Lo scopo delle tecniche di colorazione immunoistochimica (IHC) è quello di consentire la visualizzazione degli antigeni tissutali (cellulari).

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1 Dako LSAB 2 System-AP Codice K ml Codice K ml Uso previsto Per uso diagnostico in vitro. Queste istruzioni si riferiscono a Universal Dako LSAB 2 System, Alkaline Phosphatase (LSAB2 System, AP) per l uso con anticorpi primari di coniglio e di topo forniti dall utente. Questo sistema, che consiste in reagenti marcati con streptavidina e biotina (LSAB), è destinato alla dimostrazione qualitativa degli antigeni in tessuti inclusi in paraffina, in tessuti preparati al criostato e in preparazioni cellulari. Questo sistema è utile per i campioni biologici contenenti una forte attività di perossidasi endogena. Possono essere impiegati tessuti processati in un gran numero di fissativi, incluso l etanolo, il B5, il liquido di Bouin e la formalina neutra tamponata. Consultare le Istruzioni generali per la colorazione immunoistochimica o le Istruzioni del sistema di rilevazione riguardanti le procedure immunoistochimiche per: (1) Principio della procedura, (2) Materiali necessari, ma non forniti, (3) Conservazione, (4) Preparazione del campione biologico, (5) Procedura di colorazione, (6) Controllo qualità, (7) Risoluzione dei problemi, (8) Interpretazione della colorazione, (9) Limitazioni generali. Sommario e note esplicative Lo scopo delle tecniche di colorazione immunoistochimica (IHC) è quello di consentire la visualizzazione degli antigeni tissutali (cellulari). I sistemi LSAB2 utilizzano una sofisticata tecnica avidina-biotina, secondo la quale un anticorpo secondario biotinilato reagisce con diverse molecole di streptavidina coniugata con fosfatasi alcalina. 1 LSAB2 System, AP offre una tecnica di colorazione versatile, che permette la processazione simultanea di numerosi campioni biologici in meno di un ora. Gli anticorpi primari prodotti nel coniglio o nel topo reagiscono con l anticorpo coniugato biotinilato, fornito in questi sistemi. Il tempo d incubazione totale di circa 40 minuti consente il trattamento di un gran numero di campioni. Il substrato cromogeno fucsina viene fornito con LSAB2 System, AP da 15 ml (codice K0676) e forma sul sito antigenico un precipitato parzialmente solubile di colore fucsia. Il Fuchsin Substrate-Chromogen System (codice K0624, 110 ml) è disponibile come prodotto sussidiario, raccomandato per l uso con LSAB2 System, AP da 110 ml (codice K0674). Principi della procedura La tecnica usata in questo sistema si basa sul metodo LSAB. 2 Il campione viene prima incubato per 10 minuti con un anticorpo primario di coniglio o di topo adeguatamente caratterizzato e diluito (fornito dall utente). Successivamente si procede a incubazioni sequenziali di 10 minuti con l anticorpo coniugato biotinilato e con la streptavidina marcata con fosfatasi alcalina. La colorazione termina dopo 10 minuti di incubazione con la soluzione substrato-cromogeno. Materiali forniti Codice K0674: vengono forniti i seguenti materiali, sufficienti per 1100 sezioni tissutali, calcolando 100 µl per sezione: Quantità 1x110 ml Descrizione Immunoglobuline biotinilate anti-coniglio e anti-topo in soluzione salina tamponata al fosfato (PBS), contenente proteine stabilizzanti e 0,015 mol/l di sodio azide. 1x110 ml Streptavidina-fosfatasi alcalina Streptavidina coniugata con fosfatasi alcalina in soluzione salina tamponata al fosfato (PBS), contenente proteine stabilizzanti e 0,015 mol/l di sodio azide. Sistemi substrato compatibili raccomandati: Nome Codice Confezioni disponibili del test Colore FUCHSIN K e 1100 test Fucsia FAST RED K e 1100 test Rosso BCIP/NBT K test Blu/porpora BCIP/NBT/INT K test Marrone ( ) IT_001 p. 1/5

2 Codice K0676: vengono forniti i seguenti materiali, sufficienti per 150 sezioni tissutali, calcolando 100 µl per sezione: Quantità Descrizione Coniugato Immunoglobuline biotinilate anti-coniglio e anti-topo in soluzione salina tamponata al fosfato (PBS), contenente proteine stabilizzanti. Streptavidina-fosfatasi alcalina Streptavidina coniugata con fosfatasi alcalina in soluzione salina tamponata al fosfato (PBS), contenente proteine stabilizzanti e 0,015 mol/l di sodio azide. 1x2 ml Fucsina Cromogeno In HCl. 1x2 ml Fucsina Agente attivante In soluzione acquosa. Fucsina Tampone substrato Naftolo fosfato in tampone Tris. Accessori 1 Provetta graduata Materiali necessari, ma non forniti Anticorpo primario e reagente per il controllo negativo (non forniti nei sistemi K0674 e K0676) Controllo tissutale (positivo e negativo) Xilene, toluene o sostituti dello xilene Etanolo, assoluto e al 95% Acqua distillata Bottiglie di lavaggio Soluzione tampone di lavaggio Carta assorbente Bagni o contenitori per la colorazione Controcolorazione: a base acquosa, come l ematossilina di Mayer modificata secondo Lillie (codice S3309) 0,037 mol/l di idrossido d ammonio Mezzi di montaggio, quali il Glycergel Mounting Medium (codice C0563), Faramount, Aqueous Mounting Medium, pronto per l uso (codice S3025) o il mezzo di montaggio acquoso permanente, Ultramount (codice S1964) Vetrini coprioggetto Microscopio ottico (20x 800x) Vetrini: rivestiti con poli-l-lisina o trattati con silano (codice S3003) Materiali opzionali necessari, ma non forniti Penna per immunoistochimica (codice S2002) Precauzioni 1. Per utenti professionisti. 2. Il prodotto contiene sodio azide (NaN 3), una sostanza chimica altamente tossica allo stato puro. Alle concentrazioni del prodotto, sebbene non classificate come pericolose, accumuli di sodio azide possono reagire con le tubature in piombo e rame, formando azidi metalliche altamente esplosive. Dopo lo smaltimento, sciacquare abbondantemente per evitare l'accumulo di azidi nelle tubature. 3,11 3. Minimizzare la contaminazione microbica dei reagenti, allo scopo di evitare un aumento di colorazione aspecifica. 4. Indossare un adeguato equipaggiamento protettivo personale, per evitare il contatto della soluzione con gli occhi e con la pelle. 5. La soluzione non utilizzata va eliminata secondo le disposizioni locali, statali e federali. 6. Per gli utenti professionisti, è disponibile su richiesta una scheda dei dati di sicurezza. Frasi di rischio e consigli di prudenza K0676 Fucsina Agente attivante R22 Nocivo per ingestione. ( ) IT_001 p. 2/5

3 Conservazione I reagenti di LSAB2 System, AP vanno conservati a 2 8 C. Non congelare. Non usare dopo la data di scadenza stampata sui flaconi di reagente e sulle etichette del kit. Non ci sono segni evidenti che indichino l instabilità di questo prodotto. Perciò, i controlli positivi e negativi devono essere eseguiti contemporaneamente ai campioni biologici del paziente. Se comparisse una colorazione inattesa, che non può essere spiegata con variazioni delle procedure del laboratorio, e si sospettasse un problema legato al kit, rivolgersi al Servizio Tecnico Dako. Preparazione del reagente Prima della colorazione, conviene preparare i seguenti reagenti. Soluzione di lavaggio Il tampone di lavaggio raccomandato per la rilevazione IHC automatica o manuale è il TBST, 0,05 mol/l di soluzione salina tamponata Tris con Tween (codice S3006). Per la colorazione manuale, sono anche adatte le soluzioni tamponate di lavaggio TBS, 0,05 mol/l di soluzione salina tamponata Tris (codice S1968) e PBS, 0,02 mol/l di soluzione tamponata al fosfato (codice S3024). Per risciacquar via la soluzione substratocromogeno e la controcolorazione, può essere usata acqua distillata. La soluzione di lavaggio non usata può essere conservata a 2 8 C. La soluzione va elimina ta nel caso s intorbidisca. Anticorpo primario Per l uso con i sistemi LSAB2, sono disponibili un gran numero di anticorpi primari e di controlli negativi (linea di prodotti serie N) In alternativa, sono disponibili presso Dako anticorpi concentrati; la diluizione ottimale, comunque, va determinata sperimentalmente dall utente. Le diluizioni vanno preparate usando 0,05 mol/l di tampone Tris-HCl, a ph 7,2 7,6, contenente l 1% di albumina sierica bovina (Antibody Diluent, codice S0809). 1 Reagente per il controllo negativo Usando gli anticorpi pronti per l uso Dako, serie N, si raccomanda Universal Negative Control come reagente per il controllo negativo. Questi controlli sono ottimizzati per l impiego con anticorpi pronti per l uso, serie N, di topo (codice N1698) o di coniglio (codice N1699). Usando anticorpi concentrati, va incluso nella procedura un reagente per il controllo negativo che non mostri reattività specifica con i tessuti umani o con il siero normale/ non immune nella stessa matrice/soluzione dell anticorpo primario diluito. Il reagente ideale per il controllo negativo deve appartenere alla stessa specie e sottoclasse animale dell anticorpo primario, diluito alla stessa concentrazione immunoglobulinica o proteica dell anticorpo primario diluito, usando lo stesso diluente. Il tempo d incubazione del reagente per il controllo negativo deve essere lo stesso dell anticorpo primario. Soluzione substrato-cromogeno (contenuta in K0676) Fuchsin (codice K0624) è raccomandata per l uso con LSAB2 System, AP. La soluzione substrato-cromogeno va usata entro 30 minuti dalla preparazione. Per ottenere i migliori risultati, preparare immediatamente prima dell uso. Il seguente protocollo si riferisce alla preparazione di 2 ml di soluzione, sufficienti per 20 sezioni tessutali o campioni cellulari. Soluzione substrato-cromogeno FASE 1 Mettere tre gocce (120 µl) di Fuchsin Chromogen nella provetta graduata. Per ottenere i migliori risultati, versare le gocce con il flacone in posizione verticale, comprimendolo delicatamente. FASE 2 FASE 3 FASE 4 Aggiungere tre gocce (120 µl) di Activating Agent e miscelare delicatamente. Per ottenere i migliori risultati, versare le gocce con il flacone in posizione verticale, comprimendolo delicatamente. Incubare per un minuto a temperatura ambiente. Aggiungere il substrato tamponato fino alla linea dei 2 ml (1,76 ml). Miscelare ed applicare immediatamente sui vetrini.* Nota: per prevenire la contaminazione, non toccare la punta del contagocce con le dita. Nel caso sia necessario inserire o staccare la punta del contagocce, si raccomanda di usare i guanti protettivi. Sciacquare a fondo la provetta dopo l uso. *L attività della fosfatasi alcalina endogena in alcuni tessuti può produrre risultati falsamente positivi. Tale attività endogena può essere inibita, aggiungendo 0,0002 mol/l di Levamisole (codice X3021) al substratocromogeno. Levamisole non inibisce la forma intestinale e placentare della fosfatasi alcalina e può non essere utile nella colorazione di campioni biologici contenenti questi isoenzimi. Sono disponibili ulteriori cromogeni compatibili con la fosfatasi. Fast Red Substrate System (codice K0597) dà luogo a una colorazione rossa solubile sul sito dell antigene bersaglio. BCIP/NBT Substrate System (codice K0598) è un prodotto pronto per l uso, che forma un prodotto di reazione insolubile di colore blu-porpora sul sito dell antigene bersaglio. Anche BCIP/NBT/INT Substrate System (codice K0599) è pronto per l uso e forma un prodotto di reazione solubile di colore marrone. ( ) IT_001 p. 3/5

4 Preparazione del campione biologico Controllo qualità Consultare le Istruzioni generali per la colorazione immunoistochimica e/o il foglio delle caratteristiche dell anticorpo. Differenze nella processazione del tessuto e nei procedimenti tecnici in uso presso il laboratorio dell utente possono produrre una discrepanza significativa nei risultati, rendendo necessaria la regolare esecuzione di controlli interni. Per ulteriori informazioni sui controlli positivi e negativi, consultare le Istruzioni generali per la colorazione immunoistochimica. Interpretazione della colorazione Limitazioni generali Limitazioni specifiche del prodotto Per le direttive interpretative, consultare le Istruzioni generali per la colorazione immunoistochimica. Per le limitazioni generali, consultare le Istruzioni generali per la colorazione immunoistochimica. L attività endogena legante l avidina (EABA) è stata messa in evidenza in sezioni congelate di fegato (nodulo epatico intero) e di rene (epitelio tubulare), come anche in tessuto linfoide congelato e fissato in formalina (istiociti paracorticali). 5,8 La EABA può essere soppressa con 10 minuti d incubazione, prima con lo 0,1% di avidina e poi con lo 0,01% di biotina in 0,05 mol/l di tampone Tris-HCI, a ph 7,2 7,6, Biotin Blocking System (codice X0590), prima del protocollo di colorazione. La maggior parte dei tipi di attività della fosfatasi alcalina endogena, con l eccezione principale della fosfatasi intestinale e placentare, può essere inibita con l uso di levamisolo. 7 Se in un campione si osserva attività della fosfatasi alcalina endogena, può essere aggiunto il levamisolo alla soluzione substrato alla concentrazione finale di 0,2 mol/l di Levamisole (codice X3021). Risoluzione dei problemi Problema Causa probabile Rimedio suggerito 1. Assenza di colorazione su tutti i vetrini 1a. Reagenti non usati in ordine adeguato. 1b. Substrato-cromogeno miscelato non correttamente. 1a. Rivedere l applicazione dei reagenti. 1b. Preparare una soluzione substrato-cromogeno fresca, seguendo le istruzioni accluse al prodotto. 2. Colorazione debole di tutti i vetrini. 3. Eccesso di colorazione di fondo su tutti i vetrini. 2a. Le sezioni conservano troppa soluzione dopo il bagno di lavaggio. 2b. La miscela substratocromogeno ha più di 30 minuti. 2c. Vetrini non incubati abbastanza con gli anticorpi o con la miscela substrato. 3a. I campioni contengono un eccesso di attività della fosfatasi alcalina endogena. 3b. Incompleta rimozione della paraffina. 3c. Risciacquo dei vetrini eseguito impropriamente. 3d. Reazione del substrato più veloce del normale dovuta, ad esempio, all eccessiva temperatura ambientale. 3e. Disidratazione delle sezioni durante la procedura di colorazione. 3f. Legame non specifico dei reagenti con la sezione tissutale. 2a. Picchiettare delicatamente per eliminare l eccesso di soluzione e asciugare attorno alla sezione. 2b. Preparare una soluzione substrato-cromogeno fresca. 2c. Rivedere i tempi d incubazione raccomandati. 3a. Aggiungere soluzione di Levamisole alla soluzione substrato-cromogeno (vedere Limitazioni specifiche del prodotto ) 3b. Usare bagni freschi di xilene o di toluene. Se sono colorati diversi vetrini contemporaneamente, il secondo bagno di xilene deve contenere xilene fresco. 3c. Usare soluzioni fresche nei bagni di tampone e nelle bottiglie di lavaggio. Controllare che il bagno di tampone sia quello giusto. 3d. Usare un tempo d incubazione più breve con la soluzione substratocromogeno. 3e. Usare una camera umida. Asciugare solo tre o quattro vetrini alla volta, prima di applicare il reagente. 3f. Applicare una soluzione bloccante contenente proteine (vedere Limitazioni specifiche del prodotto ). ( ) IT_001 p. 4/5

5 NOTA: se il problema non può essere attribuito ad alcuna delle cause sopra esposte o se il rimedio suggerito non dà il risultato atteso, rivolgersi al Servizio Tecnico Dako. Per ulteriori informazioni sulle tecniche di colorazione e sulla preparazione dei campioni biologici, consultare Handbook -Immunochemical Staining Methods 8 (disponibile presso Dako), Atlas of Immunohistology 9 or Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 10 Riferimenti bibliografici 1. Guesdon JL, Ternynck T, Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem 1979; 27(8): NCCLS. Quality assessment for immunocytochemistry; Proposed guideline. 1997; 17(10):MM4-P 3. Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No , Current 13. August 16, Protection of laboratory workers from instrumentation biohazards and infectious disease transmitted by blood, body fluids, and tissue; approved guideline. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Villanova, PA 1997; Order code M29-A 5. Wood GS, Warnke R. Suppression of endogenous avidin-binding activity in tissues and its relevance to biotin-avidin detection systems. J Histochem Cytochem 1981; 29: Banerjee D and Pettit S. Endogenous avidin-binding activity in human lymphoid tissue. J Clin Pathol 1984; 37: Ponder BA and Wilkinson MM. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. J Histochem Cytochem 1981; 29(8): Naish SJ (ed). Handbook Immunochemical staining methods. Carpinteria: Dako Tubbs RR, Gephardt GM, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. In: Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press Center for Disease Control Manual Guide Safety Management, No. CDC-22, Atlanta, GA. Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. April 30, 1976 Edition 05/07 ( ) IT_001 p. 5/5