV a livello orolabiale o genitale e l isolamento del virus nel tessuto nervoso distante dai neuroni che innervano il sito di inoculazione. Si può inoltre avere diffusione per contiguità del virus inoculato localmente e ciò può permettere un ulteriore estensione mucocutanea della malattia. 34 di 44
PATOGENESI! Al termine dell infezione primaria non è più possibile isolare il virus dai gangli sebbene in una certa percentuale di casi sia possibile trovare DNA virale nelle cellule gangliari nella sede dell infezione iniziale.! L HSV può poi essere riattivato da vari stimoli quali immunodepres-sione, traumi, luce ultravioletta, ecc.; i meccanismi di tale riattivazione sono sconosciuti. 35 di 44
HSV Gli Herpes simplex virus sono molto grandi e i loro genomi codificano almeno 80 proteine, metà delle quali non fanno parte della struttura virionale e neppure controllano la replicazione virale, ma interagiscono con l ospite o con la risposta immune dell ospite. Esistono due tipi: HSV-1 e HSV-2 con caratteristiche simili. Il genoma di HSV codifica per numerosi enzimi:! DNA-polimerasi DNA-dipendente! Timidina chinasi (fosforila la timidina e altri nucleosidi)! Riduttasi dei ribonucleotidi (converte i ribonucleotidi in deossiribonucleotidi)! Serino-proteasi (converte una proteina dello scheletro nella sua forma finale) è essenziale per la produzione di virioni maturi infettivi 36 di 44
HSV Il genoma codifica 11 glicoproteine di superficie, che sono coinvolte in: u Adsorbimento (gb, gc, gd e gh) u Fusione della membrana virale con quella della cellule ospite (gb) u Escape immunitario! Un esempio di funzione di escape immune è gc che si lega alla proteina C3 del complemento e quindi la allontana dal siero dell ospite e inibisce le reazioni mediate dal complemento.! altre funzioni (gc, ge e gi).! Le proteine virali ge e gi possono anche legare il frammento FC delle IgG. Il virus si copre di immunoglobuline e si nasconde al sistema immune. 37 di 44
INFEZIONE LATENTE Il virus HSV risiede nei gangli infetti, nei quali non è in grado di replicarsi e solo pochi geni virali sono espressi. HSV persiste nei gangli infetti per tutta la vita, ma determinati stimoli sono in grado di riattivare il virus. Nelle infezioni secondarie il virus segue gli assoni in direzione centrifuga e si ha un ciclo di replicazione sulla cute o sulle mucose. Riattivazioni spontanee avvengono nonostante la presenza nell ospite di immuntità umorale e cellulare, che comunque limita la replicazione virale locale cosicchè le infezioni riccorrenti sono meno estese e meno severe. Molte infezioni ricorrenti sono asintomatiche e caratterizzate solamente da presenza virale nelle secrezioni. 38 di 44
INFEZIONE LATENTE! Sebbene la base molecolare della riattivazione non sia nota, si conoscono numerosi stimoli scatenanti quali: febbre, stress fisico o psichico, esposizione alla luce ultravioletta, traumi e variazioni ormonali.! Più dell 80% della popolazione ospita HSV-1 nella forma latente, ma solamente una piccola parte va incontro a infezioni ricorrenti. 39 di 44
LA RISPOSTA IMMUNE VERSO HSV 1 e 2 Interferone è importante nel limitare l infezione primaria e le cellule natural killer sono coinvolte in questa fase. Le cellule T citotossiche e i macrofagi sono il braccio cellulare della risposta e uccidono le cellule infettate. La risposta umorale (di solito anticorpi anti glicoproteine di superficie) conferisce la neutralizzazione. HSV evita il sistema immune coprendosi con IgG utilizzando i recettori FC e quelli del complemento. Il virus può anche diffondersi passando da una cellula all altra senza entrare negli spaci intercellulari e venire a contatto degli anticorpi umorali. Le risposte cellulo-mediate sono vitali nel controllo delle infezioni erpetiche. 40 di 44
DIAGNOSI Esame microscopico diretto delle cellule prelevate dalla lesione, mediante striscio di Tzanck (un raschiamento alla base della lesione), che evidenzia cellule giganti multinucleate e corpi inclusi di Cowdry di tipo A. Un rapida e definitiva diagnosi può essere ottenuta dimostrando al presenza di antigeni virali (mediante tecniche di immunofluorescenza o di immunoperossidasi) oppure di DNA (ibridizzazione o PCR) nel tessuto o nel liquido delle vescicole. Isolamento in colture cellulari (HeLa, Hep2 e fibroblasti con comparsa di effetto citopatico in 1-3 giorni. I test sierologici sono utili per la diagnosi di una infezione primaria da HSV e per studi epidemiologici. 41 di 44
TERAPIA L acyclovir (acicloguanosina) è il farmaco di scelta, è un analogo nucleosidico, ma ha un invidiabile reputazione di nontossicità. Le sue proprietà farmacologiche anti-virali si rivelano solo quando viene fosforilato nella sua forma monofosfato e successivamente nel derivato trifosfato (acyclo-gtp). La fosforilazione avviene nelle cellule che contengono le deossicitidina chinasi codificata da HSV, ma non in presenza dell analogo enzima presente nelle cellule di mammifero. La fosforilazione è quindi una prerogativa delle cellule infettate da HSV e non avviene in modo significativo nelle cellule non infettate- L acyclo-gtp è un potente inibitore selettivo della DNA polimerasi di HSV e causa un arresto della catena, competendo con il guanosintrifosfato per l incorporazione nel DNA virale neosintetizzato. 42 di 44
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VACCINI La ricerca di un vaccino anti-hsv non è un fatto nuovo. Tentativi in tal senso risalgono a mezzo secolo fa e circa venti anni fa alcuni vaccini, costituiti da virus interi inattivati, furono commercializzati in Europa. È interessante notare che il principale beneficio di questi primi prodotti sembra essere stato più terapeutico che profilattico (servirono a ridurre l ipersensibilità alle proteine di HSV e perciò attenuarono la gravità delle ricadute). Per la possibile oncogenicità di HSV, sono stati prodotti vaccini privi di DNA, sia per purificazione sia per ingegneria genetica. Questi vaccini composti da subunità o da glicoproteine sono senza dubbio antigenici e gli anticorpi che evocano possono essere protettivi. 44 di 44