iview DAB Detection Kit

iview DAB Detection Kit 760-091 05266157001 La figura 1 illustra il metodo di rilevamento indiretto. DAB Precipitate + Copper H 2O 2 DAB 250 FINALITÀ D'USO iview DAB Detection Kit di Ventana Medical Systems (Ventana) è un sistema indiretto a base di streptavidina-biotina per il rilevamento di IgG di topo, di IgM di topo e di anticorpi primari di coniglio. Il kit è concepito per l uso in laboratorio al fine di identificare, al microscopio in campo chiaro, mediante procedure immunoistochimiche (IHC) i target in sezioni di tessuto fissato in formalina, incluso in paraffina e congelato sugli strumenti BenchMark e BenchMark XT. I risultati ottenuti con questo prodotto devono essere interpretati da un patologo qualificato in un quadro che consideri anche gli esami istologici, i dati clinici pertinenti e i controlli adeguati. Questo prodotto è concepito per uso diagnostico in vitro (IVD). Biotinylated Secondary Antibody Tissue Primary Antibody Target Antigen iview DAB Detection Kit Streptavidin HRP (SA-HRP) SOMMARIO E SPIEGAZIONE L'immunoistochimica (IHC) è una tecnica usata in laboratorio ai fini diagnostici. L'IHC impiega anticorpi primari specifici per localizzare e legare antigeni in sezioni di tessuto fissato o congelato. Il legame dell'anticorpo all'antigene è visualizzato con un metodo di rilevamento indiretto. Le tecniche più comuni per i metodi indiretti impiegano un anticorpo secondario biotinilato diretto contro un anticorpo primario e un enzima con un corrispondente sistema substrato-cromogeno. Da questa combinazione risulta un precipitato colorato al sito di legame dell'anticorpo specifico. L'iVIEW DAB Detection Kit utilizza un metodo indiretto per visualizzare anticorpi specifici legati ad antigeni, depositando un precipitato colorato in marrone. PRINCIPI DELLA PROCEDURA L'iVIEW DAB Detection Kit rileva anticorpi specifici di IgG e IgM di topo e di IgG di coniglio legati ad un antigene in sezioni di tessuto incluso in paraffina e congelato. L'anticorpo specifico viene localizzato da un anticorpo secondario coniugato con biotina. Questa fase viene seguita dall'aggiunta di un coniugato enzimatico di streptavidina-hrp (perossidasi di rafano) che si lega alla biotina presente nell'anticorpo secondario. Il complesso viene quindi visualizzato con substrato di perossido di idrogeno e cromogeno 3,3 - diaminobenzidina tetraidrocloruro (DAB), che produce un precipitato marrone, facilmente osservabile al microscopio in campo chiaro. La metodica di colorazione prevede numerosi passaggi nei quali i reagenti vengono incubati a determinate temperature e per intervalli di tempo pre-impostati. Alla fine di ciascuna fase di incubazione, gli strumenti BenchMark e BenchMark XT risciacquano le sezioni per rimuovere il materiale non legato e dispensano la soluzione oleosa liquid coverslip, che riduce al minimo l evaporazione dei reagenti acquosi dal vetrino. 1 I risultati vengono interpretati con un microscopio in campo chiaro e contribuiscono alla diagnosi differenziale di processi patofisiologici, che possono o non possono essere associati ad un particolare antigene. Per ulteriori informazioni sul funzionamento dello strumento, fare riferimento al rispettivo manuale d'uso. Figura 1. iview DAB Detection Reaction MATERIALI E METODI Reagenti forniti L'iVIEW DAB Detection Kit contiene reagenti sufficienti per l'esecuzione di 250 test. 1 dispenser da 25 ml iview Inhibitor, contenente il 3 % di soluzione di perossido di idrogeno. 1 dispenser da 25 ml iview Biotinylated Ig Secondary Antibody, contenente IgG e IgM di capra biotinilate anti-topo purificate per affinità (<200 µg/ml) e IgG di capra biotinilate anti-coniglio (<200 µg/ml) in tampone fosfato con ProClin 300, un conservante. 1 dispenser da 25 ml iview SA-HRP, contenente una soluzione di coniugato di streptavidina-perossidasi di rafano (<300 µg/ml) con uno stabilizzante per proteine e ProClin 300, un conservante. 1 dispenser da 25 ml iview DAB Substrate, contenente diaminobenzidina (2 g/l) in una soluzione stabilizzante brevettata con un conservante brevettato. 1 dispenser da 25 ml iview H2O2, contenente lo 0,04 0,08 % di perossido d idrogeno in una soluzione di tampone fosfato. 1 dispenser da 25 ml iview Copper, contenente solfato di rame (5 g/l) in tampone acetato con un conservante brevettato. Ricostituzione, miscelazione, diluizione, titolazione Il detection kit è ottimizzato per l uso sugli strumenti BenchMark e BenchMark XT. Non è necessaria alcuna ricostituzione, miscelazione, diluizione o titolazione dei reagenti della confezione. Un'ulteriore diluizione può causare una perdita di colorazione dell'antigene. L'utilizzatore è tenuto a convalidare qualunque modifica di questo genere. Eventuali differenze nella processazione dei tessuti e nelle procedure degli esami preliminari del laboratorio possono produrre una variabilità significativa dei risultati. Per ulteriori informazioni relative ai controlli, consultare la sezione Procedure di controllo qualità. 2012-03-29 1 / 5 14910IT Rev F

Materiali e reagenti necessari ma non forniti I reagenti e materiali indicati di seguito possono essere necessari per la colorazione ma non vengono forniti con il detection kit: 1. Anticorpo primario 2. Reagente di controllo negativo 3. Campioni di tessuto di controllo positivi e negativi (per i tipi raccomandati, consultare le metodiche degli anticorpi) 4. Endogenous Biotin Blocking Kit (necessario per applicazioni specifiche) 5. Amplification Kit (necessario per applicazioni specifiche) 6. Protease 1 (necessaria per applicazioni specifiche) 7. Protease 2 (necessaria per applicazioni specifiche) 8. Protease 3 (necessaria per applicazioni specifiche) 9. Hematoxylin Counterstain (necessario per applicazioni specifiche) 10. Hematoxylin II Counterstain (necessario per applicazioni specifiche) 11. Bluing Reagent (necessario per applicazioni specifiche) 12. Reaction Buffer Concentrate (10X) 13. Cell Conditioning Solution 1 (CC1) (necessaria per applicazioni specifiche) 14. Cell Conditioning Solution 2 (CC2) (necessaria per applicazioni specifiche) 15. Antibody Diluent (necessario per applicazioni specifiche) 16. Soluzione EZ Prep Concentrate (10X) 17. Etanolo o reagente alcolico (per istologia) 18. Liquid Coverslip (High Temperature) 19. Strumento BenchMark o BenchMark XT 20. Vetrini per microscopio, caricati positivamente 21. Stufa di asciugatura in grado di mantenere una temperatura di 60 C ± 5 C 22. Etichette con codice a barre (etichette con codice a barre adeguate per il controllo con reagente negativo e per l'anticorpo primario da testare) 23. Xilene (per istologia) 24. Acqua deionizzata o distillata 25. Soluzione coverslip e metodo coverslip, sufficiente per coprire tessuti 26. Microscopio ottico (20 80X) 27. Detergente delicato per stoviglie Conservazione e validità Conservare a 2 8 C. Non congelare. L utilizzatore deve convalidare eventuali condizioni di conservazione diverse da quelle specificate nel foglietto illustrativo della confezione. Questo detection kit può essere utilizzato subito dopo il prelievo dal frigorifero. Per garantire la dispensazione adeguata e la stabilità di tutti i reagenti, riposizionare il tappo dopo ciascun uso e riporre immediatamente il dispenser in frigorifero in posizione verticale. Ogni detection kit è provvisto di data di scadenza. Se conservato correttamente, il prodotto resta stabile fino alla data indicata sull'etichetta. Non usare il prodotto oltre la data di scadenza per il metodo di conservazione prescritto. Non vi sono segni evidenti che indichino l'instabilità di questo prodotto; pertanto è auspicabile utilizzare controlli positivi e negativi contemporaneamente ai campioni da testare. Contattare immediatamente il distributore locale VENTANA se vi è qualche segnale d'instabilità del reagente. Prelievo dei campioni e preparazione per l'analisi Con l'iview DAB Detection Kit e uno strumento BenchMark o BenchMark XT (vedere la sezione Materiali e reagenti necessari ma non forniti ) possono essere utilizzati tessuti fissati in formalina ed inclusi in paraffina. Il fissativo consigliato per i tessuti è formalina neutra tamponata (NBF) al 10 %. 2 Possono verificarsi risultati variabili a seconda dello spessore della sezione di tessuto, del tipo di fissazione, in caso di fissazione incompleta prolungata o di processi speciali, quale la decalcificazione di campioni di midollo osseo. Tagliare le sezioni con uno spessore adeguato (2 5 µm) per l'anticorpo primario utilizzato e porle su un vetrino da microscopio. I vetrini con la sezione di tessuto possono essere asciugati/riscaldati per almeno 2 ore (ma non più di 24 ore) in una stufa a 60 C ± 5 C. I vetrini vengono riscaldati per asciugare il tessuto dopo l'applicazione del montante e per migliorare l'adesione del tessuto sul vetrino. NOTA: per i limiti di riscaldamento, consultare la metodica dell'anticorpo primario. Un riscaldamento eccessivo del tessuto può portare ad una minore disponibilità di antigeni. I tessuti che esprimono antigeni, se fissati ed inclusi correttamente, rimangono stabili se conservati al fresco (15 25 C). The Clinical Laboratory Improvement Act (CLIA), legge del 1988, 42CFR493.1259 (b), richiede che il laboratorio deve conservare i vetrini per almeno dieci anni dalla data dell'esame e conservare i blocchi di campione per almeno due anni dalla data dell'esame. Ogni laboratorio deve validare la stabilità dei vetrini con sezioni per le proprie procedure e condizioni ambientali di conservazione. AVVERTENZE E PRECAUZIONI 1. Per uso diagnostico in vitro (IVD). 2. ProClin 300 viene usato come conservante per alcuni reagenti in questo detection kit (vedere la sezione Reagenti forniti ). È classificato come irritante e può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. Adottare precauzioni adeguate per la manipolazione. Evitare il contatto dei reagenti con gli occhi, la pelle e le mucose. Usare indumenti e guanti protettivi. 3. Avvertenza: possibile cancerogenicità. La International Agency for Research on Cancer (IARC) e lo US National Toxicology Program (NTP) hanno indicato la benzidina, un composto strettamente correlato a 3,3 -diaminobenzidina tetraidrocloruro (DAB), come cancerogeno umano conosciuto. 4. Trattare i materiali di origine umana o animale come materiali a potenziale rischio biologico e smaltirli adottando precauzioni adeguate. 5. Adottare precauzioni adeguate per la manipolazione dei reagenti. Evitare il contatto dei reagenti con gli occhi, la pelle e le mucose. Usare guanti monouso e indumenti protettivi quando si trattano materiali sospetti di cancerogenicità o materiali tossici. 6. Se i reagenti entrano in contatto con aree sensibili, lavare con abbondante acqua corrente. Evitare l'inalazione dei reagenti. 7. Prima di avviare una corsa dello strumento, assicurarsi che il contenitore dei rifiuti sia vuoto. Se non viene seguita questa precauzione, i rifiuti potrebbero tracimare dal contenitore e l'utilizzatore rischia di scivolare e cadere. 8. Evitare la contaminazione microbica dei reagenti, che può essere causa di risultati erronei. 9. Per il metodo di smaltimento consigliato, consultare le autorità locali e/o statali. 10. Per ulteriori informazioni, consultare la Scheda di sicurezza del prodotto. ISTRUZIONI PER L'USO L'iVIEW DAB Detection Kit è stato sviluppato per l'uso sugli strumenti BenchMark e BenchMark XT in combinazione con gli anticorpi primari e accessori VENTANA. È possibile visualizzare, stampare e modificare i parametri per le procedure automatiche, in conformità alla procedura descritta nel manuale d'uso dello strumento. Altri parametri operativi dello strumento sono stati pre-impostati dalla fabbrica. Le procedure per la colorazione sugli strumenti BenchMark e BenchMark XT sono le seguenti. Per ulteriori istruzioni dettagliate e altre opzioni di protocollo, consultare il manuale d'uso. La necessità di un pretrattamento del campione dipende dall anticorpo usato. Per le relative istruzioni, consultare la scheda tecnica dell anticorpo. Strumenti BenchMark e BenchMark XT 1. Applicare sul vetrino l'etichetta con codice a barre, corrispondente al protocollo da eseguire. 2. Caricare sul carosello reagenti l'anticorpo, i dispenser del detection kit adeguato ed i reagenti accessori necessari; quindi posizionarli sulla piattaforma automatica VENTANA. 3. Controllare i liquidi consumabili e svuotare le taniche di scarico. 4. Caricare i vetrini sulla piattaforma automatica VENTANA. 5. Avviare la corsa di colorazione. 6. Alla fine della corsa, rimuovere i vetrini dalla piattaforma automatica VENTANA. 7. Continuare con le procedure di processazione consigliate dopo la corsa dello strumento. 2012-03-29 2 / 5 14910IT Rev F

Procedure di processazione consigliate dopo la corsa dello strumento 1. Per eliminare la soluzione coverslip, lavare i vetrini con un detergente delicato per stoviglie. 2. Sciacquare accuratamente i vetrini in acqua distillata per rimuovere tutto il detergente. 3. Disidratare, chiarificare e montare con montante permanente. Leggere i vetrini colorati entro due o tre giorni dalla colorazione; questi tuttavia restano stabili per almeno due anni se conservati adeguatamente a temperatura ambiente (15 25 C). Procedure di controllo qualità Controllo tissutale positivo Con ogni procedura di colorazione eseguita è necessario trattare anche un controllo tissutale positivo. La prassi di laboratorio ottimale prevede l'inclusione di una sezione di controllo positivo sullo stesso vetrino del tessuto del paziente. In questo modo si può individuare una mancata applicazione dell anticorpo primario o di altro reagente critico al vetrino con il tessuto del paziente da analizzare. Un tessuto con una colorazione positiva debole è più adeguato per un controllo di qualità ottimale. I componenti del tessuto a colorazione positiva vengono usati per verificare che l'anticorpo sia stato applicato e che lo strumento funzioni adeguatamente. Il tessuto può contenere cellule o componenti di tessuto che possono colorarsi positivamente o negativamente, e servire come tessuto di controllo sia positivo che negativo. I tessuti di controllo dovrebbero provenire da un'autopsia recente, da una biopsia o da campioni chirurgici preparati o fissati il prima possibile, in modo identico alle sezioni da testare. Tali tessuti possono consentire di controllare tutte le fasi della procedura, dalla preparazione del tessuto fino alla colorazione. L'uso di una sezione di tessuto fissata o processata diversamente dal campione da testare costituisce un controllo per tutti i reagenti e le fasi del metodo eccetto le fasi di fissazione e processazione del tessuto. Utilizzare i controlli tissutali positivi noti solo per monitorare le adeguate prestazioni dei tessuti trattati e dei reagenti del test, non come aiuto per formulare una diagnosi specifica dei campioni del paziente. Se i controlli tissutali positivi non presentano una colorazione positiva, i risultati ottenuti con i campioni da testare non devono essere considerati validi. Controllo tissutale negativo Lo stesso tessuto usato per il controllo positivo può essere usato anche come controllo negativo. La varietà dei tipi di cellule presenti nella maggior parte delle sezioni dei tessuti permette di avere siti di controllo negativo interno, ma spetta all'utilizzatore verificarlo. I componenti che non si colorano dovrebbero essere privi di colorazione specifica e fornire un'indicazione della colorazione di fondo. Se nelle aree negative del tessuto di controllo si riscontra una colorazione specifica, i risultati ottenuti con i campioni del paziente non devono essere considerati validi. Discrepanze inspiegabili Riferire immediatamente al distributore locale Ventana ogni discrepanza inspiegabile nei risultati dei campioni di controllo. Se i risultati del controllo di qualità non sono conformi alle specifiche, i risultati del paziente non sono validi. Fare riferimento alla sezione Risoluzione di problemi contenuta nel presente foglietto illustrativo. Individuare e correggere il problema, poi ripetere l esame dei campioni del paziente. Controllo con reagente negativo Con ciascun campione è necessario effettuare anche un controllo con reagente negativo per una migliore interpretazione dei risultati. Un controllo con reagente negativo viene usato al posto dell'anticorpo primario allo scopo di valutare la colorazione non specifica. Il vetrino dovrebbe essere colorato con Negative Control Mouse o Negative Control Rabbit, a seconda di quale sia più adeguato. Se si usa un altro reagente di controllo negativo, diluirlo alla stessa concentrazione dell'anticorpo primario con Antibody Diluent VENTANA. Il diluente da solo può essere usato come alternativa ai controlli con reagente negativo precedentemente descritti. Il periodo d'incubazione per il reagente di controllo negativo dovrebbe essere uguale a quello dell'anticorpo primario. Quando si usano pannelli di più anticorpi su sezioni seriali, un vetrino di controllo con reagente negativo può servire come controllo negativo o di segnale di legame aspecifico per altri anticorpi. Verifica dell analisi Prima di iniziare l'impiego di un anticorpo primario o di un sistema di colorazione in una procedura diagnostica, verificare la specificità dell'anticorpo primario su una serie di tessuti positivi e negativi con prestazioni IHC note (fare riferimento alla sezione Controllo tissutale positivo contenuta nella metodica dell'anticorpo primario e alle raccomandazioni relative al controllo di qualità del College of American Pathologists Laboratory Accreditation Program, Anatomic Pathology Checklist, 3 o all'approved Guideline del CLSI 4 o ad entrambi i documenti). Queste procedure del controllo di qualità devono essere ripetute per ogni nuovo lotto di anticorpo o quando vi sia una variazione nei parametri delle metodiche. I tessuti elencati nella sezione Caratteristiche di prestazione della metodica dell'anticorpo primario sono adeguati per la verifica del saggio. Interpretazione dei risultati L'iVIEW DAB Detection Kit fa sì che un prodotto di reazione colorato di marrone precipiti in corrispondenza del sito dell'antigene localizzato dall'anticorpo primario. Prima di interpretare i risultati, un patologo qualificato esperto in procedure immunoistochimiche deve valutare i controlli e la qualità del prodotto colorato. Prima di tutto, è necessario notare la colorazione dei controlli negativi e confrontare tali risultati con il materiale colorato per verificare che il segnale generato non sia la causa di interazioni non specifiche. Controllo tissutale positivo Esaminare per primo il controllo con tessuto positivo allo scopo di verificare che tutti i reagenti funzionino correttamente. La presenza di un prodotto di reazione adeguatamente colorato all'interno delle cellule target è indice di reattività positiva. A seconda della lunghezza dell'incubazione e della potenza dell'ematossilina usata, la controcolorazione provocherà un colore dei nuclei cellulari che varia dal blu pallido al blu scuro. Una controcolorazione eccessiva o incompleta può compromettere una corretta interpretazione dei risultati. Se il controllo tissutale positivo non presenta una colorazione positiva, tutti i risultati ottenuti con i campioni da testare non devono essere considerati validi. Controllo tissutale negativo Esaminare il controllo tissutale negativo dopo quello positivo allo scopo di verificare la marcatura specifica dell'antigene target da parte dell'anticorpo primario. L'assenza di colorazione specifica nel controllo con tessuto negativo conferma l'assenza di crossreattività dell'anticorpo con cellule o componenti cellulari. Se nel controllo tissutale negativo si riscontra una colorazione specifica, i risultati ottenuti con il campione del paziente non devono essere considerati validi. La colorazione non specifica, se presente, ha un aspetto diffuso. Una leggera colorazione sporadica del tessuto connettivo può anche essere osservata in sezioni di tessuto fissato eccessivamente in formalina. Per l'interpretazione dei risultati della colorazione, usare cellule intatte. Spesso le cellule necrotiche o degenerate si colorano in modo non specifico. Tessuto del paziente Esaminare i campioni del paziente per ultimi. L'intensità della colorazione positiva dovrebbe essere valutata nel contesto di qualsiasi colorazione aspecifica di fondo del reagente di controllo negativo. Come in ogni test immunoistochimico, un risultato negativo significa che l'antigene in questione non è stato rilevato, non che l'antigene sia assente nelle cellule o nel tessuto esaminato. Se necessario, usare un gruppo di anticorpi come aiuto all'identificazione di reazioni falsamente negative. Quando si interpretano i risultati dell'immunoistochimica, esaminare anche la morfologia di ciascun campione di tessuto con una sezione colorata con ematossilina ed eosina. I dati morfologici e clinici relativi al paziente devono essere interpretati da un patologo qualificato. LIMITAZIONI Limitazioni generali 1. L'IHC è un processo diagnostico a più step che richiede una formazione specialistica sulla scelta dei reagenti appropriati, sulla selezione dei tessuti, sulla fissazione, sul processamento, sulla preparazione del vetrino e sull'interpretazione dei risultati di colorazione. 2. La colorazione del tessuto dipende dalla manipolazione e dal processamento del tessuto prima della colorazione. La fissazione, il congelamento, lo scongelamento, il lavaggio, l asciugatura, il riscaldamento o il sezionamento eseguiti in modo non corretto, oppure la contaminazione con altri tessuti o fluidi, possono produrre artefatti, intrappolamento dell anticorpo o risultati falsi negativi. Risultati incoerenti possono essere generati da variazioni nei metodi di fissazione e di inclusione, oppure da irregolarità intrinseche del tessuto. 3. Una controcolorazione eccessiva o incompleta può compromettere una corretta interpretazione dei risultati. 2012-03-29 3 / 5 14910IT Rev F

4. L'interpretazione clinica di qualunque colorazione positiva o della sua assenza deve essere valutata nel contesto dell'anamnesi clinica, della morfologia e di altri criteri istopatologici. L'interpretazione clinica di qualunque colorazione o della sua assenza deve essere integrata da studi morfologici e da controlli adeguati nonché da altri test diagnostici. È responsabilità di un patologo qualificato avere familiarità con l'uso di anticorpi, reagenti e metodiche usate per l'interpretazione della colorazione di preparati. È necessario eseguire la colorazione in un laboratorio certificato e autorizzato sotto la supervisione di un patologo responsabile della revisione dei vetrini colorati che garantisca l'adeguatezza dei controlli positivi e negativi. 5. VENTANA fornisce anticorpi e reagenti ad una diluizione ottimale per un utilizzo conforme alle istruzioni date. Qualunque deviazione dalle procedure del test consigliate potrà invalidare i risultati previsti. Utilizzare controlli adeguati e documentarne l'impiego. Gli utilizzatori che deviano dalle procedure consigliate si assumeranno la responsabilità dell'interpretazione dei risultati del paziente. 6. I reagenti possono presentare reazioni impreviste in tessuti precedentemente non testati. A causa della variabilità biologica dell'espressione antigenica in neoplasie o in altri tessuti patologici, persino in gruppi di tessuti già testati non può essere completamente eliminata la possibilità di reazioni impreviste. 5 In caso di reazioni impreviste documentate contattare il distributore locale Ventana. 7. I tessuti provenienti da persone infette dal virus dell'epatite B e contenenti l'antigene di superficie dell'epatite B (HBsAg) possono presentare una colorazione non specifica con perossidasi di rafano. 6 8. Se usati in fasi di bloccaggio, i sieri normali provenienti dalla stessa specie animale degli antisieri secondari possono dare falsi negativi o falsi positivi a causa di autoanticorpi o anticorpi naturali. 9. Come in ogni test immunoistochimico, un risultato negativo significa che l'antigene non è stato rilevato, non che l'antigene sia assente nelle cellule o nel tessuto esaminato. Limitazioni specifiche 1. Ogni fase della procedura del detection kit è stata ottimizzata sugli strumenti BenchMark e BenchMark XT ed è pre-impostata. A causa delle variazioni nella fissazione e nella processazione dei tessuti, può essere necessario aumentare o diminuire il tempo di incubazione dell'anticorpo primario a seconda dei singoli campioni. Il tempo d'incubazione dell'anticorpo primario dipende dal livello di fissazione del tessuto e può essere compreso fra 8 e 32 minuti. Per ulteriori informazioni sulle variabili di fissazione, fare riferimento a Immunohistochemistry Principles and Advances 7 o Immunomicroscopy: A Diagnostic Tool for the Surgical Pathologist. 8 2. Il detection kit, in combinazione con gli anticorpi primari e gli accessori Ventana, rileva l'antigene che resiste alla normale fissazione in formalina nonché alla processazione e al sezionamento del tessuto. 3. Questo detection kit è stato ottimizzato per l uso con la soluzione di lavaggio Reaction Buffer, gli anticorpi primari, gli accessori e gli strumenti BenchMark VENTANA. L'uso della soluzione di lavaggio Reaction Buffer è importante per il funzionamento corretto del detection kit. Gli utilizzatori che deviano dalle procedure del test consigliate sono responsabili dell'interpretazione dei risultati del paziente in tali circostanze. 4. Questo detection kit è stato ottimizzato per l uso con LCS (Predilute), anche noto come LCS o Liquid Coverslip (High Temperature). LCS è una soluzione coverslip prediluita usata come barriera fra i reagenti acquosi e l'aria nonché come reagente atto a rimuovere la paraffina dai campioni tissutali durante il processo di sparaffinatura. La barriera di LCS riduce l'evaporazione e fornisce un ambiente acquoso stabile per l'ihc o per reazioni di ibridazione in situ (ISH) effettuate su piattaforme automatiche VENTANA. 5. Tempi e temperature di incubazione diversi da quelli specificati possono provocare risultati errati. È necessario che l'utilizzatore convalidi qualunque modifica di questo genere. CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE Studi relativi alla riproducibilità Il test di riproducibilità dell'iview DAB Detection Kit è stato effettuato colorando sezioni seriali di 3 tessuti fissati in formalina neutra tamponata ed inclusi in paraffina, utilizzando 3 anticorpi primari: un anticorpo IgG di topo (anti-cd45ro) colorato su tonsille, un anticorpo IgM di topo (anti-cd57) colorato su tonsille e un anticorpo IgG di coniglio (anti- PSA) colorato sulla prostata, usando le piattaforme automatiche BenchMark VENTANA. Tutti gli anticorpi primari sono stati incubati per almeno 16 minuti, ed i vetrini sono stati controcolorati con Hematoxylin seguita da Bluing Reagent. Tutti i vetrini colorati con un anticorpo primario sono stati confrontati tra loro, per verificare l adeguatezza e l'intensità della colorazione, e sono stati valutati da un lettore di vetrini qualificato. a. La riproducibilità all interno della stessa corsa (stesso anticorpo primario colorato su una piattaforma di colorazione equivalente) è stata determinata con 1 corsa di colorazione al giorno in 3 giorni diversi per ogni tipo di coloratore (strumento BenchMark). Ogni corsa comprendeva 10 vetrini per anticorpo primario specifico, quindi 1 corsa da 10 vetrini per ogni anticorpo su ogni tipo di coloratore. La riproducibilità all interno della stessa corsa è risultata del 100 % (10 vetrini su 10 per ogni anticorpo e per ogni giorno) per la piattaforma automatica BenchMark VENTANA. b. La riproducibilità tra una corsa e l altra è stata calcolata sulla base del numero di vetrini colorati in 3 corse per ogni tipo di coloratore. È stata effettuata 1 corsa al giorno in 3 giorni separati, per ogni tipo di coloratore (strumento BenchMark). Ogni corsa comprendeva 10 vetrini per anticorpo primario specifico, quindi 1 corsa da 30 vetrini per ogni anticorpo, per un periodo di 3 giorni. La riproducibilità tra una corsa e l altra è risultata del 100 % (30 vetrini su 30 per ogni anticorpo) per la piattaforma automatica BenchMark VENTANA. c. La riproducibilità tra uno strumento e l altro è stata calcolata sulla base del numero di vetrini colorati in 9 corse su tutti i tipi di coloratori. È stata effettuata 1 corsa al giorno in 3 giorni separati, per ogni tipo di coloratore (strumento BenchMark). La riproducibilità fra uno strumento e l altro dell'iview DAB Detection Kit è risultata del 100 % (90 vetrini colorati su 90, i vetrini valutati comprendevano tutti e 3 gli anticorpi primari). RISOLUZIONE DI PROBLEMI 1. Se il controllo positivo ha una colorazione più debole del previsto, devono essere verificati altri controlli positivi durante la stessa corsa sullo strumento, al fine di determinare se ciò va attribuito all'anticorpo primario o ad uno dei reagenti secondari comuni. 2. Se il controllo positivo risulta negativo, verificare che il vetrino abbia l'etichetta con il codice a barre corretto. Se il vetrino è etichettato correttamente, devono essere verificati altri controlli positivi durante la stessa corsa sullo strumento, al fine di determinare se ciò va attribuito all'anticorpo primario o ad uno dei reagenti secondari comuni. È probabile che i tessuti siano stati prelevati, fissati o sparaffinati in modo non corretto. Seguire la procedura adeguata per il prelievo, la conservazione e la fissazione. 3. Se ha luogo una colorazione di fondo eccessiva, possono essere presenti livelli elevati di biotina endogena. Includere il blocco della biotina nella metodica di colorazione (Endogenous Biotin Blocking Kit). 4. Se non è stata rimossa tutta la paraffina, è possibile che non ci sia alcuna colorazione. Ripetere la procedura di sparaffinatura. 5. Se la colorazione specifica dell'anticorpo è troppo intensa, ripetere la corsa con un tempo di incubazione abbreviato ad intervalli di 4 minuti fino al raggiungimento dell'intensità di colorazione desiderata. 6. Se le sezioni di tessuto si distaccano dal vetrino, controllare i vetrini per verificare che siano caricati positivamente. 7. Per azioni correttive, fare riferimento alla sezione Istruzioni per l'uso o al manuale d uso dello strumento, oppure consultare il distributore locale Ventana. 8. Se il dispenser di reagente non dispensa liquido, controllare la camera di irrigazione o il menisco per eventuali materiali estranei o particolati, quali fibre o precipitati. Se il dispenser è bloccato, non usarlo e consultare il distributore locale Ventana. Altrimenti, irrigare il dispenser un'altra volta, posizionandolo sopra un contenitore di rifiuti, rimuovendo il tappo del vaporizzatore e premendo verso il basso sulla parte superiore del dispenser. 2012-03-29 4 / 5 14910IT Rev F

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