Propagazione e conservazione in vitro di cultivar di vite (Vitis vinifera L.) autoctone al fine di allestire una collezione di materiale. C. Damiano, B. Lucchesi, A. Frattarelli Riassunto Il notevole sviluppo della viticoltura, in Italia, ha permesso di individuare e selezionare vitigni adatti alla coltivazione nelle diverse regioni, aumentando, però, in alcune aree, il rischio di perdere materiale genetico a causa dell abbandono della coltivazione di alcune varietà, che rappresentano un patrimonio locale da salvaguardare. Per questa ragione è in corso di allestimento una collezione di cultivar di vite, giudicate particolarmente interessanti nella viticoltura laziale, tramite la tecnica della propagazione in vitro. La sterilizzazione ha limitato notevolmente la fase di allestimento delle colture. Di contro, la ripresa vegetativa degli espianti sterili ha dato degli ottimi risultati. Inoltre la bassa concentrazione di BAP (6-benzilaminopurina) utilizzata, ha ridotto pressoché al nulla la formazione di tessuto indifferenziato (callo). Per la moltiplicazione degli espianti, è stata utilizzata l auxina IBA (acido indolbutirrico) che favorisce la formazione e l allungamento dei germogli e che induce anche la formazione di radici, consentendo così di eliminare la fase di radicazione. Il materiale può essere conservato per brevi periodi (60 giorni) in frigo, ma per una conservazione più a lungo termine è necessario utilizzare la crioconservazione (congelamento in azoto liquido). Abstract The remarkable development of viticulture in Italy, has allowed to identify and select vines that are suited to each specific region, yet increasing the risk of loosing genetic diversity as a result of a loss in cultivars variety. In order to preserve these cultivars, a collection of vines from Lazio is being established, using in vitro propagation. Sterilization was a limiting factor in cultures establishment, while vegetative re-growth of sterile explants gave excellent results. Different kind of media were used, some with very small concentrations of BA, that lowered the risk of callus formation, and others with IBA. This hormone also forces plants to produce roots while propagating, thus eliminating the previously required root phase. Preservation of grapevines is possible at low temperatures (5 C) for brief periods, i.e. no more than 60 days, but cryopreservation proved to be the only way of preserving material for longer periods. Parole chiave: Biotecnologie, crioconservazione, micro-taleaggio, selezione clonale. Keywords: Biotechnologies, cryopreservation, microcuttings, clonal selection. 1. Introduzione Esistono molte evidenze sperimentali che dimostrano come le colture in vitro stiano acquisendo una larga importanza nella pratica vitivinicola, in particolare per quegli aspetti che riguardano la produzione e conservazione dei vitigni in sanità (esenti da virosi e fitoplasmi), la produzione rapida in vitro delle piante madri, sia portinnesti che varietà, la manipolazione genetica non invasiva e l ingegneria genetica che introduce DNA ricombinante.
Due sono le modalità che vengono oggi applicate alla propagazione in vitro dei vitigni: la moltiplicazione per meristemi preformati e la moltiplicazione per rigenerazione avventizia. La rigenerazione avventizia presenta un elevato rischio di indurre variazioni somaclonali, che alterano l omogeneità genetica del materiale e, di conseguenza, la corrispondenza alla varietà. Per questo programma ci si è avvalsi esclusivamente del protocollo di moltiplicazione per rigenerazione ascellare (meristemi preformati). I primi metodi di propagazione rapida dei cloni di vite sono stati proposti già molti anni fa (Barlass et al., 1978, Cossio, 1981). La selezione clonale per l ottenimento di materiali virus esenti, con metodi tradizionali (taleaggio ed innesto), porta spesso ad ottenere solo pochissimi individui (a volte un solo esemplare) da utilizzare come fonte di materiale di propagazione e questo, spesso, non permette di soddisfare in breve tempo la richiesta del mercato, specialmente di aree tipiche. Di conseguenza, lo sviluppo della propagazione in vitro viene considerato una tecnica avanzata e innovativa per produrre in grande quantità piante madri da vivai di elite. Deve essere evidenziato, inoltre, che tali materiali posseggono un alto potenziale di produzione di talee ed un più pronunziato potere di radicazione delle talee stesse; ciò appare altamente vantaggioso per quei portinnesti che presentano una minore capacità moltiplicativa. In questo ambito è stata allestita una collezione in vitro di varietà locali di vite, selezionate per adattabilità alla coltivazione in base al clima e al tipo di terreno (Costacurta et al. 2003). Inoltre, gli espianti propagati in laboratorio sono stati conservati a basse temperature confrontando due diversi metodi: la crescita rallentata in frigorifero (5 C) e la tecnica del congelamento in azoto liquido o crioconservazione (Benelli et al., 2003; Wang et al., 2001). I cloni utilizzati, giudicati particolarmente interessanti nella viticoltura laziale e provenienti da cultivar locali, sono stati: l Aleatico, il Bellone, il Cesanese d Affile, il Procanico, il Trebbiano Verde e l Ottonese. 2. Materiali e Metodi 2.1 Propagazione Sono state utilizzate, come espianti iniziali, gemme ascellari di vite (Vitis vinifera L.) delle cv Aleatico, Bellone, Cesanese d Affile, Procanico, Trebbiano Verde e Ottonese prelevate da tralci di piante coltivate in pieno campo. Gli agenti sterilizzanti utilizzati sono stati alcool al 70%, NaOCl 0.8% (Cloro attivo) e Na mertiolato (C 9 H 9 HgNaO 2 S) 0.05% (Tab. 1). Le prove sono state condotte variando il tempo di esposizione degli espianti agli agenti sterilizzanti (15, 20, 25 minuti). Sono stati provati diversi terreni per ogni fase della propagazione (Tab 2). Le gemme prelevate in ambiente asettico sono state poste sui terreni di coltura descritti in tabella ed allevate in camera di vegetazione con un fotoperiodo di 16 ore, temperatura di 24±1 C ed intensità luminosa di 37.5 μe m -2 s -1 (3000 lux). I nuovi germogli, raggiunta la grandezza di 1 o 2 cm, sono stati trasferiti anch essi sui substrati descritti, utilizzando due diverse metodologie di propagazione: per gemme ascellari e per micro-taleaggio dei germogli (Singh et al. 2004). Per la radicazione delle piantine propagate per gemme ascellari sono stati confrontati due terreni: macroelementi, microelementi e vitamine secondo MS (Murashige e Skoog, 1962); saccarosio 2 %; IBA 1 mgll -1 macroelementi, microelementi e vitamine secondo QL (Quoirin et al., 1977); saccarosio 2 %; IBA 1 mgl -1. Per quanto riguarda le piantine propagate per micro-taleaggio, invece, non è stato necessario utilizzare un terreno diverso per la radicazione in quanto questa si verificava già nel mezzo di coltura. 2.2 Conservazione Crescita rallentata in frigorifero: per valutare la resistenza al freddo delle piantine coltivate in vitro, sono state effettuate diverse prove variando il tempo di permanenza in frigo (5 C) del materiale (Cicciotti et al. 1997). In particolare, gli espianti sono stati conservati in frigo per 60, 90 o 120 giorni.
Congelamento in azoto liquido (crioconservazione): gli apici di vite della lunghezza di 0.3 mm prelevati da piante coltivate in vitro sono stati posti sul substrato di propagazione (Tab. 2 terreno d) in piastre Petri per 24 ore. Quindi si è proceduto al loro incapsulamento in un terreno con macroelementi MS arricchito di sodio alginato al 3%, ma senza CaCl 2. La procedura consisteva nel versare la miscela di mezzo di coltura ed alginato in una piastra Petri da 90 mm e immergendovi gli apici. Successivamente, gli apici venivano prelevati insieme all alginato con una pipettatrice e fatti cadere a gocce all interno un becker contenente lo stesso substrato di moltiplicazione, più 100 mm di CaCl 2. Dopo circa 30' di immersione l'alginato, solidificandosi, inglobava gli apici (Fig. 1). In seguito è stata eseguita la prima coltura di disidratazione per osmoporazione degli espianti in un terreno di coltura con concentrazioni di saccarosio crescenti (0.3M, 0.5M, 0.75M, 1.0M, 1.25M) e per diversi giorni (1, 3, 5, 7) così da trovare le combinazioni migliori per la ricrescita. Si è poi proceduto al disseccamento degli apici in vasi con silica gel, utilizzando tempi crescenti di trattamento (4, 6, 8, 9, 14, 20, 24 e 30 ore), e, successivamente, alla loro immersione in azoto liquido a 196 C. Infine gli apici, una volta scongelati a temperatura ambiente, sono stati trasferiti sul terreno di propagazione e dopo 20 giorni è stata rilevata la percentuale di ricrescita. 3. Risultati e Discussione 3.1 Propagazione L efficacia della sterilizzazione ha limitato notevolmente la fase di allestimento delle colture, infatti è apparsa fortemente dipendente dalla varietà, dal periodo del prelievo degli espianti in campo, dalla grandezza della gemma iniziale e dallo stato fitosanitario del materiale di partenza. Inoltre la percentuale di espianti inquinati è stata condizionata in maniera evidente dal lasso di tempo intercorso tra il prelievo in campo e la sterilizzazione (Tab 3A). Dall esperienza si deduce che il protocollo ideale richiederebbe che le gemme fossero sterilizzate e allestite nella stessa giornata del prelievo o al massimo entro 2-3 giorni. Inoltre, solo l impiego della doppia sterilizzazione (NaOCl per 20 seguito dal Na mertiolato per altri 20 ) ha permesso di ottenere risultati soddisfacenti (Tab 3B). Il 79% delle gemme sterili ha iniziato a rigonfiarsi e ad allungare le prime foglioline. Sono state osservate differenze nella risposta all allestimento delle colture axeniche tra le cultivar, infatti mentre alcune di esse non hanno manifestato stress fisiologici particolari (Cesanese d Affile, Procanico e Trebbiano Verde), nelle altre sono stati spesso osservati fenomeni di iperidricità o di ossidazione (Aleatico, Bellone e Ottonese). Il terreno utilizzato per l allestimento (Tab. 2 terreno b), si è dimostrato molto funzionale nelle prime due subculture (20-40 giorni), infatti non si sono mai verificati fenomeni di formazione di callo, cosa che invece avveniva lasciando le piantine su questo terreno per periodi più lunghi. Questo è in accordo con quanto sostenuto da molti vivaisti, che si sono dimostrati prudenti verso le piante micropropagate a causa delle possibili mutazioni imputabili principalmente all impiego delle citochinine nel substrato di coltura. Dalle numerose prove sperimentali effettuate è emerso che effettivamente l uso delle citochinine nel terreno favorisce la formazione di tessuto indifferenziato (callo) che è il precursore della formazione di germogli avventizi. Per evitare questo problema è stato studiato un nuovo sistema di propagazione in vitro nel quale non sono state utilizzate le citochinine, ma solo l IBA (Tab. 2 terreno d), auxina normalmente impiegata anche nel taleaggio in vivo. Il sistema di moltiplicazione sperimentato, quindi, è stato quello del microtaleaggio (Fig. 2) che consiste nel fare semplicemente allungare la piantina e suddividerla poi in 3 o 4 parti. Inoltre questa tecnica permette di ottenere piantine già radicate con un conseguente risparmio economico e di tempo. Quindi ad una prima fase, molto rapida (30 giorni) di allestimento del materiale vegetale sul terreno con citochinine (Tab 2 terreno b) è seguita poi la vera e propria propagazione su terreno contenete solo auxina (Tab 2 terreno d) come fitormone. Questo ha permesso di allestire con successo le gemme, dal momento che i substrati contenenti IBA, da prove effettuate, risultano inefficaci nei primi stadi dell accrescimento, indebolendo i germogli fino alla morte degli stessi.
La percentuale di piante ambientatesi dopo 30 giorni dal trasferimento in serra è stata in media del 73%. Le cultivar che hanno presentato maggiori difficoltà sono state il Procanico e l Ottonese. 3.2 Conservazione Crescita rallentata in frigorifero: i risultati ottenuti hanno evidenziato la scarsa resistenza alla conservazione a basse temperature di queste cultivar, infatti solo le piante mantenute in frigo per 60 giorni sono risultate vitali, mentre periodi più lunghi hanno determinato la comparsa di fenomeni quali ossidazione dei tessuti e necrosi degli apici. Congelamento in azoto liquido (crioconservazione): gli espianti di tutte le cultivar hanno reagito positivamente alla tecnica di incapsulamento/disidratazione. La combinazione ottimale è stata quella con 0.75M di saccarosio per un giorno di coltura in quanto l alta percentuale di ricrescita era supportata dalla rapida ripresa vegetativa. In generale, nelle combinazioni con 5 e 7 giorni di coltura in saccarosio (con concentrazione superiore a 1M) la ricrescita era molto modesta o nulla (Tab. 4). Riguardo alla disidratazione in gel di silice, con il passare delle ore (da 0 a 30) la percentuale di acqua contenuta negli espianti diminuiva passando dal 84% al 15 %. Dai rilievi effettuati è stato riscontrato che quando il disseccamento era breve (4-6 ore), gli espianti contenevano troppa acqua al loro interno e, una volta congelati, si formavano cristalli di ghiaccio che danneggiano le pareti cellulari. Viceversa quando il disseccamento era eccessivo (24-30 ore) gli apici, contenendo poca acqua, resistevano al congelamento (erano vitali), ma non riuscivano poi a ricrescere. E' stato quindi necessario ricercare i giusti tempi di disidratazione (Fig. 3) per gli apici (acqua contenuta intorno al 20%), così da consentirne la ricrescita (Fig. 4). Il tempo di disidratazione che ha dato la più alta percentuale di ricrescita è stato quello di 9 ore, corrispondenti ad un contenuto di acqua del 19 %). In tabella 5 sono riportate le percentuali di crescita per tutte le cultivar utilizzate. 4. Conclusioni Il protocollo per la propagazione e crioconservazione della vite messo a punto in questo progetto si è dimostrato molto funzionale, inoltre appare essere in sintonia con le richieste dei vivaisti e degli utenti finali. Sarebbe auspicabile integrare il lavoro svolto finora con analisi specifiche, utilizzando anche per la vite le tecniche della proteomica, al fine di verificare la stabilità del materiale sia dopo la propagazione in vitro che dopo la crioconservazione in azoto liquido.
Tabella 1 Protocollo di sterilizzazione Table 1 Sterilization protocol Protocollo di sterilizzazione 1. Lavaggio delle gemme con sapone Lysoform (soluzione liquida di sale quaternario di ammonio) per 30 2. Risciacquo in acqua corrente per 10 3. Immersione in alcool etilico al 70% per 1 4. Risciacquo con acqua sterile 5. Trattamento delle gemme con ipoclorito di sodio + 2 gocce di bagnante Tween-80 6. Risciacquo con acqua sterile 7. Trattamento delle gemme con mertiolato di sodio (C 9 H 9 HgNaO 2 S) + 2 gocce di bagnante Tween-80 8. Risciacqui con acqua sterile (per tre volte) Tabella 2 Terreni utilizzati nella propagazione della vite Table 2 Propagation media a b c d Macro QL QL QL QL Micro MS MS MS MS Vitamine MS MS MS MS Saccarosio (%) 3 3 3 3 Ormoni (mgl -1 ): BAP 0.4 0.4 0.8 --- IBA --- --- --- 0.2 GA 3 0.1 ph 5.7 5.7 5.7 5.7 Tabella 3A Percentuale di espianti sterili e vitali in relazione al terreno di coltura e al tempo intercorso tra il prelievo in campo e la sterilizzazione Table 3A Percentage of sterile explants in relation to medium and to the number of days gone between collection and sterilization Aleatico Bellone Cesanese d Affile Procanico Trebbiano Verde Ottonese Tempo dal prelievo (giorni) 3 7 15 3 7 15 3 7 15 3 7 15 3 7 15 3 7 15 Terreno di coltura a 48 27 0 61 38 10 64 48 20 55 36 12 62 33 14 43 18 0 b 58 32 0 61 44 10 79 60 24 66 41 19 73 41 20 51 24 0 c 34 11 0 29 11 3 47 29 12 34 20 4 45 19 4 31 14 0 d 23 0 0 30 0 0 37 14 0 26 10 0 21 0 0 14 0 0
Tabella 3B Percentuale di espianti sterili e vitali in relazione al terreno di coltura e al tempo di sterilizzazione Table 3B Percentage of sterile and vital explants in relation to medium and sterilization times Procanico Ottonese Tempo di sterilizzazione (minuti) Aleatico Bellone Cesanese d Affile Trebbiano Verde 15 20 25 15 20 25 15 20 25 15 20 25 15 20 25 15 20 25 Terreno di coltura a 31 48 28 42 61 33 47 64 40 36 55 28 44 62 36 29 43 21 b 43 58 37 47 61 38 62 79 55 48 66 41 59 73 42 38 51 24 c 21 34 11 14 29 5 28 47 14 18 34 0 33 45 17 16 31 4 d 5 23 0 12 30 3 16 37 5 5 26 5 11 21 3 0 14 0 Tabella 4 Effetti della disidratazione con saccarosio su apici di vite cv Cesanese di Affile Table 4 Dehydration effects on cultivar Cesanese di Affile Durata trattamento (giorni) Concentrazione 1 3 5 7 saccarosio (M) 0.3 Ricrescita (%) 100 100 100 100 4 4 4 6 0.5 Ricrescita (%) 100 100 100 100 4 4 4 6 0.75 Ricrescita (%) 100 100 90 90 6 6 6 6 1.0 Ricrescita (%) 90 50 18 10 7 7 14 14 1.25 Ricrescita (%) 40 37 33 0 7 8 14 - Tabella 5 Percentuali di ricrescita dopo il congelamento a -196 C con disidratazione in saccarosio 0,75 M per un giorno Table 5 Regrowth percentage after dehydration with succrose 0,75M for 1 day and freezing Cultivar Disseccamento in gel di silice (ore) Acqua contenuta (% peso fresco) Aleatico Bellone Cesanese d Affile Procanico Trebbiano Verde Ottonese 0 84 0 0 0 0 0 0 4 28 0 0 0 0 0 0 6 23 0 0 0 0 0 0 8 20.3 37 43 55 46 39 30 9 20.1 39 44 61 52 53 36 14 19 31 36 41 41 28 19 20 18 0 0 0 0 0 0 24 17 0 0 0 0 0 0 30 15 0 0 0 0 0 0
Figura 1 Apici inglobati in arginato di sodio Figure1 Apices in sodium arginate Figura 2 Tecnica del micro-taleaggio Figure 2 Microcuttings technique
Figura 3 Curva di disidratazione in vite Figure 3 Dehydration curve in grape Figura 4 Fasi della ricrescita in apici di vite cv Trebbiano Verde Figure 4 Regrowth phases in Trebbiano Verde apices
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