ACETO DI VINO PRODUZIONE DI ACIDI ORGANICI (INDUSTRIA ALIMENTARE) L aceto di vino è un prodotto di largo consumo nell uso domestico come condimento e nell industria alimentare (preparazione di sottaceti, maionese, mostarda, ecc.). Contiene il6-12%diacidoaceticoch 3 COOH. La fermentazione acetica si basa sulla reazione: CH 3 CH 2 OH + O 2 2 CH 3 COOH+H 2 O Promossa dall attività degli acetobatteri(acetobacter aceti). 1
L operazione viene condotta in reattori a percolazione in legno con batteri supportati su trucioli o con colture sommerse in fermentatori di acciaio agitati meccanicamente. 2
Fermentazione in coltura superficiale Si lavora con soluzioni alcoliche circa al 12%, con temperatura variabile dall alto in basso da 29 a 35 C, per 3 giorni. Le rese sono intorno all 80-90% del teorico. Rispetto alla fermentazione in coltura sommersa si ha una minore produttività, ma si ottiene un prodotto qualitativamente migliore. 3
Fermentazione in coltura sommersa Nelle colture sommerse si lavora a 30 C, ottenendo rese anche del 98%. Particolarmente importante è l areazione che deve essere omogenea ed efficace, poiché la carenza di O 2 anche solo perpochisecondipuòportareallamortedi1/3deibatteri. Il fermentatore cavitator è costituito da un contenitore munito di un refrigerante a serpentino per la regolazione della temperatura. Al centro del fermentatore è posto un rotore cilindrico cavo, aperto superiormente ed inferiormente. Quando il rotore è in movimento, dalla parte superiore viene riscaldato il liquido (in miscela con aria) che, scendendo lungo il rotore, viene proiettato sul fondo del contenitore in tutte le direzioni. L aria in miscela con il liquido si fraziona in numerose bolle che, trascinate dal flusso aerano l intera massa in fermentazione. 4
Il cavitator funziona in modo discontinuo (il liquido fermentato che rimane sul fondo agisce da inoculo per la successiva fermentazione) o continuo. L aceto viene chiarificato per centrifugazione o filtrazione e quindi pastorizzato. Qualsiasi liquido contenente etanolo può subire la fermentazione acetica. Nei paesi produttori di vino, come l Italia e la Francia, quasi tutto l aceto è prodotto dal vino, spesso da partite acidule. 5
ACIDO CITRICO L acido citrico è largamente usato come acidificante ed aromatizzante nelle bibite, nei succhi di frutta, nei dolci e nelle marmellate. L acido citrico è uno degli acidi del ciclo di Krebs. Come microrganismi si utilizzano alcuni tipi di muffe, quali ceppi mutanti di Aspergillus niger. 6
Le migliori rese si ottengono con terreni a base di saccarosioo fruttosio, anche se è possibile utilizzare materiali amidacei, tenendo conto del fatto che l aspergillusnigerdispone anche di amilasi. L inoculo è preparato facendo germinare le spore a 32 C in un prefermentatore su melassa (sottoprodotto della fabbricazione dello zucchero, ricco in saccarosio), con l aggiunta di ioni cianuro per indurre la formazione di micelio in forma di dischetti di diametro inferiore al millimetro (un micelio poco compatto, filamentoso e poco ramificato da risultati insoddisfacenti). 7
Per le fermentazioni sommerse si usano reattori agitati aerati o tipo air-lift. Il terreno di coltura è costituito da melassa deionizzata (per eliminare gli ioni Fe 2+ e Mn 2+ ), con l aggiunta di KH 2 PO 4 e sali di CueZn. L ammoniaca (fonte di azoto) viene aggiunta durante la fermentazione per mantenere il ph a 2-3.5. La fermentazione è portata avanti a 27-33 C per 5-14 giorni. Nei primi giorni si ha un forte sviluppo di micelio, in seguito si accumula l acido citrico. 8
Al termine della fermentazione si filtra il micelio, dopo aver aggiunto una piccola quantità di latte di calce per precipitare l eventuale acido ossalico(cooh-cooh) formatosi. L acido citrico viene quindi separato dalla soluzione filtrata per aggiunta di idrato o carbonato di calcio, che si separa per filtrazione. Il citrato di calcio (o dicitratodi tricalciotetratridrato) è il sale di calcio dell'acido citrico. C 12 H 10 Ca 3 O 14 x 4 H 2 O Il citrato di calcio, disperso in acqua, viene trattato con acido solforico: si libera l acido citrico(solubile) e precipita il solfato di calcio. L acido citrico viene infine cristallizzato dalla sua soluzione, previa decolorazione e deionizzazione. 9
ACIDO LATTICO L acido lattico è diffusamente usato per l acidificazione delle salamoie, delle zuppe e delle marmellate, e per la conservazione delle olive e dei sottaceti. Fermentazione omolattica A partire dal glucosio i batteri del tipo Lactobacillus, in condizioni anaerobiche formano l acido lattico: C 6 H 12 O 6 2 C 3 H 6 O 3 10
Come terreno di coltura si impiegano soluzioni di glucosio al 10-15% addizionato di malto (0.3-0.4%), (NH 4 ) 2 HPO 4 (0.25%), vitamine e CaCO 3 (10%, corpo di fondo), che contribuisce a mantenere il ph entro i limiti tali da non far arrestare la fermentazione: CaCO 3 (s) +2H + Ca 2+ + CO 2 +H 2 O Il reattore è agitato meccanicamente ed ha volume di 25-120 mc. Il terreno è inoculato con il lactobacillusprescelto (es. L. delbrueckii) e la fermentazione condotta per 3-6 giorni a ph 5.5-6.5 e temperatura 45-50 C. Il processo viene arrestato quando il contenuto di zucchero scende sotto lo 0.1%. 11
Il terreno esaurito è trattato a 82 C con latte di calce a ph 10, la miscela è quindi lasciata riposare finché la soluzione di lattato di calcio risulta limpida (chiarificazione). La soluzione separata dal sedimento, dopo eventuale decolorazione con carbone attivo, viene concentrata sotto vuoto a 70 C. Si aggiunge quindi acido solforico e si separa il precipitato di solfato di calcio, ottenendo acido lattico in soluzione. 12
PRODUZIONE DI AMMINOACIDI ACIDO GLUTAMMICO L interesse commerciale per l acido glutammico è in gran parte dovuto alla preparazione del glutammato monosodico, largamente usato per il sapore che conferisce ai cibi. L acido glutammico si forma per amminazione dell acido α-chetoglutarico(prodotto intermedio del ciclo di Krebs). 13
Equazione complessiva a partire da glucosio: C 6 H 12 O 6 + NH 3 + 1.5O 2 C 5 H 9 O 4 N+ CO 2 +3H 2 O 14
Il fermento comunemente usato è il Corynebacterium glutamicum. Il terreno di coltura è costituito da zucchero (5-20%), urea (NH 2 CONH 2 ), acqua di macerazione del grano o estratti di farina di soia; contiene anche sali di Ca, K ed Mg, ioni fosfato e solfato, elementi in tracce quali Mn, Fe, Zn e Co, biotina (vitamina). La fermentazione avviene in ambiente aerato, a 28-30 C per 24-48 ore, regolando il ph a circa 7.5 con aggiunta di NH 3. Si ottengono rese di 60-100g/L di glutammato ammonico. Al termine della fermentazione le cellule batteriche vengono separate, il terreno concentrato ed acidificato a ph 3.2 con separazione dell acido glutammico. 15
L-LISINA NH 2 -(CH 2 ) 4 -CH(NH 2 )-COOH L importanza commerciale della L-Lisina deriva dall essere uno degli amminoacidi essenziali per i mammiferi. Le proteine vegetali sono frequentemente carenti in uno o più amminoacidi essenziali, quindi una dieta primariamente o essenzialmente vegetale può richiedere un integrazione. Questo vale sia per le persone, sia per quegli erbivori che passano l inverno con una dieta limitata. 16
Come fermento sono normalmente usati ceppi mutanti del Corynebacterium glutamicum o di Brevibacterium flavum. Il terreno di coltura contiene glucosio (5%) e Sali (NH 4 Cl, KH 2 PO 4, MgSO 4,FeSO 4,MnSO 4 ). Spesso si fa uso di melassa di barbabietola in quanto, essendo ricca di biotina, favorisce l accumulo della lisina. La lisina si accumula nelle cellule e può essere liberata per trattamento con vapore. 17
ANTIBIOTICI Gli antibiotici vengono usati come farmaci antimicrobici, fungicidi, pesticidi, ecc., inibiscono la crescita e riproduzione di microorganismi e cellule viventi attraverso vari meccanismi: inibizione della sintesi del peptidoglicano, costituente della parete cellulare dei batteri. inibizione della sintesi delle proteine batteriche. inibizione della funzione degli acidi nucleici(dna, RNA). danneggiamento della membrana cellulare. 18
Gli antibiotici, derivanti dal metabolismo secondario di funghi o batteri, hanno nella fisiologia di questi organismi una funzione molto differenziata. Negli streptomiceti, batteri composti da un micelio vegetativo e da un micelio aereo contenente spore, la produzione di antibiotici avrebbe lo scopo di frenare la crescita degli altri batteri più semplici ed a sviluppo più rapido. In altri organismi, come muffe e lieviti, la produzione di antibiotici sembra legata a trasformazioni di metaboliti primari prodotti in eccesso. 19
In ogni caso, la produzione di antibiotici comporta una notevole richiesta di energia; esistono perciò dei limiti alla loro produzione, anche perché, oltre un certo valore, gli antibiotici inibiscono molte funzioni vitali dell organismo stesso. Per mezzo di trattamenti mutageni è stato possibile migliorare notevolmente la produzione. I ceppi produttori di antibiotici sono caratterizzati da una elevata variabilità e quelli capaci di elevate produzioni perdono facilmente questa proprietà. Pertanto, i processi sono normalmente di tipo discontinuo. 20
I processi fermentativi, aerobi, durano dai 5 ai 10 giorni, ma è nelle prime ore di crescita esponenziale che vengono create le condizioni, modificando opportunamente le condizioni di coltura, per ottenere buone rese. Nella seconda fase si dovrà invece indirizzare i microorganismi verso la maggiore produzione possibile di antibiotici. Esistono vari tipi di antibiotici: penicilline naturali, penicilline semisintetiche, cefalosporine naturali, cefalosporine semisintetiche, amminoglicosidi, tetracicline, macrolidi, rifamicine, ecc. 21
PENICILLINE Le penicilline sono prodotte da ceppi di Penicillium notatum, un caratteristico ascomicete (muffa) il cui micelio è suddiviso in cellule che formano una struttura ramificata. 22
le ricerche che portarono all'impiego della penicillina presero il via dalla scoperta compiuta da Alexander Flemingche a Londra, nel 1928, osservò che in una piastra di coltura contaminata da una muffa, la crescita batterica era inibita; così nacque la penicillina Gcapostipite di tutta la famiglia, usata ora solo come profarmaco per sintetizzare le nuove penicilline. 23
Le penicilline e gli antibiotici da esse derivate hanno in comune la struttura di base, formata da un anello β-lattamico a cui è legato un anello tiazolinico; sono perciò derivate dall acido 6- amminopenicillanico(6-apa): RCO = H 6-APA 24
Le penicilline inibiscono la sintesi del peptidoglicano. Il peptidoglicano (o mureina) costituisce uno strato nella parete cellulare dei batteri che è il principale responsabile della rigidità della cellula. La più importante difesa messa in campo dai batteri patogeni contro i β-lattamici è la produzione di β-lattamasi, che provoca l idrolisi del legame ammidico, rendendo inattiva la molecola (grazie a questo meccanismo la maggioranza degli stafilococchi è resistente alla penicillina G). Le penicilline, a seconda del gruppo prostetico R, presentano caratteristiche diverse sia di efficacia, sia di resistenza. 25
Le catene laterali possono essere introdotte in due modi: a) Per via biologica(penicilline naturali) in questo casi si aggiunge al terreno di coltura un precursore corrispondente al gruppo prostetico. b) Per via chimica(penicilline semisintetiche) usando degli enzimi di origine microbica capaci di rimuovere la catena laterale si ottiene l acido 6-amminopenicillanico. Questo viene poi fatto reagire con il cloruro acilico (RCOCl) corrispondente al gruppo prostetico che si vuole inserire. 6-APA 26
Produzione di penicillina G La penicillina G, pur non essendo più usata come antibiotico (a causa della elevata crescita della resistenza batterica a questo farmaco) viene ancora prodotta come materia prima per la fabbricazione delle penicilline semisintetiche. La penicillina G è prodotta da ceppi di Penicillium Chrysogenum mediante fermentazione aerobica in fermentatori discontinui muniti di agitazione, aerazione e raffreddamento (temperatura mantenuta sui25 C). Nella prima fase della produzione occorre dapprima far germinare le spore, normalmente conservate in terreno sterile disidratato o in soluzione acquosa a bassa temperatura. Le germinazione si fa avvenire prima in beute di 300-500 ml, contenenti terreno di vegetazione, oppure in un germinatoio, e si conclude in 36-40 ore. 27
Il terreno di coltura più usato è a base di corn steep (prodotto della macerazione in acqua dei residui lavorazione del mais) oppuresiusafarinadisoia. A questi terreni di base vengono aggiunti glucosio, melassa, olio di lardo, solfato d ammonio. Terminata la fase germinativa, l inoculo è trasferito nel fermentatore vegetativo, dove si realizza la prima fase della crescita del fungo a una temperatura di 24 C, con un ph tamponato a 6.5 con soda caustica. Dopo 1-2 giorni si passa alla fase produttiva vera e propria, inoculando un fermentatore produttore. La fase produttiva dura circa 150 ore. In questo tempo l andamento della fermentazione attraversa 3 fasi distinte: 28
1. Fase iniziale con sviluppo esponenziale della popolazione colturale, ma scarsa produzione di antibiotico. I microorganismi utilizzano dapprima come fonte di carbonio il glucosio e come fonte di azoto l ammoniaca libera, poi, esauriti questi, attaccano gli amminoacidi(il ph aumenta per la liberazione di ammine). 2. La crescita assume un andamento stazionario (idiofase) e la quantità di penicillina prodotta aumenta notevolmente (tra le 50 e le 120 ore). Durante la fase di produzione i microorganismi attaccano il lattosio che è idrolizzato lentamente a glucosio e galattosio. Durante questa fase vengono utilizzati come fonte di carbonio anche i grassi come l olio di soia, l olio di lardo, ecc. ed aggiunti anche agenti anti-schiuma. 29
3. Dopocirca120orediminuisconoiceppiingradodidareelevate produzioni ed i nuovi ceppi producono meno penicillina. Il processo viene interrotto dopo 150 ore. Durante la fermentazione è indispensabile l aggiunta di materie prime: corn steep, zuccheri (glucosio e lattosio) ed esteri dell acido fenilacetico (C 6 H 5 )-CH 2 -COOH che è un importante precursore della penicillina G ed è contenuto anche nel corn steep. Purtroppo, però, l acido fenilacetico è anche estremamente tossico per i miceli e quindi va aggiunto gradatamente durante il ciclo produttivo, per mantenerlo ad una concentrazione ottimale. La temperatura è mantenuta da 24 a 26 C, mentre il ph da 6.5 arriva alla fine della fermentazione a 7.2-7.4. 30
Terminato il processo, il micelio viene separato per filtrazione; l antibiotico si separa poi dal terreno di coltura per estrazione. Nell estrazione si sfrutta la solubilità della penicillina sotto forma acida (a ph 1.8-2) in solventi organici (acetato di butile) e sotto formadisalesodicoinacqua. Dopo successive estrazioni (raffinazione), la penicillina viene fatta cristallizzare sotto forma di sale potassico. 31
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Nell estrazione si sfrutta la solubilità della penicillina sotto forma acida (a ph 1.8-2) in solventi organici (acetato di butile) e sotto formadisalesodicoinacqua. 36
Produzione di penicilline semisintetiche Il metodo di produzione semisintetico prevede prima l idrolisi della penicillina G a 6-APA, per via fermentativa o chimica. Laprimaviaèlapiùusataepermettel idrolisidellegameacilico grazie alla presenza dell enzima penicillin-acilasi prodotto da alcuni attinomiceti (batteri filamentosi e ramificati) o da ceppi mutati del genere Escherichia coli. Il terreno di coltura, a base di corn steep, caseina ed NaCl, viene inoculato con il ceppo batterico. Dopo 24 ore circa, quando la produzione batterica si è sufficientemente ingrandita, si porta il pha7.5esiaggiungelapenicillinag. Si lascia incubare a 37-38 C per 16 ore circa, mantenendo il ph costante con l aggiunta di KOH (la reazione di idrolisi tende ad abbassare il ph per liberazione di acido fenilacetico). 37
Si precipita infine il 6-APA abbassandoil ph a 4.2 e si recupera per filtrazione. L acido prodotto è quindi fatto reagire con un cloruro acilico contenente la catena che si vuole legare alla penicillina: 38