Biopsia Liquida Appunti di Genomics & Oncology
Biopsia: una procedura diagnostica essenziale per i pazienti oncologici La biopsia è una procedura essenziale nei pazienti oncologici, in quanto fornisce informazioni cruciali sulla diagnosi, la prognosi e la predittività della risposta o della resistenza a una terapia. Per decenni la biopsia è stata e continua a essere lo standard di cura. Inoltre l analisi bioptica ha rappresentato l unica opzione per determinare il tessuto nel quale si è originata la neoplasia e lo stadio di malattia del paziente. Con l avvento delle terapie target, oggi è essenziale valutare anche la presenza o l assenza di alterazioni molecolari specifiche congiuntamente agli aspetti istologici noti. I test di companion diagnostics vengono attualmente utilizzati di routine per determinare l idoneità del trattamento con terapie target in pazienti affetti da diversi tipi di neoplasia, come il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC), il melanoma, il tumore al seno e il carcinoma colorettale metastatico (mcrc). Essendo aumentato il numero dei test disponibili per la diagnosi e la valutazione genetica delle patologie oncologiche, è aumentata anche la necessità di avere più tessuto tumorale da analizzare. Le tecniche attualmente utilizzate per la biopsia sono invasive e, soprattutto nel caso di NSCLC, producono spesso un numero di cellule o di sezioni tissutali troppo esiguo per un analisi approfondita e per molti pazienti non è possibile eseguire biopsie ripetute a causa dell età o di eventuali comorbidità. Emerge dunque chiaramente l esigenza di tecniche bioptiche migliorate che siano in grado di produrre quantità di campione adeguate, che riflettano la carica tumorale nel suo complesso e che consentano analisi frequenti.
Limiti delle attuali tecniche di Biopsia Tissutale L analisi diretta del tessuto tumorale fornisce informazioni essenziali sullo stato del tumore e rappresenta una delle procedure fondamentali per il trattamento delle patologie oncologiche. Tuttavia, la biopsia tessutale pone diversi problemi che ne limitano l utilità come la difficoltà di acquisire quantità adeguate di tessuto, la limitata ripetibilità, gli errori di campionamento dovuti al prelievo di una piccola area di un singolo tumore e all eterogeneità tessutale. 13 L esecuzione della biopsia può essere ostacolata anche dalla presenza di comorbilità e dalla mancanza di compliance da parte del paziente, che impediscono così, di ottenere una quantità di tessuto adeguata per l analisi. Sebbene la biopsia chirurgica è la tecnica che in genere consente di ottenere la maggior quantità possibile di tessuto tumorale intatto da sottoporre ad analisi si tratta tuttavia di una procedura invasiva, e dispendiosa in termini sia di costi che di tempo. Inoltre, la biopsia chirurgica può comportare complicanze cliniche: da uno studio condotto al riguardo è emersa una percentuale di complicanze pari al 17,1% per le biopsie intratoraciche e all 1,6% per le biopsie pelviche/addominali, nonché una percentuale di complicanze complessive maggiori pari all 0,8%. 19 Esistono altre opzioni meno invasive della biopsia chirurgica, come l agoaspirazione (FNA) e la microbiopsia (CNB), ma queste tecniche consentono di prelevare quantità inferiori di campione tumorale e di indagare solo su una porzione del tumore e possono essere difficili da analizzare a causa di necrosi cellulare o infiltrazione di cellule immunitarie. Inoltre, la maggior parte delle biopsie vengono conservate mediante fissazione in formalina e inclusione in paraffina (FFPE), ma questa tecnica può alterare il DNA e rendere difficoltosa l analisi con le tecniche di routine come la reazione a catena della polimerasi (PCR). Forse la limitazione maggiore per le tecniche di biopsia tessutale è data dal fatto che il campionamento di un singolo tumore potrebbe non catturare tutte le mutazioni presenti. Le neoplasie maligne si evolvono geneticamente nel tempo, una caratteristica che consente al tumore di metastatizzare e sviluppare resistenza a trattamenti inizialmente efficaci Per esempio, il trattamento con erlotinib è indicato in pazienti con NSCLC metastatico con delezioni dell esone 19 o sostituzione L858R nell esone 21 di EGFR. Tuttavia, la resistenza all erlotinib in genere si manifesta entro alcuni mesi dall inizio del trattamento come si evidenzia da una sopravvivenza mediana libera da progressione (PFS) di 10,4 mesi. 14 Poiché le cellule cancerose sono in grado di mutare rapidamente, l eterogeneità genetica può esistere non solo tra le diverse sedi tumorali, ma anche all interno di uno stesso tumore. Questa eterogeneità intratumorale è stata definitivamente dimostrata da tre diversi gruppi nei carcinomi polmonari, ma anche in neoplasie a carico di altri organi. 5 Pertanto, la singola biopsia potrebbe fornire informazioni limitate, evidenziando così la necessità di tecniche meno invasive, come la biopsia liquida, che consentano di testare con maggior frequenza sedi tumorali multiple.
Cos è la biopsia? La biopsia liquida è un metodo a ridotta invasività per la valutazione dello stato genetico del tumore basato sull analisi del DNA libero circolante (cfdna) presente nella componente plasmatica del sangue. 6 Poiché i campioni ematici sono facilmente ottenibili, la biopsia da plasma è da tempo considerata come una promettente metodica non invasiva a integrazione delle tecniche di biopsia tradizionali. Una modalità con cui i tumori forniscono informazioni sotto forma di biomarcatori è attraverso la necrosi delle cellule tumorali con il rilascio di cellule morte o di detriti cellulari. Queste cellule vengono inglobate dai fagociti che processano il DNA cellulare tumorale, che poi viene rilasciato nel sangue sotto forma di piccoli frammenti. Il cfdna, derivando dalle cellule tumorali, può essere analizzato per le stesse alterazioni genetiche che si trovano nel tumore, come mutazioni, amplificazioni, riarrangiamenti cromosomici e ipermetilazione. Per massimizzare la sensibilità, le tecniche di biopsia liquida si basano o sull amplificazione in PCR o la tecnologia di next-generation sequencing (NGS). Oltre al cfdna, per la biopsia liquida si possono utilizzare, come fonte di DNA tumorale, le cellule tumorali circolanti (CTC) o gli esosomi. Le CTC sono cellule tumorali intatte rilasciate nel flusso ematico che possono essere utilizzate come fonte per estrarre DNA tumorale. 11 Molti pazienti con neoplasie maligne allo stadio iniziale potrebbero non presentare CTC nel sangue, pregiudicandone così l affidabilità ai fini dell identificazione delle variazioni genetiche o della valutazione prognostica. Gli esosomi sono vescicole di membrana extracellulari con una dimensione tra 50-150nm. 3 Queste vengono rilasciate dalla maggior parte delle cellule, incluse le cellule tumorali e pertanto possono venire utilizzate nella biopsia liquida come fonte di DNA, RNA e proteine tumorali. Per effettuare una biopsia liquida, si preleva un campione di sangue e se ne separa la componente cellulare, ottenendo il plasma. Quindi si procede a estrarre da questo il cfdna per sottoporlo ad analisi. Richiedendo solo un semplice prelievo ematico, la biopsia liquida può essere ripetuta più volte con un impatto minimo per il paziente. Poiché la biopsia liquida analizza direttamente il DNA tumorale, può fornire informazioni sullo stato dei geni associati allo sviluppo della neoplasia, come EGFR, KRAS, NRAS, PIK3CA e BRAF.
Perchè utilizzare la biopsia liquida? A differenza della biopsia tradizionale, la biopsia liquida può essere eseguita molto più frequentemente con minor rischio per il paziente. Inoltre è in grado di fornire un profilo genetico più completo dell intera carica tumorale del paziente, poiché è in grado di analizzare il DNA da ogni sede tumorale eventualmente presente. Data la sua natura non invasiva, la biopsia liquida potrebbe essere utilizzata per il monitoraggio frequente dei pazienti in terapia, fornendo così un istantanea della genetica del tumore per tutta la durata del trattamento. Attualmente, gli oncologi si basano soprattutto sulla diagnostica per immagini, come la tomografia computerizzata (TC) e la tomografia a emissione di positroni con fluorodesossiglucosio (PET), entrambe tecniche dispendiose in termini di costi e di tempo. Inoltre il monitoraggio della malattia viene in genere effettuato ogni 3-6 mesi. Al contrario i campioni di sangue possono essere prelevati a intervalli più frequenti (es. a cadenza settimanale) per valutare la risposta terapeutica del paziente, e la maggior frequenza della biopsie potrebbe consentire di monitorare lo sviluppo di resistenze al trattamento e per decidere tempestivamente eventuali modifiche dell iter terapeutico o accelerare la calendarizzazione degli esami di diagnostica per immagini. Nei pazienti che mostrano di aver conseguito una risposta terapeutica completa, la biopsia liquida potrebbe consentire un migliore monitoraggio della carica tumorale e la valutazione della malattia residua minima (MRD). Similarly, CA-125 is a protein biomarker for ovarian cancer recurrence. La carica tumorale viene generalmente valutata con esami di diagnostica per immagini e, per alcuni tipi di neoplasie, con la determinazione dei livelli dei biomarcatori proteici circolanti: ad esempio, l antigene prostatico specifico (PSA) è il biomarcatore standard che viene utilizzato per il monitoraggio della diagnosi, delle recidive e della carica tumorale nei pazienti affetti da carcinoma prostatico. Analogamente il CA-125 è un biomarcatore proteico per la recidiva del carcinoma ovarico. Molti biomarcatori proteici permangono nel sangue per settimane e quindi non forniscono un quadro preciso della carica tumorale presente in un dato momento. Al contrario, il cfdna ha un emivita breve (circa 2 ore) ed è quindi potenzialmente in grado di fornire un istantanea precisa della carica tumorale nel momento del prelievo ematico.8 Di conseguenza, l analisi del cfdna potrebbe fornire una valutazione dinamica dei cambiamenti nella carica e nella genetica del tumore. In alcune situazioni, la combinazione dei biomarcatori serologici e quelli molecolari può fornire una visione complementare dello stato della malattia. La biopsia liquida rappresenta inoltre un metodo interessante per ovviare alla quantità limitata di tessuto ottenibile con l agoaspirazione o la microbiopsia, nonché un alternativa per quei pazienti che non possono essere sottoposti a biopsia tessutale. Inoltre la, biopsia liquida ha un elevato valore predittivo positivo; ne consegue che un risultato positivo ottenuto mediante un test in biopsia liquida validato potrebbe portare direttamente alla certezza da parte del clinico del beneficio di una terapia mirata per il paziente.
Limiti del cfdna Nonostante le indicazioni promettenti, per poter sviluppare un approccio valido basato sull analisi del cfdna occorre superare diversi problemi di carattere tecnico. Molti tumori, se non addirittura la maggior parte, rilasciano DNA nel plasma. Tuttavia, la quantità di questo DNA varia nei diversi pazienti. Se la quantità è proporzionale alla carica tumorale totale, i pazienti con neoplasia allo stadio iniziale potrebbero non avere una quantità sufficiente di cfdna per consentire un analisi accurata. In alcuni casi, il cfdna di origine tumorale rappresenta meno dell 1% del DNA libero circolante. 6,8 A complicare ulteriormente il quadro, si aggiunge la contemporanea presenza nel DNA libero circolante di DNA genomico normale. Per il suo utilizzo in pazienti con neoplasia a uno stadio iniziale o per la diagnosi precoce, è necessario disporre di tecniche altamente sensibili che siano in grado di garantire il sequenziamento affidabile di una piccola quantità di cfdna mutante a fronte della presenza di grandi quantità di DNA genomico normale. Per poter essere rilevante dal punto di vista clinico, l identificazone di mutazioni a questi livelli ultrasensibili richiede inoltre una validazione approfondita. Biomarcatori tumorali nel sangue 1. DNA libero circolante (cfdna) 2. Cellule tumorali circolanti (CTC) 3. Esosome1 & microvesicole
Studi clinici sulla biopsia liquida Attualmente le tecniche di biopsia liquida sono state introdotte in studi clinici per valutarne potenzialità e limiti. Diverse analisi retrospettive suggeriscono che l identificazione di mutazioni tumorali nel cfdna è comparabile con i risultati ottenuti dalla biopsia. Uno dei primi studi retrospettivi effettuato su 34 campioni di pazienti, ha dimostrato il 100 per cento di concordanza tra il cfdna e il tessuto di carcinoma mammario per le mutazioni nel gene PIK3CA. 12 In uno studio di fase 2 che ha incluso tutte le tipologie di tumore, delle 29 mutazioni identificate mediante NGS nel tessuto bioptico, 28 (il 97%) sono state identificate sempre con NGS nei corrispondenti campioni di cfdna. 15 La biopsia liquida basata sul cfdna è stata utlizzata anche per rilevare l insorgenza di cloni resistenti, che riducono il tempo di remissione in pazienti trattati con terapie target, e per correlare i risultati ottenuti dal cfdna con l outcome clinico dei pazienti. Con una identificazione precoce, la resistenza al farmaco potrebbe essere potenzialmente affrontata modificando la terapia, mentre il trattamento potrebbe essere ridotto o interrotto prima in quei pazienti con una risposta più rapida. In diversi studi retrospettivi, sono state identificate mutazioni che conferiscono resistenza al trattamento in campioni di cfdna, ottenuti mediante biopsia liquida, ben prima che la progressione della malattia fosse evidenziata dalla diagnostica per immagini. 2,7,17 In uno studio condotto su campioni di plasma da 57 pazienti affetti da NSCLC e 22 controlli negativi, si è osservato una correlazione tra la riduzione del livello di mutazioni EGFR nel cfdna con la risposta precoce al trattamento con un inibitore della tirosin- chinasi. 16 In uno studio effettuato su 218 pazienti con NSCLC in fase avanzata, l analisi multivariata ha rivelato una significativa associazione tra concentrazioni basali elevate di cfdna e la sopravvivenza globale, indipendentemente dal performance status basale, lo stadio della malattia, l età, e la percentuale di risposta. 21 Numerosi studi retrospettivi hanno dimostrato che la recidiva di malattia dopo resezione può essere scoperta più precocemente mediante biopsia liquida che con la diagnostica per immagini, spesso con molti mesi di anticipo; inoltre, la mancanza di DNA rilevabile mediante biopsia liquida dopo la resezione spesso correla con migliore prognosi. 4,7,9,18,20
Il futuro della biopsia liquida Studi clinici come questi dimostrano le grandi potenzialità della biopsia liquida, ma per ottenere un test diagnostico sicuro e affidabile è necessario superare diverse criticità. Per competere con le opzioni attualmente disponibili e assicurare ai pazienti il trattamento più appropriato, un test in biopsia liquida deve dimostrare di avere un elevato valore predittivo positivo. Allo stesso tempo il test deve possedere una buona sensibilità e un eccellente specificità per ottenere una percentuale accettabile di falsi positivi e falsi negativi. Queste caratteristiche tecniche devono essere valutate in grandi studi clinici prospettici. D altro canto, la biopsia liquida offre una straordinaria opportunità di comprendere meglio lo sviluppo della patologia metastatica e di chiarire ulteriormente le vie di trasduzione del segnale implicate nell invasività cellulare e nella competenza metastatica. In definitiva, questi test potrebbero essere utilizzati nella diagnosi oncologica e nel monitoraggio della terapia1, rivoluzionando la cura del tumore e fornendo ai medici un accesso rapido alle informazioni di tipo molecolare già al momento della diagnosi, con un potenziale impatto sulla decisionalità terapeutica. Verosimilmente la biopsia liquida svolgerà un ruolo di primo piano nella implementazione e nel monitoraggio di quelle terapie che sono associate all utilizzo di biomarcatori predittivi della risposta nella patologia metastatica. Pertanto consentirà di avere un test più rapido, meno invasivo e più robusto per una gestione ottimale del trattamento dei pazienti oncologici.
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Biopsia Liquida: l evoluzione della terapia personalizzata
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