The Yellow seminars at CSF 13 gen 2006 Dr. Maurizio Gelati SDS Neurobiologia e Terapie Neuroriparative/UPTC
ESC h-nsc 0-60 0-60 hours hours 9-16 9-16 weeks weeks
Human Neural Stem Cells (h-nscs), sorgenti Aborti spontenei e terapeutici; (Ref: Vescovi A, Parati E et al. Exp Neurol 1999;156:71-83) Bulbo olfattorio da adulto; (Ref: Pagano S et al. Stem Cells 2000;18:295-300) Corteccia frontale e temporale; (Ref: Arsenijevic Y et al. Exp Neurol 2001;170:48-62) Sangue?
CELLULE STAMINALI 1. Deve essere una cellula indifferenziata, ovvero non deve esprimere markers tipici di cellule differenziate 2. Deve essere responsiva ad uno o più fattori mitogeni proliferando in risposta a questi. 3. Deve essere in grado di autorinnovarsi oltre il tempo di vita dell organismo da cui viene prelevata 4. Deve essere in grado di generare un elevato numero di cellule, anch esse indifferenziate, attraverso una transiente amplificazione dei progenitori 5. Deve essere in grado di mantenere il suo multilineage nel tempo 6. Deve essere in grado di rispondere attivamente in caso di lesione del tessuto (ferita o malattia) generando progenie differenziata organo-specifica
Isolation of h-nscs Brain or Spinal Cord NSC Committed Progenitor Cells Other Kinds of Cells Tissue dissected into small pieces Enzymatic and mechanical dissociation Rinse Monocellular Suspension Serum-free medium with EGF and bfgf 3-7 days Pure population of NSCs Repeated passages Primary sphere + Dissociation ( passage ) and plating + + 5-10 days Death Differentiation Secondary sphere Death
CURVE DI CRESCITA: Numero di cellule Ctrl Numero di cellule DS 9000000 8000000 7000000 6000000 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0 ctr DS p0 p1 p2 p3 p4 p5 p6 p7 p8 p9 p10 p0 2.000.000 2.000.000 p1 1.199.000 515.000 p2 1.170.000 321.250 p3 1.531.250 373.333 p4 1.942.857 532.500 p5 2.542.857 395.000 p6 3.324.000 450000 p7 3.858.000 440.000 p8 3.766.000 540.000 p9 4.642.000 590.000 p10 5.616.000 380.000 Conta delle cellule. I dati rappresentano le medie delle 5 colture con 2*10 6 cellule, test statistico t student p< 0.05
Neurosfere
a A B c b C D
Ultrastructural Images 1 m-rna sinthesys A B
Ultrastructural Images 2 Lysosomes Cell to cell junction a a b
a b A B MITOSI C
MITOSIS c C d d D E F G f e e
20 x 2 d 3 d 4 d 6 d 7 d 9 d 10 d 16 d
Differentiation of h-nscs Neurosphere NSCs or neurospheres seeded on Matrigel or Laminin in 2-5% FBS without EGF and bfgf NSCs obtained by neurosphere dissociation 2-12 days in vitro Oligodendrocyte Astrocyte Neuron
Oligodendrociti (3-5%) Caratterizzazione fenotipica Astrociti Neuroni (40-60%) (15-30%) stem-cells.jpg A 5-15% Cellule Indifferenziate B C
Fischer 344 rat Thoracic aorta Aortic rings Floating gel culture kept in serum-free EBM at 37 C Embedded in collagen gel
Tipologie di DANNO CEREBRALE non tumorale Perdita di uno specifico stipite neuronale Perdita di tutti gli stipiti neuronali in una area delimitata Alterazione difffusa di tutto il cervello
Morbo di Parkinson Singoli neuroni dopaminergici della sostanza nera Pars Compacta
Ictus Ischemico Perdita di tutti gli stipiti neuronali in una area delimitata Barriera Emato Encefalica
Terapia cellulare sperimentale Per poter effettuare Trial clinici sperimentali che coinvolgano l utilizzo di cellule è necessario recepire la Direttiva Europea 2001/83/EC sulla produzione farmaceutica in cgmp
Definizione di GMP GMP: Good Manifacturing Practise costituiscono l insieme di tutte le procedure che hanno lo scopo di assicurare che i prodotti (di qualunque genere come farmaci, cellule etc.) siano fabbricati e controllati in modo da soddisfare gli standard di qualità appropriati all uso cui sono destinati e generalmente appropriati per l utilizzo in terapia su pazienti (The rules governing medicinal products in the European Union Vol.4 Annex 1,13,15)
Se il prodotto è rappresentato da cellule, l obiettivo finale è quello di garantire la sicurezza e la specificità del prodotto. In particolare: 1) verifica del grado di purezza delle cellule 2) controllo della sicurezza biologica (no contaminazione) 3) controllo del mantenimento delle caratteristiche fisiologiche: - alterazioni del corredo cromosomico - perdita del fenotipo ed insorgenza di fenotipo neoplastico 4) rintracciabilità del campione - numero della preparazione - storia del campione (derivazione, metodo di coltura, etc) - data di congelamento - modalità di congelamento - data di scongelamento
disporre di una struttura idonea sia dal punto di vista logistico che tecnico operativo disporre di procedure operative,flussi per la manipolazione/gestione di determinati prodotti
SITE MASTER FILE (SMF): DOCUMENTAZIONE NECESSARIA Documentazione riguardante: informazioni generali sulla struttura informazioni inerenti edificio/attrezzature informazioni sul personale (organigramma) VALIDATION MASTER PLAN (VMP): Documentazione riguardante: descrizione dei flussi, dei processi e dei CQ associati descrizione del flusso del materiale/personale procedure per pulizia attività di convalida/qualifica (insieme di un programma prestabilito di verifiche finalizzato a garantire sistematicamente e con un elevato grado di sicurezza l ottenimento di un prodotto con specifiche e qualità predeterminati garantire che i sistemi e le apparecchiature che possono influire sulla qualità del prodotto, siano qualificati e periodicamente controllati)
Sviluppi/Progetti in corso UPTC Adeguamento cgmp della Neural Stem Cell Bank Sviluppo di un trial clinico sperimentale per l immunoterapia dei glioblastomi in collaborazione con l unità di Neuro-oncologia Sperimentale (Dr. G.Finocchiaro). Produzione DCs secondo cgmp
Prof. EA Parati MD G Alessandri PhD S Frigerio PhD Neuropatologia e Terapie Neuroriparative A Ottolina M Figus A Cristini G Invernici S Pogliani A Smith Unità Produttiva Terapie Cellulari Istituto Nazionale Neurologico C.Besta, Milano