catalizzatori biologici rendono possibile da un punto di vista cinetico le reazioni chimiche Gli Enzimi Sono le proteine più importanti e più specializzate Presentano un elevato grado di specificità per il substrato Operano in soluzioni acquose con temperature e ph blandi
Struttura generale degli enzimi Sono proteine globulari complesse : Addotto enzima-substrato Parte proteica Parte non-proteica Cofattore (ione metallico) Coenzima (natura organica: vitamina o altro) Gruppo Prostetico
SITO ATTIVO: specifica porzione dell enzima, deputata al legame con il substrato che porta alla formazione dell addotto ES Addotto ES
A(S) B(P) I catalizzatori abbassano l energia di attivazione delle reazioni favoriscono lo stato di transizione formando l addotto ES G prodotti -G substrati ( G ) < 0 Reazione esoergonica
Molti catalizzatori non facilitano la formazione dello stato di transizione, ma sostituiscono la reazione difficile con 2 o più reazioni entrambe con uno stato di transizione facile da formare E+S ES EP E+P Risultato: accelerazione della reazione globale. ΔG =energia di attivazione
ADDOTTO Enzima-Substrato L energia usata per aumentare la velocità enzimatica deriva dalle interazioni deboli (legami idrogeno, interazioni ioniche e idrofobiche) che si formano tra enzima e substrato ENERGIA di LEGAME
Gli enzimi sono caratterizzati da elevata specificità
CINETICA ENZIMATICA velocità di una reazione (V): numero di molecole di substrato che si trasformano in prodotto nell unità di tempo. (V) si esprime come mmol/l di prodotto formatosi in un minuto (mm/min). Velocità iniziale V 0 Nelle analisi delle reazioni enzimatiche si utilizzano soltanto le velocità di reazione iniziali (v 0 ), quelle che si misurano non appena si mescolano l enzima ed il substrato. In tal modo la variazione di [S] può essere considerata trascurabile.
CINETICA ENZIMATICA: concentrazione del substrato La velocità di una reazione catalizzata da un enzima aumenta all aumentare della concentrazione del substrato fino a raggiungere una velocità massima (V max ). In questa condizione i siti attivi dell enzima sono saturi del substrato Quando tutto l enzima è saturato con il substrato: [ES] = [E tot ] V 0 = Vmax
La curva che esprime la relazione tra V 0 e S ha un andamento iperbolico ed è espressa algebricamente dalla equazione di Michaelis-Menten Costante di Michaelis e Menten La Km è quella concentrazione di substrato a cui la V 0 è pari a metà della Vmax
L equazione di Michaelis-Menten descrive la variazione della velocità di reazione al variare della concentrazione del substrato. v 0 = velocità iniziale della reazione V max = velocità massima K m = costante di Michaelis-Menten [S] = concentrazione del substrato
Caratteristiche della K m La K m è pari alla concentrazione di substrato alla quale la velocità della reazione (V 0 ) è 1/2 della V max. La K m riflette l affinità dell enzima per il substrato: K m piccola = alta affinità dell enzima per il substrato K m grande = bassa affinità dell enzima per il substrato. Ogni enzima ha una K m caratteristica per un dato substrato. La K m non varia al variare della [E].
I PARAMETRI CINETICI POSSONO ESSERE USATI PER CONFRONTARE LE ATTIVITA DEGLI ENZIMI
Inibizione Enzimatica Inibitori ostacolano o impediscono il funzionamento degli enzimi Inibitore reversibile: Ha un azione temporanea, è possibile allontanare l inibitore dall enzima, consentendo il regolare esplicarsi dell attività catalitica. inibitore irreversibile: la ripresa dell attività enzimatica non è possibile, in quanto non è possibile in nessun modo allontanare l inibitore dall enzima
un enzima regolatore è quello che controlla le quantità di sostanze che devono essere trasformate in una via metabolica (catalizza la reazione più lenta, in genere la prima di una serie) tali enzimi non seguono la cinetica di Michaelis Menten e sono responsabili della modulazione della velocità con cui decorre l intero processo metabolico Enzimi regolatori ENZIMI ALLOSTERICI struttura quaternaria (due o più subunità proteiche) in essi esistono più siti chimicamente attivi Effettore o MODULATORE: molecola che interagendo con l enzima in siti lontani dal sito attivo, esercita un effetto positivo o negativo sulla sua attività
Modificazione allosterica Enzimi regolatori
Enzimi regolatori
Enzimi regolatori modificazione covalente reversibile
Coenzimi e Cofattori Molti enzimi per poter essere attivi richiedono la presenza di ioni metallici o di altre molecole, talvolta legate con legami covalenti: Coenzimi o cofattori Cofattore: ione o molecola NON PROTEICA la cui presenza è indispensabile perché l enzima possa svolgere la sua attività catalitica. Tra i cofattori hanno rilevante importanza gli ioni di alcuni elementi metallici, in particolare Ca, Mg, Mn, Zn, Cu (p.es. tutti gli enzimi che utilizzano ATP richiedono la presenza di ioni Mg 2+ ).
Coenzimi e Cofattori Molti enzimi per poter essere attivi richiedono la presenza di ioni metallici o di altre molecole, talvolta legate con legami covalenti: Coenzimi o cofattori Coenzimi: sono molecole organiche (alcuni di essi derivano da vitamine idrosolubili) prendono parte direttamente all azione catalitica dell enzima spesso si ritrovano modificati chimicamente al termine della reazione (es. NAD + / NADH).
Coenzimi I coenzimi da soli sono cataliticamente inattivi ma, unendosi all apoenzima, formano l enzima cataliticamente attivo. Uno stesso coenzima può essere unito a diverse proteine per cui si deduce che la specificità dell azione enzimatica è proprietà dell apoenzima e non del coenzima. La maggior parte dei coenzimi è strettamente legata alle vitamine. Per diventare coenzima, la vitamina subisce delle trasformazioni che vanno dalla semplice fosforilazione (uno dei casi più comuni) a trasformazioni più complesse. La trasformazione della vitamina in coenzima avviene all interno delle cellule ed è di natura enzimatica. I coenzimi possono essere classificati in gruppi diversi, in base al tipo di reazione catalizzata.
Coenzimi Coenzimi derivati dalle vitamine idrosolubili Le vitamine sono necessarie per la sintesi di coenzimi e devono essere ottenute con la dieta Piante e microorganismi sono produttori di vitamine La maggior parte delle vitamine deve essere ulteriormente trasformata per generare coenzimi
Coenzimi Niacina (Vit. B 3 o PP) NAD + e NADP + La niacina (acido nicotinico) è un precursore di NAD + e NADP + NAD = Nicotinamide Adenina Dinucleotide NADP = Nicotinamide Adenina Dinucleotide Fosfato NAD + e NADP + fungono da coenzimi in molte reazioni di ossidoriduzione
Coenzimi I due Coenzimi funzionano come trasportatori di ioni idruro H -
Coenzimi
Coenzimi Riboflavina (Vit. B 2 ) coenzimi FAD e FMN FAD = Flavin Adenin Dinucleotide FMN = Flavin mono-nucleotide I coenzimi Flavinici sono coinvolti in reazioni di ossido riduzione catalizzate da molti enzimi (flavoenzimi o flavoproteine) Uova, latte, carne, cereali
Coenzimi
Coenzimi
Coenzimi Partecipa alle reazioni di trasferimento di radicali ACILICI, come quelli che avvengono nell ossidazione di carboidrati, acidi grassi e aminoacidi. Acido Pantotenico (Vit B5) Coenzima A (CoA) I gruppi acile sono legati covalentemente al gruppo SH del CoA a formare tioesteri FONTE: Cereali, legumi, carne
Coenzimi Partecipa alle reazioni di trasferimento di radicali ACILICI, come quelli che avvengono nell ossidazione di carboidrati, acidi grassi e aminoacidi. I gruppi acile sono legati covalentemente al gruppo SH del CoA a formare tioesteri FONTE: Cereali, legumi, carne
PROTEINE RESPIRATORIE EMOGLOBINA & MIOGLOBINA
Nel corso dell evoluzione, con il passaggio dalla vita anaerobia alla vita aerobia si sono progressivamente differenziati due meccanismi che sono in grado di garantire alle cellule dei tessuti un flusso di O 2 sufficiente e costante: un sistema circolatorio adeguato; molecole trasportatrici di O 2, che permettono di superare la limitazione imposta dalla bassa solubilità dell ossigeno in acqua.
Nei vertebrati le molecole coinvolte nel rifornimento dell ossigeno sono: Emoglobina (Hb) Mioglobina (Mb) si legano reversibilmente con l O 2 e ne rendono possibile il trasporto dai polmoni ai tessuti e l immagazzinamento nel muscolo. L Hb contenuta nei globuli rossi aumenta di 50 volte la quantità di O 2 trasportata da 1 litro di sangue. La Mb si trova nei muscoli e funziona soprattutto come deposito di O 2 ; ha una grande affinità per l O 2 e lo lega quando l Hb delle emazie lo ha già ceduto e, a sua volta lo cede solo quando la pressione parziale del gas (po 2 ) scende a livelli molto bassi.
Proteina monomerica (153 AA) Immagazzinamento dell O 2 nella cellula 80% degli AA sono disposti ad α-elica Mioglobina (Mb)
Emoglobina (Hb) Eterotetramero costituita da 4 diverse subunità: 2 subunità α 2 subunità β Trasporto dell O 2 dai polmoni alla cellula
L Emoglobina trasporta l O 2 dai polmoni ai tessuti La Mioglobina è in grado di legare l ossigeno rilasciato dall Emoglobina nel circolo sanguigno ai tessuti e trasportarlo ai vari organelli cellulari che lo utilizzano (es. mitocondri)
EME 4 anelli pirrolici Fe 2+ al centro EME: PROTOPORFIRINA IX Fe 2+
EME
EME
EME
EME
EME Il Fe 2+ dell eme può legare: O 2 CO H 2 O (metaemoglobina) Fe 2+ Fe 3+
EME Il Fe 2+ dell eme può legare: O 2 (ossiemoglobina)
EME Il Fe 2+ dell eme può legare: CO (carbossiemoglobina)
I derivati carbossi-mioglobina e carbossi-emoglobina presentano CO (non CO 2!!!) legato al gruppo eme. Il legame con il CO è circa 300 volte più stabile di quello con l O 2 ed è irreversibile! Quando nell aria è presente 0.2% di CO in 1 ora si ha perdita di coscienza e in circa 4 ore si ha morte per asfissia (circa 2/3 di Hb sono legati a CO).
Protezione dell eme da parte della globina Le globine che circondano l'eme in Mb ed in Hb hanno funzioni di estrema importanza: - impediscono al ferro dell eme di ossidarsi da Fe 2+ ferroso a Fe 3+ ferrico; - creano un sito attivo idrofobico, in cui si lega O 2 che è lipofilo * ; - proteggono l eme da ligandi indesiderabili (esempio CO). * la solubilità di O 2 nel plasma è molto bassa; grazie all'emoglobina nel sangue c'è una concentrazione di O 2 100 volte superiore a quella del plasma.
Mioglobina (Mb)
Saturazione frazionale Legame all ossigeno della Mb (MbO 2 ) deposito di O 2 a livello muscolare Muscolo a riposo: mioglobina legata all O 2 Muscolo attivo: consumo di O 2 diminuisce la pressione a livello dei tessuti la mioglobina rilascia l O 2 Pressione tessuti Pressione polmoni Numero di molecole che hanno legato l O 2 rispetto al totale Y Curva iperbolica P 50 Pressione parziale di O 2 alla quale è saturato il 50% delle molecole SEMISATURAZIONE Misura dell affinità per l O 2 Più piccola è la P 50 maggiore è l affinità
1. contenuta negli eritrociti 2. trasporto di O 2 dai polmoni ai tessuti (legame reversibile) 3. trasporto reversibile di CO 2. Emoglobina (Hb) struttura quaternaria 4 catene polipetiditiche 4 gruppi eme HbA (α2β2): emoglobina adulta umana 2 catene α 2 catene β HbF (α2 2): emoglobina fetale 2 catene α 2 catene. La sostituzione delle catene β (Hb adulta) con le catene (Hb fetale) comporta differente funzionalità.
Emoglobina (Hb)
L emoglobina esiste in due forme: ossigenata =R; deossigenata =T Il legame di Hb con O 2 induce una modificazione strutturale. La proteina passa da una forma tesa T, mantenuta da interazioni ioniche (ponti salini) fra catene laterali di aminoacidi (es. Asp-His) presenti nelle sub-unità, a una forma rilassata R (ponti salini spezzati). Il fenomeno avviene in direzione opposta quando l emoglobina rilascia l ossigeno.
Modificazione conformazionale: Transizione T R
Modificazione conformazionale: Transizione T R Stato T (blu) Stato R (rosso)
Allosterismo (modificazione della struttura quaternaria) proteine con struttura quaternaria possono andare incontro a modificazioni nella disposizione spaziale delle sub-unità costituenti. L emoglobina è una proteina allosterica la cui struttura quaternaria viene modificata dal legame di O 2 alle 4 sub-unità: i 4 siti attivi cooperano positivamente, legando O 2 con affinità crescente e questo causa cambiamento progressivo di struttura quaternaria.
Curva di dissociazione dell O 2 per l Emoglobina Hb Hb + 4O 2 = Hb(O 2 ) 4 sigmoidale L emoglobina lega l O 2 quando la pressione parziale del gas (po 2 ) è elevata (polmoni) e lo rilascia quando la pressione è bassa (tessuti).
La mioglobina è un ottimo sistema per immagazzinare O 2 : -si lega all O 2 anche a basse po 2 e lo lega strettamente. L emoglobina è un ottimo sistema per trasportare l O 2 : -si carica di O 2 quando po 2 è alta e cede O 2 quando po 2 è bassa.
Hb T legame cooperativo EMOGLOBINA lega l O 2 con affinità crescente Hb + 4 O 2 Hb(O 2 ) 4 Hb(O 2 ) 4 R
Modello simmetrico Modello sequenziale
Fattori che influenzano l affinità dell Hb per O 2 piccole molecole e ioni, presenti negli eritrociti possono regolare il legame di O 2 ad Hb EFFETTORI O MODULATORI ETEROTROPICI: [H + ], CO 2, acido 2,3 bisfosfoglicerico (2,3-BPG) si legano con interazioni deboli in siti diversi da quello di legame dell O 2 diminuiscono l affinità dell emoglobina per l ossigeno. MODULATORI ETEROTOPICI NEGATIVI. L aumento di concentrazione di questi modulatori causa una diminuzione dell affinità di Hb per O 2 e stabilizzano la forma T.
EFFETTO BOHR Il legame di Hb con O 2 è fortemente influenzato dal ph e dalla pco 2. Nei tessuti, dove il ph è basso e la pco 2 è alta, l'affinità di Hb per O 2 diminuisce, O 2 viene liberato e H + e CO 2 si legano ad Hb. Il contrario avviene nei capillari polmonari. L'effetto del ph e della CO2 sull'affinità di Hb per O 2 è denominato Hb(O 2 ) 4 + H + = HbH + + 4O 2 Nei tessuti Hb(O 2 ) 4 perde affinità per O 2, lo rilascia a causa delle basse po 2 e, essendo la forma deossigenata più affine per H +, si comporta come un ottimo tampone intracellulare (azione di alcuni residui di istidina). L'azione tampone si accompagna al trasporto dell'anidride carbonica.
In aggiunta al trasporto di O 2 dai polmoni ai tessuti, Hb trasporta anche due prodotti della respirazione, H + e CO 2, dai tessuti ai polmoni ed ai reni, organi deputati alla loro escrezione. Trasporto della CO 2 CO 2 liberamente disciolta nel plasma CO 2 trasportata come bicarbonato (HCO 3- ) CO 2 trasportata come carbammati(15-20%) formatosi dalla reazione con i gruppi α aminici terminali non ionizzati dell Hb
TESSUTI La maggior parte della CO 2 che diffonde nelle emazie reagisce con l H 2 O formando H 2 CO 3, grazie alla presenza di un enzima, l anidrasi carbonica CO 2 + H 2 O H 2 CO 3 H + + HCO 3 - H + HCO 3 - Legati all Hb passano dal globulo rosso al plasma attraverso una proteina di membrana
Gli ioni H + si legano a 3 coppie di siti sull Hb: la più nota è l His 146 delle catene β nei tessuti ad elevato metabolismo, come nei muscoli in attività in cui c è una notevole produzione di composti acidi e di CO 2, l Hb cede più facilmente l O 2 e lega gli H + e la CO 2. Nei polmoni avviene esattamente il contrario.
EFFETTO BOHR ph & pco 2 venoso arterioso
pco 2 pco 2 Influenza della pco 2
Influenza del ph tessuti polmoni
Influenza del 2,3- BPG
Influenza del 2,3- BPG Il 2,3 BPG è una piccola molecola dotata di cariche negative che consentono il legame a una serie di cariche positive delle catene laterali di AA situati sulle due catene β, formando ponti salini e stabilizzando la forma T. Il sito per il 2,3 BPG è presente solo nella forma tesa T.
Influenza del 2,3- BPG Nell Hb deossigenata (T) è presente una cavità centrale che si restringe consistentemente in Hb in forma R (ossigenata): tale cavità nella forma T ospita il 2,3 BPG, modulatore allosterico negativo.
Influenza del 2,3- BPG Nell Hb deossigenata (T) è presente una cavità centrale che si restringe consistentemente in Hb in forma R (ossigenata): tale cavità nella forma T ospita il 2,3 BPG, modulatore allosterico negativo.
EMOGLOBINA FETALE (HbF) Il significato del 2,3 BPG appare chiaro se si confronta la curva di saturazione dell HbA materna e dell Hb e fetale. Gli eritrociti fetali contengono un Hb con struttura quaternaria α2 2. Fra le catene il 2,3-BPG si lega più debolmente rispetto a quello che avviene nell HbA. La curva di saturazione dell Hb fetale è a sinistra rispetto a quella della HbA materna, indicando maggiore affinità per O 2. L'O 2 rilasciato nella circolazione placentare dall Hb materna a certe pressioni parziali, viene assunto dall Hb fetale, più affine, e ciò soddisfa l'esigenza fisiologica di rifornimento di O 2 al feto da parte della madre.
emoglobinopatie Anemia falciforme
emoglobinopatie
Le talassemie
P. Champe, R. Harvey, D. R. Ferrier, LE BASI DELLA BIOCHIMICA, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006
P. Champe, R. Harvey, D. R. Ferrier, LE BASI DELLA BIOCHIMICA, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006