Interazioni non covalenti D H A δ - δ + δ -
Le interazioni non covalenti Interazioni fra atomi che non sono legati da legami covalenti. Le interazioni non covalenti sono molto meno intense rispetto alle interazioni covalenti (poche kcal/mol rispetto a 83 kcal/mol per un legame C C). Questi legami deboli possono formarsi sia fra parti diverse della stessa macromolecola, sia fra parti di macromolecole diverse. Essi giocano un ruolo fondamentale in molti processi biologici, fra cui la fedele replicazione del DNA, il folding delle proteine, il riconoscimento specifico di substrati da parte di enzimi, il riconoscimento di molecole segnale. Le interazioni non covalenti si possono classificare in: - interazioni elettrostatiche - legami idrogeno - interazioni di van der Waals - effetto idrofobico
Le interazioni non covalenti Energie di legame associate alle principali interazioni non covalenti: Tipo di interazione non covalente Energia di legame (kcal/mole) Interazioni elettrostatiche 0.3-4 Legame idrogeno 0.5-4 Interazioni di van der Waals 0.03-0.1 Nel considerare i vari contributi energetici che stabilizzano una proteina non si può prescindere dal fatto che la proteina è immersa in un solvente, che è costituito principalmente da acqua. Le proprietà fisiche del solvente sono estremamente importanti per la stabilità della proteina.
Effetto idrofobico Le interazioni fra acqua e superfici non polari non sono favorevoli: proprio come l olio disperso nell acqua tende a raccogliersi in un unica goccia, anche i gruppi non polari nelle proteine tendono ad aggregarsi, per ridurre la superficie apolare a contatto con l acqua. Questa preferenza di specie non polari per ambienti non acquosi viene detto effetto idrofobico: esso è uno dei principali fattori di stabilità delle proteine. L effetto idrofobico fa sì che sostanze non polari minimizzino il loro contatto con l acqua, e molecole anfipatiche (come per esempio i detergenti) formino micelle in soluzioni acquose. Il meccanismo fisico per cui entità non polari sono escluse da soluzioni acquose è di carattere entropico.
Effetto idrofobico Le molecole d acqua allo stato liquido formano dinamicamente un alto numero di legami idrogeno, in funzione della temperatura. L introduzione di una molecola non polare nell acqua liquida crea una sorta di cavità nell acqua, che temporaneamente rompe alcuni legami idrogeno fra le molecole d acqua, poiché un gruppo non polare non può né accettare né donare legami idrogeno con le molecole d acqua. Le molecole d acqua spostate si riorientano per formare il maggior numero di nuovi legami idrogeno, creando una struttura ordinata, una specie di gabbia, detta clatrato, intorno alla molecola non polare.
Effetto idrofobico Poiché il numero di modi con cui le molecole d acqua formano legami idrogeno sulla superficie di un gruppo non polare è inferiore a quello che farebbero in sua assenza si ha una diminuzione di entropia del sistema. Anche se, da un punto di vista entalpico, il sistema clatrato è più stabile (ΔH < 0, per una debole liberazione di energia dovuto alla formazione di legami idrogeno ed interazioni di van der Waals), globalmente: ΔG = ΔH TΔS > 0 processo non spontaneo Quindi perchè il processo sia spontaneo (DG<0) occorre l aggregazione dei gruppi non polari in modo da minimizzare l area superficiale della cavità occupata dal gruppo apolare e quindi la perdita di entropia del sistema. acqua C 6 H 14 C 6 H 14 acqua 2xC 6 H 14
Effetto idrofobico & Folding L effetto idrofobico rappresenta una interazione chiave per il folding delle proteine, in cui residui con catene laterali idrofobiche si ripiegano verso l interno della proteina lasciando esposti al solvente in superficie residui polari. Ribosoma Proteina estesa (unfolded) (U) Unfolded Molten globule ΔG FOLDING = G F G U = ΔH TΔS Proteina globulare (folded) Folded (F) < 0 processo spontaneo di folding > 0 processo non spontaneo
Effetto idrofobico & Folding ΔH = variazione di entalpia fra stato finale ed iniziale (interazioni di van der Waals, elettrostatiche, legami idrogeno). ΔH risulta << 0. T = temperatura assoluta (K) ΔG FOLDING = G F -G U = ΔH - T(S F -S U ) ΔS = variazione di entropia (disordine del sistema) fra stato finale ed iniziale. Poiché S U >> S F ΔS << 0 Nel ΔG FOLDING il contributo TΔS è positivo e sia ΔH che TΔS assumono valori grandi (migliaia di kcal/mol). Al contrario ΔG FOLDING ha valori piccoli: ΔG FOLDING = -10, -15 kcal/mol Quindi il processo di folding avviene grazie ad un minimo prevalere di ΔH su TΔS; è sufficiente un piccolo aumento di T per causare denaturazione della proteina.
Effetto idrofobico & Folding Responsabile della variazione di entropia è l effetto idrofobico. ΔS FOLDING = S F S U = ΔS CATENA + ΔS SOLVENTE sempre < 0 Nel caso di un soluto apolare in un mezzo acquoso, le molecole d acqua che formano il clatrato attorno alla molecola apolare sono caratterizzate da una variazione di entropia negativa. Spontaneamente le molecole apolari si riuniscono in modo da minimizzare la variazione negativa di ΔS SOLVENTE. Nel caso del folding proteico, si formano tasche idrofobiche prive di molecole d acqua che, nella forma proteica unfolded erano coinvolte nella formazione dei clatrati attorno alle catene laterali degli aminoacidi idrofobici.
Effetto idrofobico Superficie accessibile al solvente di una proteina (o di catena laterale) La superficie proteica è definita dall insieme dei punti degli atomi esterni, ciascuno descritto come una sfera rigida avente come raggio il raggio di van der Waals (superficie di van der Waals). Le molecole d acqua sono considerate sfere con raggio di van der Waals pari a 1.4 Å. La superficie accessibile al solvente (ASA) è definita come l area descritta dal centro di una molecola d acqua che rotola sopra la superficie di van der Waals della proteina (o della catena laterale). superficie di van der Waals
Effetto idrofobico Superficie accessibile al solvente di una proteina (o di catena laterale) La superficie accessibile al solvente non corrisponde a quella di van der Waals della proteina. Infatti, esistono zone della proteina (o della catena laterale) non accessibili alla molecola d acqua usata come probe : per esempio le fenditure.
Effetto idrofobico ΔG di trasferimento delle catene laterali degli aminoacidi E stato misurato il ΔG di trasferimento di ciascun aminoacido dall acqua ad un solvente organico (per esempio etanolo o diossano). Per avere la misura del ΔG di trasferimento della sola catena laterale, bisogna non considerare il contributo della catena principale (che falserebbe la misura, avendo sempre una carica negativa del gruppo carbossilico COO - e una positiva del gruppo aminico NH 3+ ). Ciò equivale a sottrarre dal valore di ΔG di trasferimento di ciascun aminoacido il ΔG di trasferimento della Gly. ΔG cat.lat. = ΔG aa - ΔG Gly
Effetto idrofobico Esiste una relazione lineare tra ΔG di trasferimento (dall acqua ad un solvente apolare) e superficie accessibile al solvente per catene laterali completamente non polari. Nel caso di aminoacidi moderatamente polari (Thr, Ser, Met, Tyr e Trp) una relazione analoga è relativamente valida, applicando una diminuzione di circa 1.5 kcal/mole nel ΔG di trasferimento.
Effetto idrofobico Si può quindi dire che il ΔG di trasferimento è proporzionale alla superficie non polare accessibile al solvente. La costante di proporzionalità (coefficiente angolare della retta) vale: 0.025 kcal/mole Å 2. Questo significa che si guadagnano 0.025 kcal/mole (o equivalentemente 25 cal/mole) per ogni Å 2 di superficie non polare che si seppellisce nel cuore di una proteina.
Effetto idrofobico Correlazione effetto idrofobico con la temperatura Si consideri il trasferimento di una molecola A da un solvente organico ad uno polare (acqua). ΔG = ΔH TΔS ΔG = RT lnk Quindi: RT lnk = ΔH TΔS [A] H2O K = [A] ORG Org H 2 O A ΔH ΔS lnk = + RT R relazione di van t Hoff
Effetto idrofobico Correlazione effetto idrofobico con la temperatura ΔH ΔS lnk = + relazione di van t Hoff RT R Esiste quindi una relazione lineare fra lnk e 1/T. [A] H2O K = [A] ORG All aumentare di T, lnk (e quindi K) diminuisce aumenta la concentrazione di A ORG. L effetto idrofobico è favorito dall aumento della temperatura T (naturalmente deve essere complessivamente ΔG < 0).
Il legame peptidico Gli aminoacidi polimerizzano durante la sintesi delle proteine mediante la formazione di legami peptidici. Il legame peptidico C N si ha quando il gruppo carbossilico di un peptide condensa con il gruppo amminico del peptide successivo mediante l eliminazione di una molecola d acqua. Le proteine sono molecole che consistono di una o più catene polipeptidiche.
Il legame peptidico Il gruppo peptidico ha una struttura rigida e planare, dovuta al parziale (~40 %) carattere di doppio legame del legame peptidico. O O - C C N N + H H
Il legame peptidico Il legame peptidico C N è 0.13 Å più corto del legame singolo N C α e 0.08 Å più lungo di un doppio legame C=N. Il legame peptidico, quindi, presenta per il 60 % una natura di legame singolo e per il 40 % una natura di legame doppio.
Il legame peptidico Generalmente il gruppo peptidico assume la conformazione trans trans -atomi (C α ) n e (C α ) n+1 opposti rispetto al legame peptidico C N. In alcuni casi il gruppo peptidico può assume la conformazione cis (~8 kj mol -1 meno stabile della conformazione trans. Problemi sterici, perché distanza C α -C α = 2.8 Å). cis
Il legame peptidico Il gruppo peptidico ha un momento di dipolo. O Gli atomi O e N sono rispettivamente più elettronegativi di C ed H. La conseguente delocalizzazione di carica porta alla formazione di due dipoli (CO ed NH) con analoga direzione e verso nel gruppo peptidico. C N Il momento di dipolo risultante è di circa 3.5 Debye. H
Il legame peptidico Come si ricava il valore del momento di dipolo del gruppo peptidico: momento dipolo C=O (frazione di carica distanza atomi C ed O): μ A = 0.42 1.23 = 0.52 eå momento dipolo N H (frazione di carica distanza atomi N ed H): μ B = 0.20 1.00 = 0.20 eå Il momento di dipolo risultante sarà dato dalla somma: μ = μ A + μ B = 0.72 eå Nel sistema internazionale il momento di dipolo è espresso in Cm, quindi: 0.72 1.6 10-19 10-10 = 1.15 10-29 Cm carica e - Åin metri poiché 1 Debye = 3.35 10-30 Cm, ne deriva che 1.15 10-29 Cm equivale a circa 3.5 Debye.
Il legame peptidico I polipeptidi sono catene lineari in cui ciascun aminoacido è legato al suo prossimo in modo coda-testa, senza formare diramazioni. La catena si dice estendersi dal suo termine amminico (N-terminale) al suo termine carbossilico (C-terminale). La formazione in successione di legami peptidici genera la cosiddetta catena principale o scheletro polipeptidico da cui protrudono le catene laterali dei diversi aminoacidi. R i+1 R n R i R i+2 L unità base ripetuta lungo la catena principale è (NH C α H C=O), che deriva dalle parti comuni degli aminoacidi dopo che si è formato il legame peptidico.
Il legame peptidico Per ciascun aminoacido costituente la catena polipeptidica si presentano 20 diverse possibilità di catena laterale (o residui), per cui è facile immaginare l enorme numero di diverse catene polipeptidiche che possono essere costituite. Se si considera un dipeptide, si avranno 20 2 = 400 possibili dipeptidi diversi. Se si considera un tripeptide, si avranno 20 3 = 8000 possibili tripeptidi diversi. Nel caso delle proteine, una piccola proteina è costituita da una singola catena polipeptidica di circa 100 residui, per cui si avranno 20 100 = 1.27 10 130 possibili catene polipeptidiche diverse! Gli organismi sulla terra sintetizzano un gran numero di proteine, con caratteristiche fisico-chimiche differenti, che derivano dalle diverse proprietà dei 20 aminoacidi standard e da come questi si combinano nella catena polipeptidica.