ARTEFATTI E RISCHI DI ERRORE IN IMMUNOISTOCHIMICA U. Gianelli

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1 ARTEFATTI E RISCHI DI ERRORE IN IMMUNOISTOCHIMICA U. Gianelli Cattedra e Servizio di Anatomia Patologica DMCO - A. O. San Paolo e Fondazione Ospedale Maggiore Policlinico, Mangiagalli e Regina Elena

2 significant similarities exist between immunohistochemistry and cooking (Yaziji H.)

3 l applicazione delle tecniche di IIC ha trasformato l Anatomia Patologica da qualche cosa che assomiglia ad un arte, in qualche cosa che assomiglia ad una scienza (Taylor C.) Black Lines, Kandinsky 1913

4 Campi di applicazione della IIC Clinico - diagnostico - prognostico - predittivo Ricerca Landscape with red spots, Kandisky 1913

5 Diagnostic Immunohistochemistry: What can go Wrong? Hadi Yaziji, MD and Todd Barry, MD Ph.D Adv Anat Pathol 2006; 13: Problemi tecnici Fissazione Processazione Smascheramento antigenico Anticorpo primario Sistema di rivelazione Errori professionali Selezione del pannello anticorpale Sensibilità del pannello anticorpale Scelta del tipo di anticorpo Scelta del clone dell anticorpo Interpretazione dei risultati Interpretazione dei dati della letteratura

6 Diagnostic Immunohistochemistry: What can go Wrong? Hadi Yaziji, MD and Todd Barry, MD Ph.D Adv Anat Pathol 2006; 13: Problemi tecnici Fissazione Processazione Smascheramento antigenico Anticorpo primario Sistema di rivelazione Errori professionali Selezione del pannello anticorpale Sensibilità del pannello anticorpale Scelta del tipo di anticorpo Scelta del clone dell anticorpo Interpretazione dei risultati Interpretazione dei dati della letteratura

7 Fissazione Il tipo di fissativo e la durata del processo di fissazione possono influenzare il risultato della ICC Esistono due principali classi di fissativi: Fissativi cross-linking (formalina) Fissativi coagulanti (alcool,..)

8 Fissazione: tipo di fissativo condiziona l immunoreattività tissutale (Williams JH et al. J Clin Pathol 1997; 50: ) - Formalina: risultati costanti ed eccellente preservazione dell antigenicità - B5: elevati livelli di colorazione di fondo - Bouin: intensità della colorazione debole e richiede l uso del MWO N.B.: in ogni laboratorio la metodica IIC (tempi di incubazione, smascheramento antigenico, sistema di rilevazione ) deve essere messa a punto sulla base del tipo di fissativo utilizzato

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10 Cosa succede quando la fissazione è troppo breve? Fissazione insufficiente (<6 h) post-fissazione alcolica

11 Fissazione insufficiente (<6 h) Citocheratina pool (AE1/AE3) Metastasi linfonodale massiva di carcinoma scarsamente differenziato

12 Cosa succede quando la fissazione è eccessiva? Fissazione adeguata fissazione eccessiva

13 Fissazione eccessiva > 48 h Recettore per gli estrogeni Fissazione: 96 h Smascheramento antigenico x30 min

14 Fissazione inadeguata Problema Ritardata Insufficiente Conseguenze Soluzione Aumento della degradazione proteolitica, diminuzione della antigenicità t fissazione <30min Si completa per coagulazione durante il processo di disidratazione deparaffinare, rifissare e riprocessare sezionare campioni prelievi dedicati IIC Eccessiva Formazione di legami covalenti, con riduzione dell antigenicità Aumentare i tempi di AR, t

15 Smascheramento antigenico Serve a ripristinare le caratteristiche antigeniche di un tessuto, alterate dalla fissazione e dalla processazione Due tipologie antigenico: di smascheramento Digestione enzimatica (tripsina, pepsina, neuraminidasi ) Mezzo liquido (calore / ph variabile) N.B.: lo smascheramento inadeguato causa falsi negativi e/o positivi

16 Linfoma di Hodgkin Tripsina MWO CD30 (BerH2)

17 Fattori che condizionano lo smascheramento antigenico in mezzo liquido 1) Condizioni di riscaldamento T( C) x t (min) = smascheramento antigenico 2) ph - Ag indifferenti al ph della soluzione smascherante - Ag (ki-67/mib1, ER ) buoni risultati a ph acido - Ag (MT1(CD43), HMB45 ) buoni risultati a ph basico 3) Composizione della soluzione smascherante (citrato, EDTA, H20 distillata ) ha minore importanza

18 Smascheramento antigenico: relazione tra ph della soluzione smascherante e pattern di colorazione A = pattern di colorazione stabile: ex. CD20 B = riduzione del pattern di colorazione tra ph 3 e 6: ex. MIB1, ER Acido Basico Shi et al. J Histochem Cytochem 1995; 43: C = incremento del pattern di colorazione proporzionale all incremento del ph: ex. MT1, HMB45

19 Ottimizzazione del protocollo di smascheramento antigenico Temperatura / tempo Citrato ph 6 EDTA ph 8 MWO x 15 min Sezione n. 1 Sezione n. 4 MWO x 30 min Sezione n. 2 Sezione n. 5 Stufa x 15 min Sezione n. 3 Sezione n. 6 Stufa per 30min Sezione n. 4 Sezione n.8 Shi et al. J Histochem Cytochem 1997; 45:

20 Problemi con l anticorpo primario - scarsa sensibilità - scarsa specificità - diluizione non ottimale - tipo di smascheramento - tempo di incubazione insufficiente Sensibilità capacità di individuare un Ag in cellule o tessuti in cui l Ag è realmente presente Se = (veri positivi/veri positivi + falsi negativi) x100 Specificità: capacità di individuare correttamente le cellule o i tessuti privi dell Ag ricercato Sp = (veri negativi /veri negativi + falsi positivi) x 100

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22 Titolazione dell anticorpo primario Mesotelioma pleurico dil. 1:2000 = +/++ (+) dil. 1:1000 = +++ (-/+) Calretinina dil. 1:4000 = -/+ (+)

23 Problemi con il sistema di rivelazione Scarsa sensibilità Mancata inibizione delle attività enzimatiche endogene (perossidasi, fosfatasi alcalina ) e della biotina Scelta del cromogeno

24 Utilizzo di sistemi di rivelazione biotin free per evitare la colorazione aspecifica di fondo legata allo smascheramento della biotina endogena LSAB Super Sensitive Non-Biotin HRP- DS CD99

25 Scelta del cromogeno Melanoma cutaneo DAB AEC HMB-45

26 Controlli di reazione La valutazione operativa della reazione IIC viene effettuata attraverso i controlli di reazione Controllo negativo (specificità): - si sostituisce Ac primario con del siero normale - ogni colorazione osservata nel controllo negativo deve essere considerata come aspecifica Controllo positivo (sensibilità): - si utilizzano sezioni tissutali note per contenere Ag ricercato - preferibile utilizzare sezioni in cui Ag è contenuto in quantità ridotte (tessuto neoplastico) - possibilità di utilizzare controlli interni

27 Controllo negativo: colorazione aspecifica di fondo sottrazione progressiva per identificare la causa Protocollo Sezione 1 Sezione 2 Sezione 3 Sezione 4 Ab primario Ab primario no no no Link Link Link no no Label Label Label Label no Cromogeno Cromogeno Cromogeno Cromogeno Cromogeno

28 HER 2 è amplificato nel 18-20% dei tumori della mammella Fattore prognostico: la over-espressione di HER2 si associa ad una prognosi sfavorevole (aumento delle recidive e del tasso di mortalità) Fattore predittivo di risposta alla terapia: la terapia con anticorpo monoclonale anti-her2 (Trastuzumab, Herceptin) aumenta significativamente la sopravvivenza delle pazienti Wolff AC et al. J Clin Oncol 2007; 25:

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33 Score HER2 status Pattern 0 Negativo <10% positività di membrana 1+ Negativo >10% positività debole di membrana 2+ Dubbio >10% e <30% debole / moderata positività di membrana, completa 3+ Positivo >30% intensa positività di membrana, completa Wolff AC et al. J Clin Oncol 2007; 25:

34 Wolff AC et al. J Clin Oncol 2007; 25:

35 Le cause di errore nel test IIC per HER2 Wolff AC et al. J Clin Oncol 2007; 25:

36 Criteri di esclusione del campione al test ICC Wolff AC et al. J Clin Oncol 2007; 25:

37 Immunoistochimica nel Servizio di Anatomia Patologica dell A. O. San Paolo Tempistica - giornaliera Carico di lavoro complessivo (2006) immunoreazioni / casi istologici Carico di lavoro per persona - media giornaliera immunoreazioni

38 Controllo di Qualità in Immunoistochimica insieme delle procedure per rilevare, correggere e ridurre gli errori in un processo analitico (College of American Pathologists) La procedura operativa del controllo di qualità in IIC è attiva presso il nostro Servizio dal gen Applicato a tutto il materiale sottoposto ad indagini IIC, tutti i giorni, dal medico responsabile del settore e/o dal tecnico addetto alle colorazioni immuno-istochimiche Responsabile: dott.ssa Moneghini

39 Controllo di Qualità in Immunoistochimica La procedura operativa per IIC prevede la valutazione: Adeguatezza delle sezioni Qualità della reazione IIC / montaggio / etichettatura Specificità di reazione Controlli positivi

40 Controllo di Qualità in Immunoistochimica Valutazione delle non conformità per l anno 2006 IIC totali NC totali NC % Gen Feb Mar Apr Mag Giu Lug Ago Set Ott Nov Dic , %

41 Conclusioni I problemi incominciano nel momento in cui il campione arriva nel laboratorio di Anatomia Patologica L adeguata preparazione (fissazione, processazione) dei campioni è un momento fondamentale nel preservare l antigenicità del tessuto Dobbiamo sforzarci di standardizzare le fasi della preparazione del campione e della colorazione immunoistochimica

42 Conclusioni Il controllo di Qualità, inteso come rilevazione degli errori, identificazione delle cause ed attuazione delle misure risolutive, rappresenta un passo decisivo ai fini di una standardizzazione Evitare gli errori in IIC migliora l accuratezza diagnostica e prognostica, ha importanti ricadute di tipo terapeutico e può contribuire a ridurre i costi di un Servizio di Anatomia Patologica

43 Grazie Group in crinolines, Kandinsky 1913