Streptavidina coniugata con perossidasi di rafano in PBS contenente una proteina stabilizzante e agenti antibatterici.

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1 Dako LSAB2 System-HRP Codice K ml Codice K ml Codice K ml Uso previsto Per uso diagnostico In Vitro. Queste istruzioni si applicano al sistema universale Dako Labelled Streptavidin-Biotin2 System, Horseradish Peroxidase (LSAB2 System, HRP). Questo sistema è destinato all'uso con anticorpi primari di topo o coniglio reperiti dall'utente. Consente di effettuare l'identificazione qualitativa di antigeni mediante microscopia ottica e immunoistochimica su tessuti inclusi in paraffina, tessuti criostatati e preparati cellulari, al fine di facilitare la diagnosi di malattie patologiche. È possibile utilizzare tessuti trattati con una varietà di fissativi, tra cui etanolo, B-5, Bouin, formalina di zinco e formalina neutra tamponata. Fare riferimento alle General Instructions for Immunohistochemical Staining (Istruzioni generali per la colorazione immunoistochimica) di Dako o alle istruzioni sul sistema di rivelazione per le procedure IHC per: 1) Principio della procedura, 2) Materiali necessari ma non forniti, 3) Conservazione, 4) Preparazione dei campioni, 5) Procedura per la colorazione, 6) Controllo della qualità, 7) Risoluzione dei problemi, 8) Interpretazione della colorazione, 9) Limiti generali. Cenni introduttivi Il sistema LSAB2 System, HRP si basa sulla tecnica avidina-biotina marcata (LAB) modificata in cui un anticorpo secondario biotinilato forma un complesso con le molecole di streptavidina coniugate con perossidasi. 1 A confronto con il metodo ABC, è stato riportato che il metodo LAB/LSAB è da quattro a otto volte più sensibile. 2 Giorno, et al, 2 attribuiscono l'aumento di sensibilità alla dimensione più piccola del complesso di (strept)avidina marcato con l'enzima del metodo LAB/LSAB a confronto con il complesso enzimatico di avidina-biotina del metodo ABC. L'interpretazione clinica della colorazione positiva o dell'assenza di colorazione deve essere integrata con studi morfologici e istologici eseguiti con i controlli opportuni. La valutazione deve tenere conto dell'anamnesi del paziente e deve basarsi su ulteriori esami diagnostici eseguiti da un operatore qualificato. Principio della procedura Il sistema LSAB2 System, HRP rappresenta una procedura IHC sensibile e versatile che consente l'elaborazione simultanea di diversi campioni con anticorpi primari di coniglio o di topo in meno di un'ora. L'attività di perossidasi endogena può essere inibita incubando il campione per 5 minuti con il 3% di perossido di idrogeno. Dopodichè, il campione viene incubato con un anticorpo primario di coniglio o di topo, adeguatamente caratterizzato e diluito, quindi sottoposto ad una sequenza di incubazioni di 10 minuti con un anticorpo di collegamento biotinilato (contenente immunoglobuline anti-coniglio e anti-topo) e streptavidina marcata con perossidasi. La colorazione viene completata dopo un'incubazione eseguita con il cromogeno-substrato (AEC o DAB). Per AEC in K0672, si tratta di un'incubazione di 10 minuti con l'uso di un cromogeno-substrato (AEC) (3-amino-9-etilcarbazole) che genera un precipitato di colore rosso in corrispondenza del sito dell'antigene. Per DAB in K0673, si tratta di un'incubazione di 5 10 minuti con l'uso di un cromogeno-substrato (DAB) (3-3'-diaminobenzidina) che genera un precipitato di colore marrone in corrispondenza del sito dell'antigene. Reagenti forniti Codice K0672 Il kit comprende i seguenti materiali, sufficienti per 150 sezioni di tessuto, considerando 100 µl per sezione: Quantità Descrizione Blocco della perossidasi Perossido di idrogeno al 3% in acqua. Anticorpo di collegamento Immunoglobuline di capra anti-coniglio e anti-topo, isolate per affinità e marcate con biotina, in soluzione salina tamponata al fosfato (PBS), contenente una proteina stabilizzante e 0,015 mol/l di sodio azide. Streptavidina-HRP Streptavidina coniugata con perossidasi di rafano in PBS contenente una proteina stabilizzante e agenti antibatterici. Cromogeno-substrato AEC AEC in N,N-dimetilformammide (DMF) e tampone acetato, ph 5,0, contenente perossido di idrogeno, stabilizzanti, enhancer e un agente antimicrobico. Conservare a 2 8 C. ( ) IT_001 p. 1/8

2 Codice K0673 Il kit comprende i seguenti materiali, sufficienti per 150 sezioni di tessuto, considerando 100 µl per sezione: Quantità Descrizione Blocco della perossidasi Perossido di idrogeno al 3% in acqua. Biotinylated Link Immunoglobuline di capra anti-coniglio e anti-topo, isolate per affinità e marcate con biotina, in soluzione salina tamponata al fosfato (PBS), contenente una proteina stabilizzante e 0,015 mol/l di sodio azide. Streptavidina-HRP Streptavidina coniugata con perossidasi di rafano in PBS contenente una proteina stabilizzante e agenti antibatterici. Substrato 1x18 ml Tampone imidazolo-hcl a ph 7,5 contenente perossido di idrogeno e un agente antibatterico. Cromogeno DAB 1x1 ml 3,3'-diamminobenzidina in soluzione cromogena. Accessori 1 Provetta per analisi calibrata 1 Pipetta Pasteur in plastica Codice K0675(11) Il kit comprende i seguenti materiali, sufficienti per 1100 sezioni di tessuto, considerando 100 µl per sezione: Quantità 1x110 ml Descrizione Biotinylated Link Immunoglobuline di capra anti-coniglio e anti-topo, isolate per affinità e marcate con biotina, in soluzione salina tamponata al fosfato (PBS), contenente una proteina stabilizzante e 0,015 mol/l di sodio azide. 1x110 ml Streptavidina-HRP Streptavidina coniugata con perossidasi di rafano in PBS contenente una proteina stabilizzante e agenti antibatterici. Codice K0675(89) Il kit comprende i seguenti materiali, confezionati per l'uso con lo strumento Dako Autostainer (codice S3400): Quantità 10x11 ml Descrizione Biotinylated Link Immunoglobuline di capra anti-coniglio e anti-topo, isolate per affinità e marcate con biotina, in soluzione salina tamponata al fosfato (PBS), contenente una proteina stabilizzante e 0,015 mol/l di sodio azide. 10x11 ml Streptavidina-HRP Streptavidina coniugata con perossidasi di rafano in PBS contenente una proteina stabilizzante e agenti antibatterici. ( ) IT_001 p. 2/8

3 Materiali necessari ma non forniti Panni assorbenti Anticorpi: anticorpi serie N pronti all'uso o concentrati, diluiti in Antibody Diluent (codice S0809 o S3022) Antibody Diluent (codice S0809 o S3022) Tessuti di controllo, positivo e negativo Colorazione di contrasto; acquosa, ad esempio Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (codice S3309) Vetrini coprioggetto Acqua distillata Forno essiccante, in grado di mantenere una temperatura di 60 C o inferiore. Etanolo, assoluto e al 95% Microscopio ottico (20x 800x) Mezzi di montaggio, ad esempio Faramount (codice S3025) o Glycergel (codice C0563) Reagenti di controllo negativo Vetrini, polilisinati oppure silanizzati del tipo Silanized Slides (codice S3003) Vaschette o bagni per la colorazione Contaminuti (per intervalli di 2 10 minuti) Spruzzette Soluzione tampone di lavaggio Xilene, toluene o derivati dello xilene Per il sistema K0675 LSAB2 (110 ml), è necessario aggiungere i seguenti reagenti all'elenco sopra riportato: perossido di idrogeno, 3% di soluzione o Peroxidase Block (codice S2001) soluzione cromogeno-substrato, quale AEC Substrate-Chromogen (codice K3464, 110 ml, pronta per l'uso) o Liquid DAB (codice K3466) Materiali opzionali, non forniti Tamponi: Wash buffer (codice S3006) per l'utilizzo automatizzato e manuale Phosphate buffered saline (codice S3024) Tris-buffered saline (codice S3001 o S1968) Enzimi proteolitici: Pepsin (codice S3002) Proteinase K (codice S3004 o S3020) Proteolytic Enzyme, RTU (codice S3007) Altri materiali: Vetrini di controllo positivo (disponibili presso Dako) Target Retrieval Solution (codice S1699 o S1700) Target Retrieval Solution, High ph (codice S3307 o S3308) Target Retrieval Solution, ph 9 (codice S2367 o S2368) Camera umidificata Idrossido di ammonio, 15 mol/l, diluito a 0,037 mol/l Precauzioni Specifiche del prodotto 1. Per uso professionale. 2. Questo prodotto contiene sodio azide (NaN 3), una sostanza chimica fortemente tossica in forma pura. Sebbene alle concentrazioni indicate non sia classificato come prodotto a rischio, il contenuto di NaN 3 può reagire con il rame e il piombo delle tubature formando azidi metalliche fortemente esplosive. Durante lo smaltimento, sciacquare le tubature con abbondante acqua per prevenire l eventuale accumulo di azide. 3,4 3. I cromogeni substrato AEC e DAB sono sensibili alla contaminazione ad opera di molteplici agenti ossidanti, quali metalli, batteri, polvere e strumenti di vetro comunemente usati in laboratorio. Per impedire la contaminazione e la scadenza prematura, evitare l'esposizione delle soluzioni AEC o DAB a potenziali fonti di contaminazione e non pipettare mai direttamente dal flacone. Erogare prima il volume necessario in un contenitore pulito, quindi pipettare dal contenitore. Non rimettere la soluzione AEC o DAB inutilizzata nel contenitore originale. 4. I reagenti forniti sono stati diluiti in modo ottimale. Ulteriori diluizioni potrebbero causare la perdita di colorazione antigenica. Qualunque variazione deve essere convalidata dall'utente. Le differenze che esistono tra i laboratori (per quanto riguarda il modo di trattare il tessuto o di eseguire le procedure tecniche) possono determinare una certa variabilità dei risultati, per cui si rendono necessari controlli interni periodici. 5. Non sostituire con reagenti appartenenti ad altri numeri di lotto o a kit di altri produttori. 6. Tempi o temperature di incubazione diversi da quelli indicati potrebbero produrre risultati erronei. Le eventuali modifiche dovranno essere convalidate dall utente. 7. Gli enzimi e i cromogeni possono subire alterazioni se esposti a livelli di luce eccessivi. Evitare di conservare i componenti del kit e di eseguire la colorazione in condizioni di luce intensa, ad esempio sotto la luce diretta del sole. Generali 1. Adottare le normali procedure previste per il trattamento dei prodotti di origine biologica. 2. Ridurre al minimo la contaminazione batterica dei reagenti, altrimenti si potrebbero ottenere risultati errati. 3. Evitare di spruzzare reagenti o di generare aerosol. 4. Di regola, non è consentito ai minori di 18 anni di lavorare con questo prodotto. È necessario preparare con attenzione gli utenti sulla corretta procedura, sulle proprietà rischiose del prodotto e sulle norme di sicurezza necessarie. 5. Indossare indumenti di protezione personale adeguati, per evitare il contatto con gli occhi e la pelle. Smaltire i reagenti inutilizzati nel rispetto delle disposizioni locali, regionali e nazionali previste in materia. 6. Su richiesta, è disponibile una scheda di sicurezza per utenti professionisti. ( ) IT_001 p. 3/8

4 Dichiarazioni sui rischi e sulla sicurezza K Cromogeno-substrato AEC pronto per l'uso: 1-<10% N,N-dimetilformammide / Simbolo di pericolo: Tossico R61 S35 S45 S53 Può danneggiare i bambini non ancora nati. Questo prodotto e il relativo recipiente devono essere smaltiti con le opportune precauzioni. In caso di incidente o di malessere consultare immediatamente il medico (se possibile, mostrargli l etichetta). Evitare l esposizione procurarsi speciali istruzioni prima dell uso. Riservato agli utenti professionisti. K Cromogeno DAB: 1-5% di tetracloruro di bifenil-3,3,4,4 -tetrailtetraammonio / Simbolo di pericolo: Nocivo R40 Possibilità di effetti cancerogeni prove insufficienti. R43 Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. R68 Possibilità di effetti irreversibili. S35 Questo prodotto e il relativo recipiente devono essere smaltiti con le opportune precauzioni. S36/37 Usare indumenti protettivi e guanti adatti. Conservazione I reagenti dell'lsab2 System, HRP devono essere conservati a 2 8 C. Non congelare. Non utilizzare dop o la data di scadenza stampata sulle fiale dei reagenti e sulla confezione del kit. In caso di conservazione dei reagenti in condizioni diverse da quelle specificate, è necessaria la convalida da parte dell'utente. 5 Le soluzioni cromogeno-substrato AEC e DAB non sono stabili a temperature superiori a 8 C. Utilizzare e conservare le soluzioni cromogeno-substrato AEC e DAB all'interno dell'intervallo di temperatura consigliato 2 8 C. Queste sol uzioni possono essere utilizzate subito dopo il prelievo dal frigorifero. Dopo l'uso, riportare nel più breve tempo possibile alla temperatura di conservazione di 2 8 C. Non sono stati osservati segni evidenti che suggeriscano l'instabilità di questi prodotti. Pertanto, è opportuno analizzare un controllo positivo e un controllo negativo contemporaneamente ai campioni dei pazienti. Qualora si ottenga una colorazione imprevista, che non sia giustificata da un cambiamento delle procedure di laboratorio ma sia dovuta ad un probabile problema del kit per analisi, contattare l'assistenza Tecnica Dako. Preparazione dei reagenti Per ragioni di praticità, prima di procedere alla colorazione è opportuno preparare i reagenti elencati di seguito. Soluzione tampone di lavaggio TBST, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline with Tween (codice S3006) rappresenta il tampone di lavaggio consigliato per le procedure di rilevazione IHC manuali e automatizzate. TBS, 0,05 mol/l Tris buffered Saline (codice S1968) e PBS, 0,02 mol/l Phosphate Buffered Saline (codice S3024) sono anche queste soluzioni di tampone di lavaggio adatte per la colorazione manuale. Si sconsiglia l'uso di soluzioni contenenti sodio azide come tamponi di lavaggio. La sodio azide inattiverebbe la perossidasi di rafano (HRP) provocando una colorazione negativa. Conservare la soluzione inutilizzata a 2 8 C. Getta re la soluzione tampone, se appare torbida. È possibile utilizzare acqua distillata per sciacquare il perossido di idrogeno, la soluzione cromogeno-substrato e la colorazione di contrasto. Anticorpo primario È disponibile una vasta gamma di anticorpi primari serie N pronti per l'uso e di reagenti di controllo negativo per l'utilizzo con i sistemi LSAB2 Systems. Presso Dako, sono disponibili anche gli anticorpi concentrati; tuttavia, l'utente deve determinare in modo sperimentale le diluizioni ottimali. Preparare le diluizioni con il prodotto Antibody Diluent (codice S0809) contenente tampone Tris-HCI 0,05 mol/l, ph 7,2 7,6, e albumina di siero bovino (BSA) all'1%. La BSA agisce come blocco della proteina ed elimina la necessità di un'incubazione separata con il reagente di blocco della proteina. Antibody Diluent with Background Reducing Components (codice S3022) è adatto anche per essere utilizzato come diluente. Si sconsiglia di utilizzare del diluente senza trasportatore di proteina. Per la maggior parte degli anticorpi primari impiegati con i sistemi LSAB2 Systems, è sufficiente un'incubazione di 10 minuti. Reagente di controllo negativo Un reagente di controllo negativo ideale dovrebbe contenere un anticorpo che non manifesti alcuna reattività specifica con i tessuti umani (non reattivo con tessuti umani) nella stessa matrice/soluzione dell'anticorpo primario. L'anticorpo non reattivo con i tessuti umani dovrebbe appartenere alla stessa sottoclasse e alla stessa specie animale dell'anticorpo primario e dovrebbe essere diluito alla stessa concentrazione di immunoglobuline o proteine che è propria dell'anticorpo primario diluito, utilizzando lo stesso diluente. In base al tipo di anticorpo primario/antisiero utilizzato, potrebbe essere adatto per l'uso il siero normale/non immune delle stesse specie come primario ad una concentrazione della proteina equivalente al primario diluito nello stesso diluente. Il periodo di incubazione del reagente di controllo negativo deve corrispondere a quello dell'anticorpo primario/antisiero. Quando si usano gli anticorpi di serie N pronti all'uso Dako, il reagente di controllo negativo consigliato è Universal Negative Control. Questi controlli sono ottimizzati per l'uso con anticorpi di serie N pronti all'uso di topo (codice N1698) o di coniglio (codice N1699). Soluzione substrato-cromogeno Il sistema K0672 LSAB2 System contiene l'aec pronta all'uso, pronta per l'applicazione sui campioni di tessuto o cellulari. Il sistema K0673 LSAB2 System contiene DAB, da prepararsi come segue. Aggiungere 1 goccia (o 20 µl) del cromogeno DAB per ogni ml di tampone substrato. Utilizzare la provetta per analisi graduata, fornita con il kit, per misurare la quantità di tampone substrato necessaria. Mescolare con cura e applicare la soluzione utilizzando la pipetta fornita con il kit. Dopo l'uso, lavare accuratamente la provetta per analisi graduata e la pipetta con acqua distillata. La soluzione di lavoro DAB inutilizzata è stabile per un massimo di 2 settimane, se conservata a 2 8 C. Se si osserva la formazione di un precipitato, mescolare bene prima dell'uso. Ready-to-use AEC Substrate- Chromogen Solution (codice K3464, 110 ml) o Liquid DAB (codice K3466) sono consigliati per l'uso con il sistema LSAB2 System, HRP, 110 ml (codice K0675). Seguire le istruzioni fornite con ogni sistema cromogeno-substrato per la preparazione del cromogenosubstrato. ( ) IT_001 p. 4/8

5 Colorazione di contrasto Il cromogeno DAB genera un prodotto finale insolubile in alcol e può essere utilizzato con ematossilina a base di alcol. Quando si utilizza il cromogeno-substrato AEC, il prodotto finale colorato della reazione di colorazione è alcol solubile e deve essere utilizzato solamente con colorazioni di contrasto acquose, quali Mayer s Hematoxylin. Dopo la colorazione di contrasto con ematossilina, effettuare un risciacquo accurato in acqua distillata e immergere i vetrini contenenti il tessuto in un bagno di soluzione ammoniacale 0,037 mol/l. La soluzione ammoniacale 0,037 mol/l viene preparata miscelando 2,5 ml di idrossido di ammonio 15 mol/l (concentrato) in 1 litro di acqua. La soluzione ammoniacale 0,037 mol/l inutilizzata può essere conservata in un flacone perfettamente sigillato a temperatura ambiente (20 25 C) per 12 m esi. Consultare le istruzioni fornite dai produttori per eventuali colorazioni di contrasto alternative. Mezzi di montaggio Come mezzi di montaggio acquoso si consigliano i prodotti Faramount Aqueous Mounting Medium, pronto per l'uso (codice S3025) o Glycergel Mounting Medium (codice C0563). Liquefare Glycergel prima dell uso, riscaldando il mezzo fino a 40 ±5 C circa. Preparazione dei campioni Fare riferimento alla sezione General Instructions for Immunohistochemical Staining (Istruzioni generali per la colorazione immunoistochimica) e/o al foglio contenente le specifiche sull'anticorpo. Prima che la colorazione IHC abbia luogo, i tessuti devono essere fissati e trattati. La fissazione impedisce l'autolisi e la putrefazione dei tessuti asportati, preserva l'antigenicità, migliora l'indice di rifrazione dei costituenti del tessuto e aumenta la resistenza degli elementi cellulari al trattamento del tessuto. Il tessuto viene sottoposto a disidratazione, diafanizzazione degli agenti disidratanti, infiltrazione di mezzi inclusivi, inclusione e infine sezionamento. I fissativi più comuni per i preparati di tessuto destinati alle procedure IHC sono descritti nella sezione General Instructions for Immunohistochemical Staining (Istruzioni generali per la colorazione immunoistochimica). Queste informazioni sono fornite esclusivamente come linee guida. Le procedure ottimali dovranno essere definite e verificate dall utente. Procedura per la colorazione Note sulla procedura Prima dell'uso, l'utente deve leggere attentamente le istruzioni fornite di seguito e studiare il contenuto del sistema. I reagenti e le istruzioni fornite in questo sistema di analisi sono state studiate per assicurare una prestazione ottimale. L'ulteriore diluizione dei reagenti del sistema o una variazione dei tempi o delle temperature di incubazione potrebbero generare risultati erronei. Tutti i reagenti del sistema, ad eccezione del cromogeno-substrato AEC, devono essere equilibrati a temperatura ambiente (20 25 C) prima dell'immunocolorazione. Analogamente, tutte le fasi di incubazione devono svolgersi a temperatura ambiente. Il cromogenosubstrato AEC può essere usato subito dopo il prelievo dalla conservazione a freddo, senza dover raggiungere la temperatura ambiente prima dell'uso. Dopo l'utilizzo, riportare ad una temperatura di conservazione di 2 8 C. Temp erature di conservazione superiori a 8 C possono compromettere la stabilità del cromogeno-substrato AEC. Evitare che le sezioni di tessuto si secchino durante la procedura di colorazione. Sezioni di tessuto essiccato possono presentare un fenomeno di colorazione aspecifica. Coprire i vetrini per proteggerli dalle correnti d'aria. Se le incubazioni devono protrarsi nel tempo, collocare i tessuti in un ambiente umido. Nel caso sia necessario interrompere il protocollo di colorazione, i vetrini possono essere conservati in un bagno tampone dopo l'incubazione dell'anticorpo di collegamento (Fase 3) per un'ora a temperatura ambiente (20 25 C) senz a alterazione della colorazione. La sensibilità del LSAB2 System, HRP può essere ulteriormente aumentata allungando i tempi di incubazione della fasi 2, 3 e 4 di 30 ±5 minuti l'uno. Protocollo di colorazione FASE 1 BLOCCO DELLA PEROSSIDASI Picchiettare per eliminare il liquido in eccesso. Utilizzando carta bibula (ad esempio Kimwipe o carta di tessuto assorbente), asciugare accuratamente il vetrino attorno al campione per rimuovere il liquido in eccesso e mantenere i reagenti all interno dell area prescritta. Applicare una quantità di Peroxidase Block sufficiente a coprire il campione. Incubare per 5 (±1) minuti. Sciacquare delicatamente con acqua distillata o soluzione tampone da una spruzzetta (fare attenzione a non indirizzare il flusso direttamente sul tessuto) e collocare in un bagno tampone fresco. FASE 2 FASE 3 ANTICORPO PRIMARIO O REAGENTE DI CONTROLLO NEGATIVO Picchiettare per eliminare il liquido in eccesso e asciugare i vetrini come descritto precedentemente. Applicare una quantità di anticorpo primario o di reagente di controllo negativo sufficiente per coprire il campione. Incubare per 10 (±1) minuti, se non diversamente specificato. Sciacquare delicatamente con soluzione tampone da una spruzzetta (fare attenzione a non indirizzare il flusso direttamente sul tessuto) e collocare in un bagno tampone fresco. BIOTINYLATED LINK Picchiettare immediatamente per eliminare il tampone in eccesso e asciugare i vetrini come descritto precedentemente. Applicare una quantità sufficiente di gocce GIALLE dell'anticorpo di collegamento in modo da coprire il campione. Incubare per 10 (±1) minuti. Sciacquare i vetrini come nella fase 2. Nel caso sia necessario interrompere il protocollo di colorazione, i vetrini possono essere conservati in un bagno tampone dopo l'incubazione dell'anticorpo di collegamento (Fase 3) per un'ora a temperatura ambiente (20 25 C) senza alterazione della colorazione. ( ) IT_001 p. 5/8

6 FASE 4 FASE 5 FASE 6 FASE 7 STREPTAVIDINA-HRP Asciugare i vetrini come descritto precedentemente. Applicare una quantità sufficiente di gocce ROSSE del reagente Streptavidina in modo da coprire il campione. Incubare per 10 (±1) minuti. Sciacquare i vetrini come descritto precedentemente. SOLUZIONE CROMOGENO-SUBSTRATO Rimuovere le soluzione cromogeno-substrato AEC o DAB dalla conservazione a 2 8 C. Per la preparazione DAB, fare riferimento alla sezione Preparazione dei reagenti. Asciugare i vetrini come descritto precedentemente. Applicare una quantità sufficiente di soluzione cromogeno-substrato AEC o DAB in modo da coprire il campione. Riportare il cromogeno-substrato AEC o DAB alla conservazione refrigerata. Incubare per 10 (±1) minuti per AEC e per 5 10 minuti per DAB. Sciacquare delicatamente con acqua distillata da una spruzzetta (fare attenzione a non dirigere il flusso direttamente sul tessuto). Raccogliere il cromogeno-substrato AEC o DAB da eliminare in un contenitore per materiali pericolosi e smaltire in modo appropriato. COLORAZIONE DI CONTRASTO CON EMATOSSILINA (FACOLTATIVA) Immergere i vetrini in un bagno di ematossilina. Incubare per due-cinque (2 5) minuti, a seconda dell'intensità dell'ematossilina utilizzata. Sciacquare delicatamente in un bagno di acqua distillata. Immergere i vetrini 10 volte in un bagno di soluzione ammoniacale 0,037 mol/l (facoltativo). Sciacquare i vetrini in un bagno di acqua distillata o deionizzata per due-cinque (2 5) minuti. MONTAGGIO È possibile montare i campioni e applicare i vetrini coprioggetto con un mezzo di montaggio acquoso, come ad esempio Faramount (code S3025) o Glycergel (code C0563). Nota: il prodotto della reazione AEC è solubile in solventi organici, pertanto non è compatibile con i mezzi di montaggio permanenti a base di toluene o xilene. Nota: è possibile montare DAB con qualsiasi mezzo di montaggio permanente. Nota: è possibile leggere i vetrini in qualunque momento; tuttavia, se i vetrini sono esposti alla luce intensa per una settimana, si potrebbe assistere a un certo grado di scolorimento. Per evitare che ciò accada, conservare i vetrini al buio a temperatura ambiente (20 25 C). Controllo della qualità Le differenze che esistono tra i laboratori (per quanto riguarda il modo di trattare il tessuto o di eseguire le procedure tecniche) possono determinare una certa variabilità dei risultati, per cui si rendono necessari controlli interni periodici. Per ulteriori informazioni, consultare le linee guida sul controllo della qualità stabilite dal College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry e i riferimenti bibliografici 6 8. Per informazioni dettagliate sulla sensibilità e sull'immunoreattività, fare riferimento al foglietto illustrativo dei singoli anticorpi primari. Per ulteriori informazioni sui controlli positivi e negativi, fare riferimento alla pubblicazione "General Instructions for Immunohistochemical Staining" (Istruzioni generali per la colorazione immunoistochimica). Interpretazione dei risultati della colorazione Per conoscere le linee guida sull'interpretazione dei risultati, fare riferimento a "General Instructions for Immunohistochemical Staining" (Istruzioni generali per la colorazione immunoistochimica). Limiti generali Per conoscere i limiti generali della procedura, fare riferimento a "General Instructions for Immunohistochemical Staining" (Istruzioni generali per la colorazione immunoistochimica). Limiti specifici del prodotto I reagenti del sistema LSAB2 System forniti da Dako sono diluiti in modo ottimale per essere impiegati secondo il protocollo IHC descritto, su sezioni di tessuto incluse in paraffina, criostati e strisci di sangue. Qualsiasi variazione apportata alle procedure di analisi consigliate rischia di provocare risultati non validi. È indispensabile documentare l'uso di controlli adeguati. Gli utenti che modificano le procedure di analisi consigliate sono tenuti ad assumersi la piena responsabilità per l'interpretazione dei risultati dei pazienti nelle circostanze in causa. È stata osservata un'attività endogena di legame all'avidina (EABA) nelle sezioni congelate di fegato (nodulo epatico intero) e di rene (epitelio tubulare), nonché nei tessuti linfoidi congelati e fissati in formalina (istiociti paracorticali) L'EABA può essere eliminata con una sequenza di incubazioni di 20 minuti, prima con lo 0,1% di avidina, poi con lo 0,01% di biotina in un tampone 0,05 M Tris-HCl, ph 7,2 7,6, prima di colorare o utilizzare il sistema Biotin Blocking System (codice X0590). L'attività endogena di perossidasi o pseudoperossidasi è osservabile nelle emoproteine quali l'emoglobina, la mioglobina, il citocromo e la catalasi, nonché negli eosinofili. 13,14 Nel tessuto fissato in formalina, questa attività può essere inibita incubando i campioni con il 3% di perossido di idrogeno per cinque minuti prima dell'applicazione dell'anticorpo primario. Gli strisci di midollo osseo e sangue e i tessuti congelati possono essere trattati con Peroxidase Blocking Reagent (codice S2001). Questa procedura non elimina comunque il pigmento rossiccio-marrone delle emoproteine. In alternativa, è possibile utilizzare una soluzione di metanolo e perossido di idrogeno. Alcuni antigeni possono denaturarsi per effetto di questo trattamento. ( ) IT_001 p. 6/8

7 I reagenti potrebbero provocare reazioni impreviste in tessuti che non sono mai stati analizzati in passato. Inoltre, non si esclude la possibilità che si verifichino reazioni impreviste in gruppi di tessuti già analizzati in passato, vista l'elevata variabilità biologica dell'espressione antigenica nelle neoplasie o in altri tessuti patologici. 8 Contattare l'assistenza Tecnica Dako per comunicare le reazioni impreviste, fornendo tutta la documentazione del caso. I tessuti delle persone infette dal virus dell'epatite B e contenenti l'antigene di superficie dell'epatite B (HBsAg) possono essere interessati da una colorazione aspecifica con la perossidasi di rafano. 15 Risoluzione dei problemi Problema Probabile causa Intervento consigliato 1. Nessuna colorazione dei vetrini. 1a. I reagenti non sono stati utilizzati 1a. Rivedere l'applicazione dei reagenti. 2. Colorazione debole di tutti i vetrini. 3. Colorazione di fondo eccessiva in tutti i vetrini, compresi i vetrini di controllo negativo. 4. Le sezioni di tessuto si staccano dai vetrini. 5. Colorazione specifica troppo intensa. nell'ordine corretto. 1b. È presente sodio azide nel bagno tampone. 1c. Il reagente cromogeno-substrato è stato mescolato non correttamente. 2a. Le sezioni trattengono troppa soluzione dopo il bagno di lavaggio. 2b. I vetrini non sono stati incubati con i reagenti per una quantità di tempo sufficiente. 2c. Colorazione di contrasto non compatibile o mezzi di montaggio che dissolvono il prodotto di reazione. 3a. I campioni contengono un'attività di perossidasi endogena elevata. 3b. La paraffina è stata rimossa parzialmente. 3c. I vetrini sono stati risciacquati male. 3d. Reazione substrato più veloce del normale, causata da una temperatura ambiente eccessivamente alta. 3e. Le sezioni si sono asciugate durante la procedura di colorazione. 3f. Legami aspecifici dei reagenti con la sezione di tessuto. 1b. Utilizzare un tampone fresco, privo di azide. 1c. Creare una soluzione cromogenosubstrato fresca in base al protocollo del kit. 2a. Eliminare la soluzione in eccesso picchiettando delicatamente prima di asciugare attorno alla sezione. 2b. Rivedere i tempi di incubazione consigliati. 2c. Per i vetrini immunocolorati AEC, utilizzare unicamente colorazioni di contrasto e mezzi di montaggio acquosi. 3a. Incubare i vetrini con perossido di idrogeno fresco. 3b. Utilizzare bagni di xilene o toluene freschi. 3c. Utilizzare soluzioni fresche in bagni tampone e bagni di lavaggio. 3d. Abbreviare i tempi di incubazione con la soluzione substrato-cromogeno. 3e. Utilizzare la camera umidificata. Asciugare solo tre o quattro vetrini per volta prima di applicare il reagente. 3f. Utilizzare i diluenti per anticorpo Dako oppure aggiungere l'1% di BSA al diluente per anticorpo. In alternativa, è possibile utilizzare il tampone 0,05 mol/l Tris contenente 0,3 mol/l NaCl e 0,1% Tween 20, ph 7,2-7,6 (codice S3306) come tampone di lavaggio. Inoltre, potrebbe essere necessaria l'incubazione di un reagente di blocco della proteina separato (codice X0909) prima dell'applicazione dell'anticorpo primario. 3g. Diluire maggiormente l'anticorpo 3g. Anticorpo primario troppo concentrato. primario. 4a. Uso di vetrini errati. 4a. Utilizzare vetrini polilisinati per la maggior parte delle colorazioni. Per gli anticorpi primari che richiedono tecniche di recupero del bersaglio, utilizzare i vetrini Silanized Slides. 5a. Anticorpo primario troppo concentrato. 5a. Eseguire delle diluizioni seriali dell'anticorpo primario per determinare la diluizione ottimale. ( ) IT_001 p. 7/8

8 5b. L'incubazione dell'anticorpo primario, del collegamento biotinilato o della streptavidina-hrp è troppo lunga. 5b. Determinare il protocollo di colorazione adeguato per l'anticorpo, ad es. durata dell'incubazione dell'anticorpo primario, durata dell'incubazione del collegamento biotinilato e della streptavidina-hrp. Nota: se il problema non è imputabile a nessuna di queste cause, o se l'intervento correttivo consigliato non si rivela efficace, contattare l'assistenza Tecnica Dako per ricevere ulteriori suggerimenti. Ulteriori informazioni sulle tecniche di colorazione e sulla preparazione dei campioni sono contenute in Immunohistochemical Staining Methods 10 (disponibile presso Dako), Atlas of Immunohistology 16 e Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 17 Bibliografia 1. Guesdon JL, Ternynck T, Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem 1979;27(8): Giorno R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diag Immunol 1984;2(3): Center for Disease Control Manual Guide Safety Management, No. CDC-22. Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. Atlanta, Georgia. April 30, Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No , Current 13. August 16, Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final rule, 57FR7163. February 18, Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe S, Battifora H, Brigati DJ. Quality control in immunohistochemistry. Report of a workshop sponsored by the Biological Stain Commission. Amer J Clin Pathol 1989;92(6): National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: Principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA. 1991; 4: Order code C24-A. 8. Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991;66(4): Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981: Key M (ed). Immunohistochemical Staining Methods. 4th Edition. Dako Wood GS, Warnke R. Suppression of endogenous avidin-binding activity in tissues and its relevance to biotin-avidin detection systems. J Histochem Cytochem 1981;29(10): Banerjee D, Pettit S. Endogenous avidin-binding activity in human lymphoid tissue. J Clin Pathol 1984;37(2): Escribano LM, Gabriel LC, Villa E, Navarro JL. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987;35(2): Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: American Society of Clinical Pathologists Press 1990; Omata M, Liew CT, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Am J Path 1980;73(5): Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: ASCP Press Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques, A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: ASCP Press Edizione 05/07 ( ) IT_001 p. 8/8