Scuola Superiore Medico-Tecnica Locarno Formazione tecnico in analisi biomediche Lavoro di Stage Correlazione tra ADVIA e striscio manuale Lavoro di stage di Patrick Carinci TAB2 ANNO 2012
Sommario Introduzione... 3 Principi di analisi dell ADVIA 120... 4 Strisci manuali... 6 Obiettivo... 7 Attività e metodi... 7 Risultati... 8 Discussione... 9 Conclusione... 9 Bibliografia... 9 Indice delle figure Figura 1: ADVIA 120... 3 Figura 2: Grafico della perossidasi... 4 Figura 3: Grafico dei basofili... 5 Figura 4: Metodo per strisciare un vetrino di sangue... 6 Figura 5: Striscio manuale visto al microscopio... 6 2
Introduzione Sto svolgendo attualmente il mio stage presso l Ospedale regionale di Bellinzona e Valli, in specifico nel reparto di ematologia vi sono rimasto per tre settimane, qui si svolgono diverse analisi, ma la principale è sicuramente l analisi delle cellule presenti nel sangue. Quest analisi è indispensabile per comprendere lo stato del sangue del paziente e per diagnosticarne eventuali malattie e problemi. Per questa analisi viene utilizzato come metodo principale il sistema ematologico ADVIA, utilizzato da tutti gli ospedali dell EOC, ma nel caso la macchina dia dei risultati dubbi si deve sempre e comunque avere un metodo manuale di verifica, e questo consiste nel classico striscio manuale che viene effettuato dal TAB in caso di risultati dell ADVIA specifici. Nell ente ospedaliero cantonale si utilizza il sistema ematologico ADVIA 120, è stato deciso di utilizzare in tutti i laboratori dell ente lo stesso apparecchio in modo da garantire coerenza dei risultati ai pazienti sia se essi vengon ricoverati a Bellinzona sia se vengono ricoverati a Lugano. L ADVIA 120 è un sistema ematologico prodotto dalla ditta Siemens. Figura 1: ADVIA 120 3
Principi di analisi dell ADVIA 120 Citometria di flusso Le cellule vengono analizzata utilizzando il principio della citometria a flusso. Ciascuna cellula viene analizzata singolarmente in un flusso costante, minimizzando il rischio di sovrapposizione. La conta totale e differenziale dei bianchi viene effettuata identificando ciascuna cellula sulla base della dimensione e delle proprietà dell' assorbimento della luce. Il numero esatto delle cellule all'interno di ciascun gruppo omogeneo viene contato. Le diverse caratteristiche cellulari vengono catturate grazie alle soglie mobili. La Perossidasi E' la metodica principale di ADVIA 120, ed inoltre fornisce una conta secondaria totale delle cellule bianche. Questa conta di backup funge da Controllo di Qualità interno per il monitoraggio dell'integrità del campione che si sta analizzando in quel momento. La reazione citochimica è una metodica a due stadi che utilizza l'enzima mieloperossidasi intracellulare per la differenziazione cellulare utilizzando parametri dimensionali e di colorazione. Le cellule vengono analizzati dopo l' aggiunta di substrato con enzima perossidasi. L'assorbimento di luce bianca dalla sorgente a tungsteno è una misura dell'intensità della reazione con perossidasi: i neutrofili, i monociti, gli eosinofili sono positivi alla perossidasi, mentre i linfociti ed i basofili sono negativi. In aggiunta al differenziale standard delle cinque popolazioni, ADVIA 120 è in grado di refertare la popolazione denominata LUC cells. Si tratta di cellule che lo strumento non è in grado di differenziare. Figura 2: Grafico della perossidasi 1: Rumore di fondo 2: Cellule Rosse Nucleate 3: Aggregati Piastrinici 4: Linfociti Basofili 5: LUC Cells 6: Monociti 7: Neutrofili 8: Eosinofili 4
Le cellule identificate come rossi maturi sono rappresentati in colore rosso, mentre i bianchi identificati come reticolociti sono rappresentati in colore blu. Il grafico mostra i reticolociti come cellule di dimensione maggiore rispetto alle cellule rosse mature con una minore concentrazione di emoglobina. La metodica dei globuli bianchi denominati basofili / lobularità La metodica dei basofili fornisce la conta primaria totale dei bianchi su ADVIA 2120. Il reagente BASO lisa le cellule dei rossi, le pistrine ed il citoplasma di tutti i tipi di bianchi ad eccezione dei basofili. Il citogramma BASO utilizza l' analisi dei cluster per ifentificare e contare le cellule ed i nuclei in ciascuna popolazione sulla base della loro posizione, area e densità. Figura 3: Grafico dei basofili 1: Rumore di fondo 2: Blasti 3: Bianchi Mononucleati (Nuclei di Monociti e Linfociti) 4: Basofili 5: Sospetti Basofili 6: Saturazione 7: Bianchi Polimorfonucleati (Nuclei di Neutrofili ed Eosinofili) 5
Strisci manuali Lo striscio manuale viene effettuato da un TAB in caso l ADVIA dovesse dare un risultato delle LUC maggiore di 4. Figura 4: Metodo per strisciare un vetrino di sangue Dopo aver strisciato il sangue il vetrino viene colorato con la colorazione May Grunwald Giemsa. La colorazione richiede in totale circa 20 minuti e dopo di essa si procede a visionare il vetrino al microscopio. Figura 5: Striscio manuale visto al microscopio 6
Obiettivo Con questo lavoro di stage vorrei dimostrare se vi è o meno una correlazione tra i risultati dell apparecchio ematologico ADVIA e quelli degli strisci manuali. Mi son predisposto quest obiettivo un po per curiosità, non ho un reale motivo, ma semplicemente volevo vedere quanto fosse marcata la differenza tra gli strisci manuali e le conte automatiche. Attività e metodi Come primo passo ho raccolto dati riguardanti il numero di neutrofili contati dall ADVIA e quelli contati con gli strisci manuali sullo stesso campione, i dati son stati presi in maniera del tutto casuale e provengono dall ospedale regionale di Bellinzona e Valli, ho raccolto un totale di 40 dati. Dopo aver effettuato la raccolta dei dati ho effettuato la comparazione tra i due metodi utilizzando la tecnica di Passing-Bablok. Poi in base agli intervalli di confidenza e all intercetta ho determinato se i due metodi sono comparabili o meno. Quando, in n campioni indipendenti estratti da una popolazione, un dato analita è misurato con valore Xi e Yi per ogni campione i, si ottengono Xi = xi + εi e Yi = yi + ηi dove: - xi e yi sono i valori stimati dalla retta per lo stesso campione i, - εi e ηi sono gli errori delle due misure. Con questa impostazione logica, - ognuno dei due metodi ha il suo valore atteso Xi e Yi per il campione i - e se esiste una relazione strutturale tra i due metodi, essa può essere descritta dalla generica equazione lineare Yi = α + βxi Al momento della pubblicazione del primo articolo di Passing e Bablok (anno 1983), la relazione strutturale tra i due metodi era ricavata con 4 metodi statistici: 1 - la regressione lineare Y / X: Yi = a + bxi 2 - la regressione lineare X /Y: Xi = a + byi Tutto questo risulterebbe molto complicato svolgerlo a mano, quindi io ho utilizzato un software chiamato MethVal che mi ha disegnato il grafico automaticamente inserendo semplicemente i dati che ho raccolto. 7
Risultati 100 Field method 80 60 40 Ref method 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Passing-Bablok agreement test N = 41 Slope : 1.000 [ 0.961 to 1.058 ] Intercept : -2.70 [ -6.00 to -0.23 ] Intervalli di confidenza: 0.961 / 1.058 Intercetta: -6.00 / -0.23 8
Discussione Come si può notare dal grafico l intercetta è inferiore a 0, questo trova anche conferma nel valori numerici dell intercetta. Mentre i valori di confidenza sono accettabili, questo significa che vi è un errore sistematico, ovvero il metodo di riferimento (ADVIA) misura più neutrofili che il metodo manuale. Questo fatto può essere spiegato dal fatto che l apparecchio non riconosce tutte le cellule, e quelle che non riconosce le caratterizza come LUC e le mette sotto i neutrofili, tramite la conta manuale si identificano anche le cosiddette LUC, e nel caso non risultassero appartenenti ai neutrofili questo comporterebbe che nella conta manuale i neutrofili possono essere inferiori che quelli contati dall ADVIA. Conclusione Posso concludere questo lavoro affermando che nonostante le grandi tecnologie a nostra disposizioni e le continue evoluzioni le apparecchiature non sono ancora, e personalmente spero non lo saranno mai, in grado di sostituire l uomo. Ci sarà sempre qualcosa che anche l apparecchio più sofisticato non riuscirà a svolgere, magari si tratta di piccolezze, ma sono piccolezze che sottolineano l importanza dell uomo anche di fronte ad una tecnologia sempre più avanzata. In questo caso specifico senza l intervento dell uomo non si potrebbero distinguere le cosiddette LUC da quelle che sono magari cellule di altro tipo atipiche. Bibliografia Docstoc.com. s.d. http://www.docstoc.com/docs/26013125/methods-advia-120 (consultato il giorno Marzo 25, 2012). Prof. Soliani. s.d. http://www.dsa.unipr.it/soliani/capu24.pdf (consultato il giorno Marzo 10, 2012). Siemens.com. s.d. http://www.medical.siemens.com (consultato il giorno Marzo 20, 2012). 9