PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. SK test per l'utilizzo con Autostainer Link 48. Uso previsto Per uso diagnostico in vitro.

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1 PD-L1 IHC 28-8 pharmdx SK test per l'utilizzo con Autostainer Link 48 Uso previsto Per uso diagnostico in vitro. PD-L1 IHC 28-8 pharmdx è un saggio immunoistochimico qualitativo che utilizza Monoclonal Rabbit Anti-PD-L1, Clone 28-8, destinato all'uso nella rilevazione della proteina PD-L1 in tessuti di cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC) non squamoso e melanoma, fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE), con il sistema di visualizzazione EnVision FLEX su Autostainer Link 48. L'espressione della proteina PD-L1 viene definita come percentuale di cellule tumorali che presentano positività per una colorazione di membrana di qualsiasi intensità. L'espressione di PD-L1, rilevata tramite PD-L1 IHC 28-8 pharmdx in tumori NSCLC non squamosi, può essere associata a una sopravvivenza superiore con OPDIVO (nivolumab). L'espressione di PD-L1 rilevata tramite PD-L1 IHC 28-8 pharmdx nel melanoma può essere utilizzata come ausilio per l'identificazione dei pazienti che possono trarre beneficio da una terapia combinata con OPDIVO (nivolumab) e YERVOY (ipilimumab). Riepilogo e spiegazione Il legame dei ligandi di PD-1, PD-L1 e PD-L2, al recettore PD-1, localizzato sulle cellule T, inibisce la proliferazione delle cellule T e la produzione di citochine. In alcuni tumori si verifica una sovraregolazione dei ligandi di PD-1 e la relativa via di trasduzione del segnale può contribuire a inibire la sorveglianza immunitaria delle cellule T attive dei tumori (1). OPDIVO (nivolumab) è un anticorpo monoclonale immunoglobulina G4 (IgG4) che si lega al recettore PD-1 e ne blocca l'interazione con PD-L1 e PD-L2, rilasciando l'inibizione della risposta immunitaria mediata dalla via di trasduzione del segnale di PD-1, inclusa la risposta immunitaria anti-tumorale (2). Nei modelli tumorali murini singenici, il blocco dell'attività di PD-1 ha portato a una riduzione della crescita tumorale (3). Sono stati esaminati il beneficio clinico di OPDIVO e l'utilità clinica di PD-L1 IHC 28-8 pharmdx nei tumori NSCLC e nel melanoma. Tumori NSCLC non squamosi: il rilevamento di cellule tumorali che esprimono PD-L1 in un campione di paziente con cancro del polmone non a piccole cellule non squamoso può indicare un vantaggio in termini di miglioramento della sopravvivenza in risposta al trattamento del paziente con OPDIVO (nivolumab). Nel corso di studi clinici su OPDIVO sponsorizzati da Bristol-Myers Squibb, i campioni prelevati dai pazienti sono stati analizzati utilizzando PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Durante lo studio clinico CA è stata esaminata la validità clinica di PD-L1 IHC 28-8 pharmdx per la valutazione dello stato di PDL1 nei pazienti affetti da tumore NSCLC non squamoso con OPDIVO (5,11). Melanoma: l'antigene 4 dei linfociti T citotossici (CTLA-4, Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4) è un regolatore negativo dell'attività delle cellule T. YERVOY (ipilimumab) è un anticorpo monoclonale che si lega all'antigene CTLA-4 e ne blocca l'interazione con i relativi ligandi, CD80/CD86. È stato dimostrato che il blocco di CTLA-4 aumenta l'attivazione e la proliferazione delle cellule T, contribuendo a un aumento generale della risposta immunitaria anti-tumorale (4). La proteina PD-1 e l'antigene CTLA-4 inibiscono la risposta immunitaria anti-tumorale attraverso meccanismi complementari non-ridondanti. La monoterapia con OPDIVO e il trattamento combinato con OPDIVO e YERVOY hanno mostrato un aumento notevolmente superiore della sopravvivenza libera da progressione (PFS, Progression-Free Survival), rispetto al solo YERVOY, tra i pazienti affetti da melanoma avanzato che non hanno ricevuto alcun trattamento precedente (8-10). Nel corso degli studi clinici sponsorizzati da Bristol-Myers Squibb, i campioni di tessuto tumorale del melanoma prelevati da pazienti trattati con OPDIVO sono stati analizzati utilizzando PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Durante lo studio clinico CA è stata esaminata la validità clinica di PD-L1 IHC 28-8 pharmdx per la valutazione dell'espressione della proteina PDL1 nei pazienti affetti da melanoma e trattati con OPDIVO, OPDIVO combinato con YERVOY e solo YERVOY. OPDIVO e YERVOY sono marchi di fabbrica di proprietà di Bristol-Myers Squibb. Principio della procedura PD-L1 IHC 28-8 pharmdx include il protocollo e i reagenti ottimizzati necessari per l'esecuzione di una procedura di colorazione IHC di campioni FFPE con Autostainer Link 48 e PT Link Pre-treatment Module (6). Una volta eseguita l'incubazione con l'anticorpo monoclonale primario anti-pd-l1 o con il reagente di controllo negativo Negative Control Reagent (NCR), i campioni vengono incubati con un anticorpo linker specifico per la specie ospite dell'anticorpo primario, quindi vengono incubati con un reagente di visualizzazione pronto per l'uso che consiste di molecole di anticorpo secondario e molecole di perossidasi di rafano legate a uno scheletro di polimeri di destrano. La conversione enzimatica del cromogeno aggiunto successivamente causa la precipitazione di un prodotto di reazione visibile nel sito dell'antigene. Il colore della reazione cromogena viene modificato da un reagente di potenziamento del cromogeno. Il campione può quindi essere sottoposto a colorazione di contrasto e coperto con un vetrino coprioggetto. L'interpretazione dei risultati avviene per mezzo di un microscopio ottico. I vetrini di controllo Control Slides contenenti due linee cellulari umane fissate in formalina, incluse in paraffina, vengono forniti per convalidare i cicli di colorazione. Materiali forniti PD-L1 IHC 28-8 pharmdx (codice SK005) I materiali elencati di seguito sono sufficienti per 50 test (50 vetrini incubati con Primary Antibody contro PD-L1 e 50 vetrini incubati con corrispondente Negative Control Reagent; 100 vetrini di test in totale). L'anticorpo primario aggiuntivo per la proteina PD-L1 viene fornito nel kit per la colorazione di 15 vetrini di controllo della linea cellulare. Il numero dei test è basato sull'uso di 2 x 150 µl per vetrino di ciascun reagente, ad eccezione di DAB+ e Target Retrieval Solution. ( ) P03914IT_02/SK / p. 1/18

2 Il kit fornisce materiale sufficiente per un massimo di 15 cicli di colorazione singoli. Quantità Descrizione 1 x 34,5 ml Peroxidase-Blocking Reagent PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT Soluzione tamponata contenente perossido di idrogeno, detergente e sodio azide 0,015 mol/l. 1 x 19,5 ml Primary Antibody: Monoclonal Rabbit Anti-PD-L1, Clone 28-8 MONOCLONAL RABBIT ANTI-PD-L1 CLONE 28-8 Anti-PD-L1 monoclonale di coniglio in soluzione tamponata contenente proteina stabilizzante e sodio azide 0,015 mol/l. 1 x 15 ml Negative Control Reagent* NEGATIVE CONTROL REAGENT Anticorpo monoclonale IgG di coniglio di controllo in soluzione tamponata contenente proteina stabilizzante e sodio azide 0,015 mol/l. *Anticorpo monoclonale IgG di coniglio di controllo venduto su licenza da Cell Signaling Technology. 1 x 34,5 ml LINKER, Anti-Rabbit LINKER, ANTI-RABBIT Anticorpo secondario murino diretto contro immunoglobuline di coniglio in soluzione tamponata contenente proteina stabilizzante e sodio azide 0,015 mol/l. 1 x 34,5 ml Visualization Reagent-HRP VISUALIZATION REAGENT-HRP Destrano legato a molecole di perossidasi e molecole di anticorpi secondari di capra diretti contro immunoglobuline di coniglio e di topo in soluzione tamponata contenente proteina stabilizzante e un agente antimicrobico. 15 x 7,2 ml DAB+ Substrate Buffer DAB+ SUBSTRATE BUFFER Soluzione tamponata contenente perossido di idrogeno e un agente antimicrobico. 1 x 5 ml DAB+ Chromogen DAB+ CHROMOGEN 3,3 -diaminobenzidina tetraidrocloruro in solvente organico. 1 x 34,5 ml DAB Enhancer DAB ENHANCER Solfato rameico in acqua. 6 x 30 ml EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) EnVision FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW ph (50X) Soluzione tamponata, ph 6,1, contenente detergente e un agente microbico. 15 vetrini PD-L1 IHC 28-8 pharmdx Control Slides CONTROL SLIDES Ciascun vetrino contiene sezioni di due linee cellulari in pellet fissate in formalina e incluse in paraffina: NCI-H226** positive per l'espressione della proteina PD-L1 e MCF-7 negative per l'espressione della proteina PD-L1. PD-L1, SK005 pharmdx XXXXX MCF-7: negative per PD-L1 NCI-H226: positive per PD-L1 **Si ringraziano il Dr. AF Gazdar e il Dr. JD Minna dell'nih per il loro contributo nello sviluppo della linea NCI-H226 (numero ATCC: CRL-5826 )(7) ( ) P03914IT_02/SK / p. 2/18

3 Nota: tutti i reagenti inclusi sono formulati in modo specifico per l'utilizzo con questo kit. Per eseguire il test secondo quanto specificato, non è consentito effettuare sostituzioni, ad eccezione di EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) (codice K8005). PD-L1 IHC 28-8 pharmdx è stato formulato appositamente per l'uso con Autostainer Link 48. Per ulteriori informazioni, fare riferimento ai manuali utente di Autostainer Link 48 e PT Link. Materiali necessari ma non forniti PT Link Pre-treatment Module (codice PT100/PT101) Autostainer Link 48 (codice AS480) EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (codice K8007) EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (codice K8008) Acqua distillata o deionizzata (acqua di grado reagente) Timer Tessuti positivi e negativi da utilizzare come controlli della procedura (vedere la sezione Controllo di qualità e la tabella 1) Vetrini per microscopia: Dako FLEX IHC Microscope Slides (codice K8020) o vetrini caricati Fisherbrand Superfrost Plus. Vetrini coprioggetto Mezzo di montaggio permanente e reagenti ausiliari richiesti per il montaggio dei vetrini coprioggetto Microscopio ottico (ingrandimento obiettivi 4x 40x) Precauzioni 1. Per uso diagnostico in vitro. 2. Per uso professionale. 3. Questo prodotto contiene sodio azide (NaN3), una sostanza chimica altamente tossica in forma pura. Sebbene non sia classificato come prodotto a rischio, il composto NaN3 alle concentrazioni indicate può reagire con il rame e il piombo delle tubature formando azidi metalliche fortemente esplosive. Durante lo smaltimento del prodotto, far scorrere abbondante acqua nelle tubature per impedire la formazione di azidi metalliche (12). 4. I reagenti Primary Antibody, Negative Control Reagent, Linker e Visualization Reagent contengono materiale di origine animale. 5. I campioni, prima e dopo la fissazione, e tutti i materiali esposti ad essi devono essere manipolati come potenziali vettori di infezione e smaltiti con le opportune precauzioni (13). 6. Tempi, temperature o metodi di incubazione diversi da quelli specificati possono generare risultati erronei. 7. I reagenti sono stati diluiti nel modo ottimale. L'ulteriore diluizione potrebbe compromettere la colorazione dell'antigene. 8. I reagenti Visualization Reagent, DAB+ Chromogen liquido e la soluzione substrato-cromogeno DAB+ preparata possono subire alterazioni se esposti a livelli di luce eccessivi. Non conservare questi componenti del sistema né eseguire la colorazione in condizioni di luce intensa, come ad esempio la luce solare diretta. 9. I residui di paraffina possono produrre falsi negativi. 10. L'uso di volumi di reagenti diversi da quelli consigliati può comportare la perdita di immunoreattività di PD-L1 visibile. 11. Per le sezioni di tessuto di grandi dimensioni, che coprono oltre i 2/3 del vetrino, possono essere necessari 3x150 µl di reagente. 12. Come regola generale, ai minori di 18 anni non è consentito lavorare con questo prodotto. È necessario preparare con attenzione gli utenti sulle corrette procedure di lavoro, le proprietà rischiose del prodotto e le norme di sicurezza necessarie. Fare riferimento alla scheda di sicurezza (SDS) per ulteriori informazioni. 13. Indossare dispositivi di protezione individuale appropriati per evitare il contatto con gli occhi e la cute. 14. La soluzione non utilizzata deve essere smaltita conformemente alle normative locali, regionali, nazionali e internazionali in materia. 15. Su richiesta è disponibile una scheda di sicurezza per utenti professionisti. Pericolo DAB+ Chromogen: 1 5% di tetracloruro di bifenil-3,3',4,4'-tetrailtetraammonio H350 Può provocare il cancro. H341 Sospettato di provocare alterazioni genetiche. P201 Procurarsi istruzioni specifiche prima dell uso. P202 Non manipolare prima di avere letto e compreso tutte le avvertenze. P280 Indossare guanti protettivi. Proteggere gli occhi/il viso. Indossare indumenti protettivi. P308 + P313 IN CASO di esposizione o di possibile esposizione: Consultare un medico. P405 Conservare sotto chiave. P501 Smaltire il prodotto e il recipiente in conformità a tutte le normative locali, regionali, nazionali e internazionali. Avvertenza EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x): 1-5% di acido citrico H319 Provoca grave irritazione agli occhi. H411 Tossico per gli organismi acquatici con effetti di lunga durata. P280 Proteggere gli occhi/il viso. P273 Non disperdere nell'ambiente. P264 Lavare accuratamente le mani dopo l'uso. P305 + P351 + P338 IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: Sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare. P337 + P313 Se l'irritazione degli occhi persiste: Consultare un medico. P501 Smaltire il prodotto e il recipiente in conformità a tutte le normative locali, regionali, nazionali e internazionali. ( ) P03914IT_02/SK / p. 3/18

4 Conservazione Quando non in uso su Autostainer Link 48, tutti i componenti di PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, inclusi i vetrini di controllo Control Slides, devono essere conservati nel contenitore originale, al buio e a una temperatura di 2-8 C. Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza stampata sull'esterno della confezione. Nel caso in cui i reagenti vengano conservati diversamente da quanto specificato nel presente foglietto informativo, le condizioni dovranno essere convalidate dall'utente. Non è possibile indicare segni evidenti di instabilità del prodotto, pertanto è necessario analizzare gli opportuni controlli positivi e negativi contemporaneamente ai campioni dei pazienti. Preparazione dei campioni I campioni devono essere manipolati in modo tale da preservare il tessuto per la colorazione IHC. Utilizzare per tutti i campioni i metodi standard di processazione dei tessuti. Sezioni incluse in paraffina Tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina sono idonei all'uso. Le condizioni di manipolazione e processazione consigliate sono indicate di seguito: Tempo di ischemia <30 minuti prima dell'immersione nel fissativo e tempo di fissazione di ore in formalina neutra tamponata al 10%. L'uso di altri fissativi non è stato convalidato e può produrre risultati erronei. I campioni devono essere suddivisi in blocchi con spessore di 3 o 4 mm, fissati in formalina neutra tamponata al 10%, deidratati e chiarificati in una serie di alcoli e xilene, quindi infiltrati con paraffina fusa. La temperatura della paraffina non deve superare i 60 C. I campioni tissutali devono essere tagliati in sezioni di 4-5 µm. Dopo il sezionamento, i tessuti devono essere montati su vetrini caricati Fisherbrand Superfrost Plus o su vetrini Dako FLEX IHC Microscope Slides (codice K8020), quindi incubati in forno a 58 ± 2 C per 1 ora. Per preservare l'antigenicità, dopo il montaggio sui vetrini le sezioni tissutali devono essere conservate al buio a 2-8 C o a una temperatura ambiente massima di 25 C, quindi sottoposte a colorazione entro 4 mesi dal sezionamento. La temperatura di conservazione e di manipolazione dei vetrini in ogni fase posteriore alla preparazione non dovrà superare i 25 C per assicurare l'inte grità e l'antigenicità dei tessuti. L'uso di PD-L1 IHC 28-8 pharmdx su tessuti decalcificati non è stato convalidato e non è consigliato. Preparazione dei reagenti Prima della colorazione, è necessario preparare i reagenti indicati di seguito: EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) Preparare una quantità sufficiente di Target Retrieval Solution, Low ph, 1x diluendo la soluzione Target Retrieval Solution, Low ph (50x) 1:50 con acqua di grado reagente; il ph della soluzione Target Retrieval Solution 1x deve essere 6,1 ± 0,2. Con una bottiglia da 30 ml di Target Retrieval Solution, Low ph (50x), diluita 1:50 si ottengono 1,5 l di reagente 1x, quantità sufficiente per il riempimento di una tanica di PT Link, che consente di trattare fino a 24 vetrini per utilizzo. Eliminare la soluzione Target Retrieval Solution 1x dopo tre utilizzi e dopo non più di 5 giorni dalla diluizione. Se necessario, sono disponibili quantità aggiuntive di EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x), con il codice K8005. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) Preparare una quantità sufficiente di tampone di lavaggio, diluendo Wash Buffer (20x) 1:20 con acqua di grado reagente per le fasi di lavaggio. Conservare la soluzione 1x inutilizzata a 2-8 ºC per un periodo massimo di un mese. Eliminare il tampone se appare torbido. Per ulteriori informazioni, fare riferimento al manuale utente del sistema Autostainer Link 48 in uso. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) è disponibile con il codice K8007. Soluzione substrato-cromogeno DAB+ Questa soluzione deve essere accuratamente miscelata prima dell'uso. La formazione di precipitati nella soluzione non influisce sulla qualità della colorazione. Per preparare la soluzione substrato-cromogeno DAB+, aggiungere 1 goccia di DAB+ Chromogen liquido per ml di DAB+ Substrate Buffer e miscelare. La soluzione substrato-cromogeno è stabile per 5 giorni se conservata al buio a 2-8 C. Note importanti: Se si utilizza una bottiglia di DAB+ Substrate Buffer intera, aggiungere 9 gocce di DAB+ Chromogen. Sebbene sull'etichetta sia riportata la dicitura 7,2 ml, questa indica il volume utilizzabile e non tiene in considerazione il "volume morto" nella bottiglia. Il colore di DAB+ Chromogen liquido nella bottiglia può variare da trasparente a color lavanda-marrone. Ciò non influisce sulle prestazioni del prodotto. Diluire secondo le linee guida fornite in precedenza. L'aggiunta di un eccesso di DAB+ Chromogen liquido a DAB+ Substrate Buffer causa una riduzione del segnale positivo. Procedura di colorazione su Autostainer Link 48 Note sulla procedura Prima dell'uso, l'utente deve leggere attentamente le seguenti istruzioni e acquisire dimestichezza con tutti i componenti e lo strumento (vedere la sezione "Precauzioni"). Prima di procedere all'immunocolorazione, tutti i reagenti devono essere equilibrati a temperatura ambiente (20-25 C). Analogamente, tutte le fasi di incubazione devono essere eseguite a temperatura ambiente. Non consentire l'essiccazione delle sezioni tissutali durante la procedura di colorazione. Sezioni tissutali asciutte possono mostrare livelli di colorazione aspecifica superiori. Tutte le fasi e i tempi di incubazione richiesti per la colorazione sono preimpostati nel software Dako Link. Per ulteriori informazioni sulla programmazione dei protocolli e sul caricamento di vetrini e reagenti, fare riferimento ai manuali utente di Autostainer Link 48 e PT Link. ( ) P03914IT_02/SK / p. 4/18

5 Nota: i reagenti e le istruzioni forniti in questo sistema sono stati progettati per l'ottenimento di prestazioni ottimali quando utilizzati con i reagenti e i materiali consigliati. L'ulteriore diluizione dei reagenti o l'uso di tempi o temperature di incubazione diversi da quelli indicati possono produrre risultati erronei o discordanti. Protocollo di colorazione Selezionare il protocollo di colorazione PD-L1 IHC 28-8 pharmdx tra le opzioni del menu a discesa DakoLink. Tutte le fasi e i tempi di incubazione richiesti per la colorazione sono preimpostati in DakoLink. Se nel server in uso non sono presenti i protocolli PD-L1 IHC 28-8 pharmdx appropriati, contattare il rappresentante dell'assistenza tecnica locale. Fase 1: Procedura di deparaffinazione, reidratazione e smascheramento antigenico (3-in-1) Procedura consigliata: Per i dettagli, vedere la Guida Utente PT Link. Impostare PT Link (codice PT100/PT101) con il preriscaldamento e il raffreddamento a 65 C. Impostare i l riscaldamento a 97 C per 20 minuti. Riempire le taniche di PT Link con 1,5 l di soluzione di lavoro Target Retrieval Solution, Low ph, 1x, per tanica, per coprire le sezioni di tessuto. Preriscaldare la soluzione Target Retrieval Solution a 65 C. Immergere i rack Autostainer contenenti sezioni tissutali FFPE montate nella soluzione Target Retrieval Solution, Low ph (soluzione di lavoro 1x) preriscaldata, all'interno della tanica di PT Link. Incubare per 20 minuti a 97 C. Appena completata l'incubazione per lo smascheramento antigenico e portata la temperatura a 65 C, rimu overe ciascun rack Autostainer con i vetrini dalla tanica di PT Link e posizionarlo immediatamente in una vaschetta apposita (ad esempio, PT Link Rinse Station, codice PT109) contenente Wash Buffer (codice K8007) diluito e a temperatura ambiente. Lasciare i vetrini immersi in Wash Buffer diluito e a temperatura ambiente per 5 minuti. Fase 2: Procedura di colorazione Dopo la procedura di deparaffinazione, reidratazione e smascheramento antigenico (3-in-1), i rack Autostainer con i vetrini vengono posizionati in Autostainer Link 48. Assicurarsi che i vetrini siano sempre bagnati con il tampone durante il caricamento e prima di iniziare il ciclo. Lo strumento eseguirà la procedura di colorazione applicando il reagente appropriato, monitorando il tempo di incubazione ed effettuando il lavaggio dei vetrini tra le applicazioni dei reagenti. I tempi di incubazione dei reagenti sono preimpostati nel software Dako Link. Fase 3: Colorazione di contrasto I vetrini devono essere sottoposti a colorazione di contrasto per 7 minuti con EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (codice K8008). Il tempo di incubazione con Hematoxylin è preimpostato nel protocollo. Fase 4: Montaggio È richiesto un mezzo di montaggio permanente e non acquoso. Nota: con il tempo, potrebbe verificarsi una perdita di intensità della colorazione dei vetrini associata a diversi fattori che includono, a titolo esemplificativo ma non limitativo, la colorazione di contrasto, metodi e materiali di montaggio e le condizioni di conservazione. Per ridurre al minimo la perdita di intensità della colorazione, conservare i vetrini al buio a temperatura ambiente (20-25 C). Controllo di qualità I reagenti in PD-L1 IHC 28-8 pharmdx sono stati sottoposti a controllo di qualità tramite immunoistochimica utilizzando le procedure di smascheramento antigenico e colorazione descritte in precedenza. Eventuali variazioni apportate alle procedure consigliate per la fissazione, la processazione e l'inclusione dei tessuti nel laboratorio dell'utente possono produrre una significativa variabilità nei risultati. I controlli di qualità devono essere inclusi in ogni ciclo di colorazione. Tali controlli di qualità sono indicati nella tabella 1 e includono un campione tissutale del paziente con colorazione H&E, tessuti di controllo positivo e negativo forniti dal laboratorio e un vetrino Control Slide fornito da Dako (15). Negli Stati Uniti, consultare le linee guida di controllo qualità del Certification Program for Immunohistochemistry del College of American Pathologists (CAP). Per ulteriori informazioni, fare riferimento anche al documento del CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (14). Verifica del saggio Prima del primo utilizzo di un sistema di colorazione in una procedura diagnostica, l'utente deve verificare le prestazioni del saggio su una serie di tessuti forniti dal laboratorio con prestazioni IHC note e che rappresentino tessuti con positività e negatività note. Fare riferimento alle procedure di controllo della qualità precedentemente descritte in questa sezione del foglietto informativo del prodotto. Tali procedure di controllo qualità devono essere ripetute per ogni nuovo kit oppure ogniqualvolta venga apportata una modifica ai parametri del saggio. Le opzioni per la risoluzione dei potenziali problemi, il relative cause e gli interventi correttivi consigliati sono descritti nella tabella 12. Interpretazione della colorazione - Tumore NSCLC non squamoso e melanoma La valutazione dei vetrini deve essere eseguita da un patologo per mezzo di un microscopio ottico. Per la valutazione della colorazione immunoistochimica di PD-L1 e l'assegnazione del punteggio, è possibile utilizzare un ingrandimento dell'obiettivo 4x per una valutazione iniziale del campione intero, quindi passare a obiettivi 10-20x per l'assegnazione del punteggio (se necessario, è possibile utilizzare obiettivi 40x per conferma). La colorazione di PD-L1 è rappresentata da un prodotto di reazione marrone (3,3'-diaminobenzidina, DAB). Una colorazione positiva per PD-L1 viene definita come colorazione delle membrana plasmatica completa circonferenziale e/o parziale lineare, di qualsiasi intensità. La valutazione deve essere eseguita sull'intero campione. Tutte le cellule tumorali vitali sull'intero vetrino del paziente sottoposto alla colorazione di PD-L1 devono essere valutate e incluse nell'assegnazione del punteggio per PD-L1. Per determinare la percentuale di cellule colorate, sul vetrino del paziente sottoposto alla colorazione di PD-L1, devono essere presenti almeno 100 cellule tumorali vitali. La colorazione citoplasmatica, se presente, non viene considerata per l'assegnazione del punteggio. Anche le cellule non maligne e le cellule immunitarie (ad esempio linfociti o macrofagi infiltranti) possono presentare una colorazione con PD-L1. Queste cellule non devono essere tuttavia incluse nell'assegnazione del punteggio per la determinazione della positività per PD-L1. ( ) P03914IT_02/SK / p. 5/18

6 NOTA: durante l'interpretazione dei campioni dei pazienti affetti da melanoma può essere riscontrata una pigmentazione marrone dovuta alla melanina. La melanina deve essere esclusa durante l'assegnazione del punteggio alla colorazione della membrana plasmatica. Al fine di identificare ed escludere il contenuto di melanina, può essere utile un confronto con un vetrino sequenziale colorato con NCR. Se un contenuto elevato di melanina impedisce l'assegnazione del punteggio alla colorazione della membrana plasmatica delle cellule tumorali, il campione può essere escluso dall'interpretazione e considerato indeterminato. Per ogni ciclo di colorazione, i vetrini devono essere esaminati nell'ordine indicato nella tabella 1, al fine di determinare la validità del ciclo di colorazione e per consentire la valutazione della colorazione del tessuto del campione. Per ulteriori indicazioni, fare riferimento al documento "PD-L1 IHC 28-8 pharmdx Interpretation Manual for Non-Squamous Non-Small Cell Lung Cancer o for Melanoma" (Manuale per l'interpretazione relativa al cancro del polmone non a piccole cellule non squamoso o al melanoma di PD-L1 IHC 28-8 pharmdx). Tabella 1: Ordine consigliato per la valutazione dei vetrini Campioni Principio Requisiti 1. H&E (componente fornito dal laboratorio) Una colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) del campione tissutale viene analizzata per prima per valutare l'istologia e il livello di preservazione del tessuto. La colorazione con PD-L1 IHC 28-8 pharmdx e la colorazione H&E devono essere eseguite su sezioni seriali provenienti dallo stesso blocco in paraffina del campione. I campioni tissutali devono essere integri, con un buon livello di preservazione 2. Control Slide (componente fornito da Dako) Il vetrino Control Slide sottoposto a colorazione con l'anticorpo primario anti-pd-l1 di PD-L1 IHC 28-8 pharmdx deve essere esaminato per confermare il funzionamento corretto di tutti i reagenti. Il vetrino Control Slide contiene il pellet di una linea cellulare positiva per PD-L1 e il pellet di una linea cellulare negativa per PD-L1. e devono confermare l'indicazione del tumore. Un vetrino Control Slide deve essere sottoposto a colorazione con l'anticorpo primario anti-pd-l1 in ogni ciclo di colorazione. Criteri di accettazione per NCI-H226 (linea cellulare di controllo positiva per PD-L1): Colorazione della membrana plasmatica di una percentuale di cellule 80%, con un'intensità della colorazione media 2+. Colorazione aspecifica con intensità <1+. Criteri di accettazione per MCF-7 (linea cellulare di controllo negativa per PD-L1): Nessuna colorazione specifica. Colorazione aspecifica con intensità <1+. Tenere presente che nel pellet cellulare MCF-7 occasionalmente è possibile osservare la colorazione di alcune cellule. Si applicano i seguenti criteri di accettazione: la presenza di un totale di cellule con colorazione caratteristica della membrana plasmatica 10 o una colorazione citoplasmatica con intensità 1+ entro i bordi del pellet cellulare MCF-7 è considerata accettabile. 3. Vetrini con tessuto di controllo positivo (componente fornito dal laboratorio) Successivamente devono essere esaminati i vetrini con tessuto di controllo positivo sottoposti a colorazione sia con l'anticorpo primario anti-pd-l1, sia con Negative Control Reagent. Questi vetrini consentono di verificare l'efficacia del metodo di fissazione e del processo di smascheramento antigenico. I controlli basati su tessuti positivi noti devono essere utilizzati solo per il monitoraggio della correttezza delle prestazioni dei tessuti sottoposti alla procedura e dei reagenti di test, NON come ausilio nella formulazione di una diagnosi specifica dei campioni del paziente. Se una delle linee cellulari di controllo non soddisfa tali criteri, tutti i risultati relativi ai campioni del paziente devono essere considerati non validi. I controlli devono essere campioni bioptici/chirurgici della stessa indicazione tumorale del campione del paziente, fissati, sottoposti a processazione e inclusi prima possibile con le stesse modalità adottate per i campioni del paziente. Per l'interpretazione dei risultati della colorazione utilizzare campioni integri, poiché le cellule necrotiche o deteriorate spesso presentano colorazioni aspecifiche. I tessuti selezionati per l'uso come controlli positivi devono presentare una colorazione positiva da debole a moderata, quando sottoposti a colorazione con PD-L1, per consentire il rilevamento di variazioni anche lievi nella sensibilità del saggio. Due vetrini con tessuto di controllo positivo devono essere inclusi in ogni ciclo di colorazione. Vetrino sottoposto a colorazione con PD-L1: si deve riscontrare la presenza di colorazione marrone della membrana plasmatica. La colorazione aspecifica deve essere 1+. Vetrini sottoposti a colorazione con Negative Control Reagent: nessuna colorazione della membrana. La colorazione aspecifica deve essere 1+. Se i controlli con tessuto di controllo positivo non presentano la colorazione positiva appropriata, i risultati relativi ai campioni di test devono essere considerati non validi. ( ) P03914IT_02/SK / p. 6/18

7 4. Vetrini con tessuto di controllo negativo (componente fornito dal laboratorio) 5. Vetrino del tessuto del paziente sottoposto a colorazione con Negative Control Reagent 6. Vetrino del tessuto del paziente sottoposto a colorazione con l'anticorpo primario anti-pd-l1 Successivamente devono essere esaminati i vetrini con tessuto di controllo negativo (con negatività per PD-L1 nota) sottoposti a colorazione sia con l'anticorpo primario anti-pd-l1, sia con Negative Control Reagent, per verificare la specificità della marcatura dell'antigene bersaglio con l'anticorpo primario. In alternativa, è possibile usare porzioni di tessuto di controllo positivo come tessuto di controllo negativo, tuttavia ciò deve essere verificato dall'utente. Esaminare i campioni del paziente sottoposti a colorazione con il reagente Negative Control Reagent di PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Questo reagente viene utilizzato al posto dell'anticorpo primario e fornisce un ausilio nell'interpretazione della colorazione specifica nel sito dell'antigene. Esaminare infine l'intero vetrino dei campioni del paziente sottoposto a colorazione con l'anticorpo primario anti-pd-l1 di PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Per informazioni specifiche sull'immunoreattività di PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, fare riferimento alle sezioni Cenni introduttivi, Limiti e Caratteristiche di prestazione. I controlli devono essere campioni bioptici/chirurgici della stessa indicazione tumorale del campione del paziente, fissati, sottoposti a processazione e inclusi prima possibile con le stesse modalità adottate per i campioni del paziente. In ogni ciclo di colorazione devono essere inclusi due vetrini con tessuto di controllo negativo. Vetrino sottoposto a colorazione con PD-L1: Nessuna colorazione della membrana nelle cellule tumorali. La colorazione aspecifica deve essere 1+. Vetrini sottoposti a colorazione con Negative Control Reagent: nessuna colorazione della membrana. La colorazione aspecifica deve essere 1+. Se si osserva una colorazione specifica della membrana plasmatica nei vetrini con tessuto di controllo negativo, i risultati relativi ai campioni del paziente devono essere considerati non validi. L'assenza della colorazione della membrana plasmatica consente di verificare la marcatura specifica dell'antigene bersaglio con l'anticorpo primario anti- PD-L1. La colorazione aspecifica deve essere 1+. L'intensità della colorazione positiva deve essere valutata nel contesto della colorazione aspecifica di fondo osservata sul vetrino trattato con Negative Control Reagent nello stesso ciclo. Come per ogni test immunoistochimico, un risultato negativo indica che l'antigene non è stato rilevato ma non necessariamente che l'antigene era assente nelle cellule/tessuti analizzati. Tutte le cellule tumorali vitali sull'intero vetrino del paziente sottoposto alla colorazione di PD-L1 devono essere valutate e incluse nell'assegnazione del punteggio per PD-L1. Per determinare la percentuale di cellule colorate, sul vetrino del paziente sottoposto alla colorazione di PD-L1, devono essere presenti almeno 100 cellule tumorali vitali. Limiti generali 1. L'immunoistochimica è una tecnica diagnostica multifase che richiede una formazione specifica per quanto riguarda la selezione dei reagenti appropriati, la scelta dei tessuti, la fissazione, la processazione e la preparazione dei vetrini per immunoistochimica, nonché l'interpretazione dei risultati della colorazione. 2. La colorazione dei tessuti è correlata alle modalità di manipolazione e processazione del tessuto precedenti alla colorazione. Procedure errate di fissazione, congelamento, scongelamento, lavaggio, asciugatura, riscaldamento e sezionamento oppure la contaminazione con altri tessuti o liquidi possono produrre artefatti, intrappolare l'anticorpo o generare risultati falsi negativi. Risultati incoerenti possono essere dovuti anche a variazioni nei metodi di fissazione e di inclusione o da irregolarità intrinseche del tessuto. 3. Una colorazione di contrasto eccessiva o incompleta può compromettere la correttezza dell'interpretazione dei risultati. 4. L'interpretazione clinica di qualsiasi colorazione positiva o della sua assenza deve essere effettuata tenendo in considerazione la presentazione clinica, la morfologia e altri criteri istopatologici. L'interpretazione clinica di una colorazione o della sua assenza deve essere integrata da studi morfologici e da controlli adeguati, nonché da altri test diagnostici. Il vetrino colorato deve essere interpretato da un patologo qualificato con una conoscenza approfondita di anticorpi, reagenti e metodi impiegati. La colorazione deve essere eseguita in un laboratorio autorizzato certificato, sotto la supervisione di un patologo, il quale esaminerà i vetrini colorati e garantirà l'adeguatezza dei controlli positivi e negativi. 5. I tessuti delle persone infette dal virus dell'epatite B e contenenti l'antigene di superficie dell'epatite B (HBsAg) potrebbero evidenziare una colorazione aspecifica con perossidasi di rafano (15). 6. Non si può escludere completamente la possibilità di reazioni impreviste in tipi di tessuto già analizzati in precedenza, a causa della variabilità biologica dell'espressione antigenica nelle neoplasie o in altri tessuti patologici. Si invita a documentare le reazioni impreviste e a comunicarle all'assistenza tecnica Dako. 7. È possibile che vengano generati risultati falsi positivi a causa del legame non immunologico di proteine o prodotti di reazione con il substrato. I falsi positivi possono essere causati anche dall'attività della pseudoperossidasi (eritrociti) e dall'attività della perossidasi endogena (citocromo c) (14). 8. I reagenti e le istruzioni forniti in questo sistema sono stati concepiti per l'ottenimento di prestazioni ottimali. L'ulteriore diluizione dei reagenti o l'uso di tempi o temperature di incubazione diversi da quelli indicati possono produrre risultati erronei o discordanti. Limitazioni specifiche del prodotto 1. Il deterioramento dell'antigene nel tessuto, nel tempo, può provocare risultati falsi-negativi. Una volta montate sui vetrini, le sezioni tissutali devono essere conservate al buio a 2-8 C o a una temperatura ambiente massima di 25 C, quindi sottoposti a colorazione entro 4 mesi dal sezionamento. La temperatura di conservazione e di manipolazione dei vetrini in ogni fase posteriore alla preparazione non dovrà superare i 25 C per assicurare l'integrità e l'antigenicità dei tessuti. 2. Per garantire risultati ottimali e riproducibili, la proteina PD-L1 richiede un pretrattamento di smascheramento antigenico quando i tessuti sono fissati come di routine (in formalina tamponata neutra) e inclusi in paraffina. 3. Non sostituire i reagenti con reagenti di altri numeri di lotto di questo prodotto o di kit di altri produttori. L'unica eccezione è rappresentata da EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) che, se necessario, è disponibile con il codice K8005. ( ) P03914IT_02/SK / p. 7/18

8 4. Le linee cellulari di controllo sottoposte a colorazione devono essere utilizzate esclusivamente per la convalida del ciclo di colorazione e non devono essere utilizzate per l'assegnazione del punteggio alla reazione di colorazione nelle sezioni tissutali. 5. L'uso di PD-L1 IHC 28-8 pharmdx su tessuti trattati con fissativi diversi dalla formalina neutra tamponata al 10% non è stato convalidato. 6. Le biopsie escissionali, incisionali, punch o core needle sono state considerate campioni accettabili nelle sperimentazioni cliniche con PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Gli agoaspirati o gli altri campioni citologici sono risultati insufficienti per l'analisi dei biomarker e sono stati esclusi dalle sperimentazioni cliniche con PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Valutazione delle prestazioni non cliniche Specificità analitica per PD-L1 IHC 28-8 pharmdx L'anticorpo primario di PD-L1 IHC 28-8 pharmdx è un anticorpo monoclonale di coniglio diretto contro la proteina PD-L1 umana, clone L'immunogeno utilizzato per la generazione dell'anticorpo è una proteina PD-L1 umana ricombinante purificata contenente il dominio extracellulare (Phe19-Thr239) della PD-L1 umana. La colorazione IHC con l'anticorpo primario anti-pd-l1 non ha mostrato alcuna reattività crociata per la proteina PD-L2 esogena espressa in cellule di ovaio di criceto cinese (CHO). PD-L1 IHC 28-8 pharmdx rileva in modo specifico la proteina di membrana PD-L1 espressa in cellule tumorali in tessuti FFPE. Tale rilevamento può essere completamente abolito con l'aggiunta di antigene PD-L1. PD-L1 IHC 28-8 pharmdx non rileva la proteina di membrana PD-L1 in cellule tumorali knock-out per PD-L1, in cui il gene di PD-L1 è stato eliminato tramite manipolazione genetica. Tessuti normali e neoplastici La tabella 2 fornisce un quadro dell'immunoreattività dell'anticorpo Monoclonal Rabbit Anti-Human PD-L1 relativamente a tessuti normali selezionati. La tabella 3 fornisce un quadro dell'immunoreattività dell'anticorpo Monoclonal Rabbit Anti-Human PD-L1 relativamente a tessuti neoplastici in microarray tissutali multi-tumorali. Tutti i tessuti analizzati sono stati fissati in formalina e inclusi in paraffina e successivamente colorati con PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, secondo le istruzioni riportate nel foglietto informativo. PD-L1 IHC 28-8 pharmdx ha rilevato la proteina PD-L1 localizzata sulla membrana plasmatica di tipi cellulari per cui si conosce l'espressione dell'antigene PD-L1, quali cellule immunitarie e cellule di origine epiteliale principalmente tumorali. Tabella 2: Reattività dei tessuti normali a PD-L1 IHC 28-8 pharmdx Tipo di tessuto Colorazione positiva della membrana (q.tà testata) plasmatica: Elementi del tessuto Colorazione positiva citoplasmatica: Elementi del tessuto Cellule mesoteliali (3) 0/3 0/3 Cerebrum (3) 0/3 0/3 Cervelletto (3) 0/3 0/3 Cervice (3) 1/3 epitelio 1/3 epitelio Colon (3) 2/3 macrofagi 0/3 Cute (3) 0/3 1/3 epitelio Esofago (3) 0/3 0/3 Fegato (3) 2/3 cellule immunitarie 2/3 cellule immunitarie Ghiandola salivare (3) 0/3 0/3 Intestino tenue (2) 0/2 0/2 Ipofisi (3) 1/3 adenoipofisi anteriore 1/3 adenoipofisi anteriore 3/3 neuroipofisi posteriore Mammella (3) 0/3 0/3 Midollo osseo (3) 3/3 megacariociti 3/3 megacariociti Milza (3) 1/3 macrofagi 0/3 3/3 cellule reticolo-endoteliali Muscolo, cardiaco (3) 0/2 0/2 Muscolo, scheletrico (3) 0/2 0/2 Nervo, periferico (3) 0/3 0/3 Ovaio (3) 0/3 0/3 Pancreas (3) 3/3 epitelio (principalmente cellule insulari) 3/3 epitelio (principalmente cellule insulari) Paratiroide (3) 3/3 epitelio 0/3 Polmone (3) 3/3 macrofagi alveolari 0/3 Prostata (2) 0/2 0/2 Rene (3) 3/3 epitelio tubulare 3/3 epitelio tubulare Stomaco (3) 0/3 0/3 Surrene (3) 3/3 cellule della midollare 3/3 cellule della midollare Testicolo (3) 0/3 1/3 cellule di Leydig Timo (3) 3/3 epitelio midollare 0/3 Tiroide (3) 0/3 0/3 Tonsilla (3) 3/3 epitelio criptico 0/3 3/3 centro germinale (cellule immunitarie) Utero (3) 0/3 0/3 ( ) P03914IT_02/SK / p. 8/18

9 Tabella 3: Reattività dei tessuti neoplastici a PD-L1 IHC 28-8 pharmdx Tipo di tumore Ubicazione/organo Positivi per PD-L1/totale (N=162) Appendice 1/1 Carcinoma broncoalveolare, polmone 0/1 Cervice, tipo endocervicale 0/1 Cistifellea 2/4 Colon 2/5 Colon, metastatico al fegato 1/1 Colon, mucinoso 0/1 Esofago 1/1 Ghiandola salivare/parotide 0/2 GI, metastatico al polmone 0/1 Intestino tenue 0/2 Mammella, DCIS 0/2 Mammella, duttale invasivo 3/7 Mammella, duttale invasivo metastatico ai linfonodi 1/1 Ovaio 0/1 Adenocarcinoma Ovaio, endometrioide 0/1 Ovaio, mucinoso 0/1 Ovaio, sieroso 0/1 Pancreas 1/2 Pancreas, duttale 0/3 Polmone 2/5 Prostata 2/4 Retto 2/4 Stomaco 1/6 Stomaco, mucinoso 0/1 Testa e collo, palato duro 0/1 Tiroide, follicolare 0/1 Tiroide, follicolo-papillare 0/1 Tiroide, papillare 0/3 Utero, a cellule chiare 1/1 Utero, endometrio 1/3 Astrocitoma Cervello 0/3 Carcinoma Nasofaringeo, NPC 0/1 Carcinoma a cellule ad anello con castone del colon Carcinoma a cellule ad anello con 0/1 metastatico all'ovaio castone Colon 0/1 Carcinoma a cellule di transizione Rene 0/1 Vescica 3/6 Carcinoma a cellule squamose esofageo metastatico al linfonodo 1/1 Cervice 2/4 Carcinoma a cellule squamose Cute 1/2 Esofago 4/7 Polmone 1/3 Testa e collo 0/2 Utero 1/1 Carcinoma a grandi cellule Polmone 1/1 Carcinoma a piccole cellule Polmone 1/2 Carcinoma adrenocorticale Surrenale 0/1 Carcinoma delle cellule basali Cute 0/1 Carcinoma delle cellule renali Cellule chiare Rene 0/6 Papillare Rene 0/1 Carcinoma embrionale Testicolo 0/1 Carcinoma epatocellulare Fegato 1/5 Carcinoma midollare Tiroide 0/1 Cordoma Cavità pelvica 0/1 Epatoblastoma Fegato 0/1 Ependimoma Cervello 0/1 Glioblastoma Cervello 0/1 Linfoma Anaplastico a grandi cellule Linfonodo 1/1 Diffuso a cellule B Linfonodo 2/4 Hodgkin Linfonodo 2/2 Non-Hodgkin Linfonodo 1/1 Liposarcoma Cavità addominale, mucinoso 0/1 Medulloblastoma Cervello 0/1 Cavità nasale 0/1 Melanoma Retto 0/1 ( ) P03914IT_02/SK / p. 9/18

10 Tipo di tumore Ubicazione/organo Positivi per PD-L1/totale (N=162) Meningioma Cervello 0/2 Mesotelioma Peritoneo 0/1 Neuroblastoma Retroperitoneo 0/1 Neuroectodermico primitivo Retroperitoneo 0/1 Neurofibroma Tessuto molle, lombare 0/1 Sarcoma Cellule chiare Parete addominale 0/1 Condrosarcoma Osso 0/1 Leiomiosarcoma Tessuto molle, parete toracica 0/1 Leiomiosarcoma Vescica 0/1 Liposarcoma Cavità addominale, mucinoso 0/1 Osteosarcoma Osso 0/2 Prostata 0/1 Rabdomiosarcoma Retroperitoneo 0/1 Tessuto molle, embrionale 0/1 Sarcoma sinoviale Cavità pelvica 0/1 Seminoma Testicolo 0/2 Spermatocitoma Testicolo 0/2 Timoma Mediastino 1/1 Tumore delle cellule insulari Pancreas 0/1 Colon 0/1 Tumore interstiziale Intestino tenue 0/1 Retto 0/1 Sensibilità analitica: NSCLC non squamoso La sensibilità analitica di PD-L1 IHC 28-8 pharmdx è stata analizzata su 112 casi unici di campioni FFPE di carcinoma polmonare non squamoso (NSCLC) negli stadi da I a IV utilizzando un lotto di produzione industriale. La valutazione dell'espressione di PD-L1 ha evidenziato una colorazione in un intervallo dallo 0 al 100% di cellule tumorali positive e un'intensità di colorazione compresa tra 0 e 3. Ripetibilità: NSCLC non squamoso La ripetibilità di PD-L1 IHC 28-8 pharmdx è stata valutata presso Dako. I dati sulle prestazioni sono riportati nella tabella 4. Per ciascun livello di espressione di PD-L1 riscontrato, sono state determinate la percentuale di concordanza negativa (NPA), la percentuale di concordanza positiva (PPA) e la percentuale di concordanza totale (OA) di un confronto dei test a coppie indipendenti. L'osservazione con frequenza maggiore è stata utilizzata come riferimento per il calcolo di NPA, PPA, OA e dei corrispondenti intervalli di confidenza al 95% secondo il punteggio di Wilson, pertanto uno dei risultati con tale osservazione è stato escluso dai confronti a coppie. ( ) P03914IT_02/SK / p. 10/18

11 Tabella 4: Ripetibilità di PD-L1 IHC 28-8 pharmdx - Tumore NSCLC non squamoso % di concordanza (IC 95%) Ripetibilità Metodo Livello di espressione 1% Livello di espressione 5% Livello di espressione 10% Inter-strumento Ciascuno di 10 campioni di NSCLC non squamoso con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato con tre replicati su ciascuno di tre strumenti Autostainer Link 48. In totale sono stati eseguiti 60 confronti a coppie indipendenti. NPA 100 (82,4, 100) PPA 100 (91,6, 100) OA 100 (94,0, 100) NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (90,4, 100) OA 100 (94,0, 100) NPA 100 (91,6, 100) PPA 100 (82,4, 100) OA 100 (94,0, 100) Inter-analista Inter-giorno Inter-lotto Intra-ciclo Ciascuno di 12 campioni di NSCLC non squamoso con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato con tre replicati da tre analisti su uno strumento Autostainer Link 48. In totale sono stati eseguiti 72 confronti a coppie indipendenti. Ciascuno di 10 campioni di NSCLC non squamoso con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato con tre replicati in cinque giorni non consecutivi su uno strumento Autostainer Link 48. In totale sono stati eseguiti 80 confronti a coppie indipendenti. Ciascuno di 20 campioni di NSCLC non squamoso con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato con due replicati con ciascuno di cinque lotti di reagenti su uno strumento Autostainer Link 48. In totale sono stati eseguiti 160 confronti a coppie indipendenti. Ciascuno di 10 campioni di NSCLC non squamoso con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato con otto replicati in un ciclo su uno strumento Autostainer Link 48. In totale sono stati eseguiti 70 confronti a coppie indipendenti. NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (92,6, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (93,6, 100) OA 100 (95,4, 100) NPA 100 (94,3, 100) PPA 100 (96,2, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (84,5, 100) PPA 100 (92,7, 100) OA 100 (94,8, 100) NPA 100 (91,6, 100) PPA 100 (88,6, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 100 (89,3, 100) PPA 100 (92,6, 100) OA 100 (95,4, 100) NPA 100 (95,4, 100) PPA 100 (95,4, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (87,9 100) PPA 100 (91,6, 100) OA 100 (94,8, 100) NPA 100 (93,4, 100) PPA 100 (82,4, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 98,2 (90,6, 99,7) PPA 100 (86,2, 100) OA 98,8 (93,3, 99,8) NPA 100 (96,4, 100) PPA 100 (93,6, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (92,7, 100) PPA 100 (84,5, 100) OA 100 (94,8, 100) Riproducibilità esterna: NSCLC non squamoso La riproducibilità esterna di PD-L1 IHC 28-8 pharmdx è stata valutata in tre siti di analisi esterni, rispettivamente. Il blinding e la randomizzazione delle sezioni colorate sono stati eseguiti prima di assegnare il punteggio a tali sezioni. I dati sulle prestazioni sono riportati nella tabella 5. Per ciascun livello di espressione di PD-L1 riscontrato, sono state determinate la percentuale di concordanza negativa (NPA), la percentuale di concordanza positiva (PPA) e la percentuale di concordanza totale (OA) di un confronto dei test a coppie indipendenti. L'osservazione con frequenza maggiore è stata utilizzata come riferimento per il calcolo di NPA, PPA, OA e dei corrispondenti intervalli di confidenza al 95% secondo il punteggio di Wilson, pertanto uno dei risultati con tale osservazione è stato escluso dai confronti a coppie. ( ) P03914IT_02/SK / p. 11/18

12 Tabella 5: Riproducibilità di PD-L1 IHC 28-8 pharmdx (tumore NSCLC non squamoso) valutata in tre siti esterni Riproducibilità Valutazione inter-sito (tre siti) Metodo Ciascuno di 10 campioni di NSCLC non squamoso con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in cinque giorni non consecutivi. L'analisi inter-sito è stata eseguita tra tre siti su un totale di 140 confronti a coppie indipendenti. Saggio intra-sito Ciascuno di 10 campioni di NSCLC non squamoso con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in cinque giorni non consecutivi presso ciascuno dei tre siti dello studio. L'analisi intra-sito è stata eseguita per tre siti su un totale di 120 confronti a coppie indipendenti. Interosservatore (un osservatore presso ciascuno dei tre siti) Intraosservatore (un osservatore presso ciascuno dei tre siti) Il punteggio relativo a 15 campioni di NSCLC non squamoso con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1, sottoposti a colorazione con PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, è stato fornito da tre patologi, uno in ognuno dei tre siti dello studio, in tre giorni non consecutivi. L'analisi inter-osservatore è stata eseguita tra tre siti su un totale di 120 confronti a coppie indipendenti. Il punteggio relativo a 15 campioni di NSCLC non squamoso con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1, sottoposti a colorazione con PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, è stato fornito da tre patologi, uno in ognuno dei tre siti dello studio, in tre giorni non consecutivi. L'analisi intra-osservatore è stata eseguita per tre siti su un totale di 90 confronti a coppie indipendenti. % di concordanza (IC 95%) Livello di espressione 1% Livello di espressione 5% NPA 100 (93,6, 100) PPA 98,8 (93,6, 99,8) OA 99,3 (96,1, 99,9) NPA 100 (92,6, 100) PPA 98,6 (92,5, 99,8) OA 99,2 (95,4, 99,9) NPA 96,9 (89,3, 99,1) PPA 100 (93,6, 100) OA 98,3 (94,1, 99,5) NPA 95,8 (86,0, 98,8) PPA 100 (91,6, 100) OA 97,8 (92,3, 99,4) NPA 91,4 (82,5, 96,0) PPA 97,1 (90,2, 99,2) OA 94,3 (89,1, 97,1) NPA 96,4 (87,9, 99,0) PPA 95,3 (87,1, 98,4) OA 95,8 (90,6, 98,2) NPA 100 (94,3, 100) PPA 89,3 (78,5, 95,0) OA 95,0 (89,5, 97,7) NPA 100 (93,1, 100) PPA 100 (90,8, 100) OA 100 (95,9, 100) Valutazione delle prestazioni cliniche: NSCLC non squamoso L'utilità clinica di PD-L1 IHC 28-8 pharmdx è stata valutata nello studio CA209057, uno studio di fase 3, randomizzato, in aperto su nivolumab rispetto a docetaxel in soggetti adulti ( 18 anni) affetti da tumore NSCLC con cellule non squamose avanzato o metastatico in seguito a fallimento di un trattamento precedente con una doppietta chemioterapica a base di platino. 582 soggetti sono stati randomizzati in 112 siti in 22 paesi (Argentina, Australia, Austria, Brasile, Canada, Cile, Repubblica ceca, Francia, Germania, Hong Kong, Ungheria, Italia, Messico, Norvegia, Perù, Polonia, Romania, Federazione russa, Singapore, Spagna, Svizzera e Stati Uniti). I soggetti sono stati randomizzati 1:1 e stratificati in base a: 1) precedente uso di terapia di mantenimento rispetto a nessuna terapia di mantenimento e 2) terapia di seconda linea rispetto a terapia di terza linea. I campioni di tessuto tumorale pre-studio (linea di base) sono stati raccolti prima della randomizzazione e prima del primo trattamento per analisi prepianificate dell'efficacia sulla base dei livelli di espressione di PD-L1 alla linea di base predefiniti (obiettivo secondario). L'endpoint primario era rappresentato dalla sopravvivenza totale (OS). Altri endpoint secondari erano rappresentati da tasso di risposta oggettiva (ORR), sopravvivenza libera da progressione (PFS) e miglioramento dei sintomi associati alla malattia in 12 settimane, secondo la Scala dei sintomi del carcinoma polmonare (LCSS). Le caratteristiche demografiche e della malattia alla linea di base sono state bilanciate tra i soggetti randomizzati nei gruppi di trattamento con nivolumab e con docetaxel. L'età media era di 62 anni (intervallo: da 21 a 85) con il 34% 65 anni di età e il 7% 75 anni di età. La maggior parte dei pazienti era di razza bianca (92%) e di sesso maschile (55%); lo stato delle prestazioni ECOG alla linea di base era 0 (31%) o 1 (69%). Il 79% dei pazienti era stato o era fumatore. I campioni tumorali sono stati raccolti da tumori NSCLC non squamosi, in conformità ai criteri di inclusione dello studio. Le frequenze di espressione di PD-L1 per ciascuno dei livelli di espressione di riferimento predefiniti in tutti i soggetti randomizzati nello studio CA sono riportate nella tabella 6. Tabella 6: Frequenza di espressione di PD-L1 pre-studio in tutti i soggetti con tumore NSCLC non squamoso randomizzati - CA Categoria di espressione della proteina PD-L1 nella popolazione di riferimento Nivolumab 3 mg/kg Docetaxel Totale Complessiva PD-L1 quantificabile, N (%) 231 (79,1) 224 (77,2) 455 (78,2) Espressione di PD-L1 1% 123/231 (53,2) 123/224 (54,9) 246/455 (54,1) Espressione di PD-L1 < 1% 108/231 (46,8) 101/224 (45,1) 209/455 (45,9) Espressione di PD-L1 5% 95/231 (41,1) 86/224 (38,4) 181/455 (39,8) Espressione di PD-L1 < 5% 136/231 (58,9) 138/224 (61,6) 274/455 (60,2) Espressione di PD-L1 riferimento 10% 86/231 (37,2) 79/224 (35,3) 165/455 (36,3) Espressione di PD-L1 < 10% 145/231 (62,8) 145/224 (64,7) 290/455 (63,7) PD-L1 non quantificabile, N (%) 61 (20,9) 66 (22,8) 127 (21,8) I pazienti con espressione di PD-L1 per tutti i livelli di espressione predefiniti nel gruppo OPDIVO erano correlati a livelli di sopravvivenza superiori rispetto a quelli osservati con docetaxel, mentre nei pazienti che non presentavano l'espressione di PD-L1 la sopravvivenza era simile a quella osservata con docetaxel. Differenze significative nella OS mediana sono state osservate in sottogruppi di trattamento con nivolumab rispetto a docetaxel quando analizzati in base al livello di espressione di PD-L1. La OS mediana è risultata pari a 17,1, 18,2 e 19,4 mesi per i soggetti trattati con nivolumab, rispetto ai 9,0, 8,1 e 8,0 mesi per i soggetti trattati con docetaxel, con livelli di espressione di PD-L1 1%, 5% e 10%, rispettivamente. Non sono state riscontrate differenze nella OS tra i gruppi di trattamento in soggetti con livelli di espressione < 1%, < 5% e < 10%, con intervalli di OS mediana da 9,7 a 10,4 mesi per il nivolumab e da 10,1 a 10,3 mesi per il docetaxel. I rapporti di rischio (HR) non stratificato e la sopravvivenza totale (OS) mediana sono illustrati nella figura 1. Il grafico di Kaplan-Meier per sottogruppi in base al livello di espressione di PD-L1 è mostrato nella figura 2 e nella figura 3. ( ) P03914IT_02/SK / p. 12/18

13 Figura 1: forest plot - OS sulla base dell'espressione di PD-L1 in pazienti affetti da tumore NSCLC non squamoso - CA OS mediana (mesi) Livello di espressione di PD-L1 HR non OPDIVO Docetaxel stratificato 1% (n = 246) 0,59 17,1 9,0 <1% (n = 209) 5% (n = 181) <5% (n = 274) 10% (n = 165) <10% (n = 290) Nota: il rapporto di rischio non stratificato e l'ic al 95% corrispondente sono stati valutati in un modello a rischi proporzionali di Cox, utilizzando il braccio randomizzato come covariata singola. Figura 2: sopravvivenza totale (OS, Overall Survival) - Pazienti affetti da tumore NSCLC non squamoso con espressione di PD-L1 <1% - CA ,0 0,9 0,8 0,25 0,5 1,0 2,0 A favore di OPDIVO 0,90 10,4 10,1 0,43 18,2 8,1 1,01 9,7 10,1 0,40 19,4 8,0 1,00 9,9 10,3 Probabilità di sopravvivenza 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 OPDIVO Docetaxel Sopravvivenza totale (mesi) Numero di rischio OPDIVO Docetaxel ( ) P03914IT_02/SK / p. 13/18

14 Figura 3: sopravvivenza totale (OS, Overall Survival) - Pazienti affetti da tumore NSCLC non squamoso con espressione di PD-L1 <1% - CA ,0 0,9 0,8 Probabilità di sopravvivenza 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 OPDIVO Docetaxel 0, Sopravvivenza totale (mesi) Numero di rischio OPDIVO Docetaxel ( ) P03914IT_02/SK / p. 14/18

15 Sensibilità analitica: Melanoma La sensibilità analitica di PD-L1 IHC 28-8 pharmdx è stata analizzata su 104 casi unici di campioni FFPE di melanoma negli stadi da I a IV. La valutazione dell'espressione di PD-L1 ha evidenziato una colorazione in un intervallo dallo 0 al 100% di cellule tumorali positive e un'intensità di colorazione compresa tra 0 e 3. Ripetibilità: Melanoma La ripetibilità di PD-L1 IHC 28-8 pharmdx è stata valutata presso Dako. Il blinding e la randomizzazione delle sezioni colorate sono stati eseguiti prima di assegnare il punteggio a tali sezioni. I dati sulle prestazioni sono riportati nelle tabelle 7 e 8. Per ciascun livello di espressione di PD-L1 riscontrato, sono state determinate la percentuale di concordanza negativa media (ANA), la percentuale di concordanza positiva media (APA) e la percentuale di concordanza totale (OA) di un confronto non ridondante dei test a coppie. Tabella 7: Ripetibilità di PD-L1 IHC 28-8 pharmdx- Melanoma Ripetibilità Inter-strumento Inter-analista Inter-giorno Inter-lotto Intra-ciclo Metodo Ciascuno dei 16 campioni di melanoma con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato con tre replicati su ciascuno dei tre strumenti Autostainer Link 48. In totale sono stati eseguiti 160 confronti a coppie. Ciascuno dei 16 campioni di melanoma con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato con tre replicati da tre analisti su uno strumento Autostainer Link 48. In totale sono stati eseguiti 240 confronti a coppie. Ciascuno dei 16 campioni di melanoma con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato con tre replicati in cinque giorni non consecutivi su uno strumento Autostainer Link 48. In totale sono stati eseguiti 160 confronti a coppie. Ciascuno dei 16 campioni di melanoma con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato con due replicati con ciascuno dei cinque lotti di reagenti su uno strumento Autostainer Link 48. In totale sono stati eseguiti 640 confronti a coppie. Ciascuno dei 16 campioni di melanoma con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato con otto replicati in un ciclo su uno strumento Autostainer Link 48. In totale sono stati eseguiti 160 confronti a coppie. % di concordanza (IC 95%) Livello di espressione 1% Livello di espressione 5% ANA 89,5 (83,2, 93,6) APA 90,5 (84,8, 94,2) OA 90,0 (86,0, 92,9) ANA 96,4 (92,9, 98,2) APA 96,8 (93,8, 98,4) OA 96,6 (94,5, 97,9) ANA 95,5 (90,3, 97,9) APA 96,8 (93,1, 98,6) OA 96,3 (93,5, 97,9) ANA 98,6 (97,3, 99,3) APA 98,8 (97,8, 99,4) OA 98,7 (98,0, 99,2) ANA 97,1 (92,6, 98,9) APA 97,7 (94,1, 99,1) OA 97,4 (94,9, 98,7) ANA 90,8 (85,7, 94,2) APA 85,5 (77,6, 90,9) OA 88,8 (84,6, 91,9) ANA 91,3 (87,1, 94,2) APA 88,8 (83,4, 92,6) OA 90,2 (87,0, 92,7) ANA 90,0 (84,0, 93,9) APA 90,0 (84,0, 93,9) OA 90,0 (86,0, 92,9) ANA 92,6 (90,6, 94,2) APA 86,6 (83,1, 89,5) OA 90,5 (88,7, 91,9) ANA 93,6 (89,0, 96,4) APA 89,8 (82,7, 94,2) OA 92,2 (88,4, 94,8) Riproducibilità esterna: Melanoma La riproducibilità esterna di PD-L1 IHC 28-8 pharmdx è stata valutata in tre siti di analisi esterni. Il blinding e la randomizzazione delle sezioni colorate sono stati eseguiti prima di assegnare il punteggio a tali sezioni. I dati sulle prestazioni sono riportati nella tabella 8. Per ciascun livello di espressione di PD-L1 riscontrato, sono state determinate la percentuale di concordanza negativa media (ANA), la percentuale di concordanza positiva media (APA) e la percentuale di concordanza totale (OA) di un confronto non ridondante dei test a coppie. Tabella 8: Riproducibilità di PD-L1 IHC 28-8 pharmdx (melanoma) valutata in tre siti esterni % di concordanza (IC 95%) Riproducibilità Metodo Livello di espressione 1% Livello di espressione 5% Ciascuno dei 18 campioni di melanoma con diversi livelli di ANA 99,3 (98,8, 99,7) ANA 93,8 (92,5, 95,1) Valutazione intersito (tre siti) giorni non consecutivi. L'analisi inter-sito è stata eseguita espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in cinque APA 99,3 (98,8, 99,7) APA 92,7 (91,2, 94,2) OA 99,3 (98,7, 99,7) OA 93,3 (91,9, 94,7) tra tre siti su un totale di 1350 confronti a coppie. Saggio intra-sito Inter-osservatore (un osservatore presso ciascuno dei tre siti) Intra-osservatore (un osservatore presso ciascuno dei tre siti) Ciascuno dei 18 campioni di melanoma con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1 è stato analizzato in cinque giorni non consecutivi presso ciascuno dei tre siti dello studio. L'analisi intra-sito è stata eseguita per tre siti su un totale di 540 confronti a coppie. Il punteggio relativo a 30 campioni di melanoma con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1, sottoposti a colorazione con PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, è stato fornito da tre patologi, uno in ognuno dei tre siti dello studio, in tre giorni non consecutivi. L'analisi inter-osservatore è stata eseguita tra tre siti su un totale di 810 confronti a coppie. Il punteggio relativo a 30 campioni di melanoma con diversi livelli di espressione IHC di PD-L1, sottoposti a colorazione con PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, è stato fornito da tre patologi, uno in ognuno dei tre siti dello studio, in tre giorni non consecutivi. L'analisi intra-osservatore è stata eseguita per tre siti su un totale di 270 confronti a coppie. ANA 99,3 (98,4, 99,8) APA 99,3 (98,5, 99,8) OA 99,3 (98,5, 99,8) ANA 90,4 (88,1, 92,5) APA 91,7 (89,7, 93,6) OA 91,1 (89,1, 93,1 ) ANA 99,2 (97,9, 100) APA 99,3 (98,2, 100) OA 99,3 (98,1, 100) ANA 97,3 (95,8, 98,5) APA 96,8 (95,1, 98,2) OA 97,0 (95,6, 98,3) ANA 93,2 (91,3, 94,8) APA 91,9 (89,8, 93,9) OA 92,6 (90,7, 94,3) ANA 97,9 (96,1, 99,4) APA 97,6 (95,4, 99,2) OA 97,8 (95,9, 99,3) ( ) P03914IT_02/SK / p. 15/18

16 Valutazione delle prestazioni cliniche: Melanoma Le prestazioni di PD-L1 IHC 28-8 pharmdx sono state valutate utilizzando i campioni dei pazienti inclusi nella sperimentazione clinica CA209067, uno studio randomizzato di fase 3, in doppio cieco, per il confronto tra la monoterapia con nivolumab, o la terapia combinata con nivolumab e ipilimumab, e la monoterapia con ipilimumab in pazienti affetti da melanoma metastatico non trattati in precedenza. Allo studio hanno partecipato 1296 pazienti in tutto, presso 137 siti in 21 paesi diversi (Australia, Austria, Belgio, Canada, Repubblica Ceca, Danimarca, Finlandia, Francia, Germania, Irlanda, Israele, Italia, Paesi Bassi, Nuova Zelanda, Norvegia, Polonia, Spagna, Svezia, Svizzera, Regno Unito e Stati Uniti). Su 1296 pazienti, 945 sono stati randomizzati in uno dei tre bracci di trattamento, con un rapporto 1:1:1, e stratificati in base allo stato PD-L1 ( 5% tramite CTA), allo stato BRAF e allo stadio M della AJCC. Le caratteristiche di riferimento per i vari aspetti demografici e della malattia sono state globalmente bilanciate tra i soggetti randomizzati nei gruppi di trattamento. L'età mediana era di 60 anni (intervallo: da 18 a 90) con il 40% di età 65 anni e il 13% di età 75 anni. I pazienti erano quasi tutti di razza bianca (97%) e di sesso maschile (65%). I campioni tumorali pre-studio (riferimento) raccolti dai pazienti affetti da melanoma sono stati prelevati prevalentemente dalle sedi metastatiche (86%). Le analisi retrospettive del tessuto tumorale archiviato con PD-L1 IHC 28-8 pharmdx sono state eseguite per 915 dei 945 pazienti dello studio randomizzato (97%). Per 55 pazienti dello studio (6%) la melanina ha impedito la valutazione dello stato dell'espressione di PD-L1 e tale stato è risultato sconosciuto per 47 pazienti (5%) a causa del ritiro del consenso o di campioni mancanti. Lo stato dell'espressione di PD-L1 è stato accertato per 843 pazienti dello studio (89%). La proporzione dei pazienti con espressione della proteina PD-L1 tumorale con livelli 1% e <1% è stata bilanciata tra i gruppi di trattamento. I risultati dei test sullo stato dell'espressione di PD-L1 per i pazienti dello studio CA con PD-L1 IHC pharmdx sono riepilogati nella tabella 9. Tabella 9: Frequenza dell'espressione di PD-L1 in tutti i soggetti con melanoma randomizzati - CA Numero di soggetti, n (%) nivolumab nivolumab + ipilimumab ipilimumab Soggetti con PD-L1 quantificabile a Livello di espressione di PD-L1: 1% 171 (59,4) 155 (55,8) 164 (59,2) <1% 117 (40,6) 123 (44,2) 113 (40,8) 5% 80 (27,8) 68 (24,5) 75 (27,1) <5% 208 (72,2) 210 (75,5) 202 (72,9) a Il numero si riferisce solo ai risultati con PD-L1 quantificabile; non include i risultati con PD-L1 indeterminata La terapia con nivolumab e la terapia combinata con nivolumab e ipilimumab mostrano un miglioramento della PFS, rispetto alla terapia con ipilimumab, in tutti i sottogruppi di espressione di PD-L1. Il confronto tra la terapia nivolumab+ipilimumab e solo nivolumab non costituiva l'obiettivo principale dello studio e non sono state effettuate analisi per determinare tale differenza. Tuttavia, nei soggetti con bassi livelli di espressione di PD-L1, la combinazione nivolumab + ipilimumab ha mostrato un miglioramento della PFS, rispetto al trattamento con solo nivolumab. Nei soggetti con alti livelli di espressione di PD-L1, il trattamento con solo nivolumab e la combinazione nivolumab + ipilimumab hanno fornito livelli di PFS paragonabili. Nei gruppi di trattamento nivolumab e nivolumab + ipilimumab sono stati riscontrati tassi di risposta oggettiva (ORR) superiori per entrambi gli stati di espressione di PD-L1 ( 1% o 5% di espressione della membrana cellulare tumorale), rispetto al gruppo di trattamento con solo ipilimumab. I soggetti trattati con nivolumab e nivolumab + ipilimumab in cui l'espressione della membrana cellulare tumorale era 1% o 5% presentavano tassi ORR numericamente superiori, rispetto ai soggetti con <1% o <5%, rispettivamente. Nel gruppo trattato con ipilimumab, i tassi ORR sono risultati paragonabili per tutti i sottogruppi di espressione di PD-L1, indipendentemente dalla definizione di tale espressione ( 1% o 5% di espressione della membrana cellulare tumorale). Inoltre, per il gruppo trattato con nivolumab + ipilimumab è stato osservato un rapporto ORR superiore, rispetto alla monoterapia con nivolumab, indipendentemente dal livello di espressione di PD-L1. In base all'analisi dell'espressione di PD-L1 di questo studio, l'aumento della PFS per la combinazione nivolumab + ipilimumab, rispetto alla terapia con solo nivolumab, risulta superiore per il gruppo con espressione di PD-L1 <5%. L'espressione di PD-L1 può essere utilizzata come ausilio per l'identificazione dei pazienti che possono trarre beneficio dalla combinazione nivolumab+ipilimumab, rispetto alla monoterapia con nivolumab, ma tali informazioni devono essere considerate nel contesto di tutte le informazioni cliniche disponibili, poiché sono state osservate risposte clinicamente significative per tutti i sottogruppi di espressione di PD-L1. Tra tutti i livelli di espressione di PD-L1, l'efficacia del trattamento è risultata superiore per la popolazione (ITT, intention-to-treat) sottoposta alla combinazione nivolumab+ipilimumab, rispetto a quella trattata con solo ipilimumab. I rapporti di rischio (HR) PFS e la mediana della PFS in base ai livelli di espressione di PD-L1 sono riepilogati nella tabella 10. I rapporti ORR valutati dai ricercatori per i livelli di espressione di PD L1 sono riepilogati nella tabella 11. ( ) P03914IT_02/SK / p. 16/18

17 Tabella 10: Sopravvivenza libera da progressione (PFS) in base al livello di PD-L1 e al gruppo di trattamento - Tutti i soggetti con melanoma randomizzati CA Trattamento nivolumab +ipilimumab nivolumab ipilimumab Livello di espressione di PD-L1 N di eventi/ N di pazienti Mediana della PFS in mesi (IC 95%) HR per ipilimumab (IC 95%) HR per monoterapia con nivolumab (IC 95%]) 5% 28/68 13,96(9,72, NR) 0,39 (0,25, 0,62) 0,96 (0,58, 1,58) <5% 103/210 11,24(7,98, NR) 0,42 (0,32, 0,54) 0,70 (0,54, 0,91) 1% 72/155 12,35(8,51, NR) 0,44 (0,32, 0,58) 0,95 (0,69, 1,31) <1% 59/123 11,17(6,93, NR) 0,38 (0,27, 0,53) 0,56 (0,40, 0,79) 5% 33/80 14,00(9,07, NR) 0,41 (0,26, 0,63) -- <5% 122/208 5,32(2,83, 7,06) 0,59 (0,47, 0,75) -- 1% 79/171 12,39(8,11, NR) 0,46 (0,34, 0,61) -- <1% 76/117 2,83(2,76, 5,13) 0,67 (0,49, 0,92) -- 5% 53/75 3,94 (2,79, 4,21) <5% 154/202 2,83 (2,76, 3,09) % 122/164 3,91 (2,83, 4,17) <1% 85/113 2,79 (2,66, 2,96) Abbreviazioni: IC = intervallo di confidenza, NR = non raggiunto, PFS = sopravvivenza libera da progressione (Progression-Free Survival) HR = rapporto di rischio (Hazard Ratio) per l'effetto del trattamento in base al modello dei rischi proporzionali di Cox con trattamento, stato PD-L1 e interazione fra trattamento e stato PD-L1 Tabella 11: Rapporti ORR valutati dai ricercatori: pazienti con melanoma in base all'espressione di PD-L1 - Soggetti testati per PD-L1 - CA PD-L1 ORR Trattamento Livello di espressione Numero di pazienti % [IC 95%] Nivolumab + Ipilimumab Nivolumab Ipilimumab 5% 68 72% (59,9, 82,3) <5% % (47,8, 61,6) 1% % (56,4, 72,0) <1% % (42,8, 61,1) 5% 80 58% (45,9, 68,5) <5% % (34,6, 48,4) 1% % (46,6, 62,0) <1% % (24,9, 42,6) 5% 75 21% (12,7, 32,3) <5% % (12,8, 23,8) 1% % (13,2, 25,7) <1% % (11,9, 27,0) Tabella 12: Risoluzione dei problemi Problema Possibile causa Intervento consigliato 1. Nessuna colorazione dei vetrini di controllo o dei campioni 1a. Errore di programmazione. 1a. Verificare che il programma SK005 PD-L1 IHC 28-8 pharmdx sia stato selezionato per la programmazione dei vetrini. 1b. Assenza di reazione con la soluzione substrato-cromogeno DAB+ (DAB) 1b. Verificare che la soluzione substrato-cromogeno DAB+ sia stata preparata in modo corretto. 1c. Sodio azide in tampone di lavaggio. 1c. Utilizzare esclusivamente Dako Wash Buffer, codice K d. Deterioramento del vetrino Control Slide 1d. Controllare la data di scadenza e le condizioni di conservazione del kit sull'esterno della confezione. 2a. Colorazione debole dei vetrini con i 2a. Utilizzo di un metodo di fissazione 2a. Assicurarsi che vengano utilizzati solo fissativi e campioni. 2b. Colorazione debole dei vetrini dei campioni o della linea cellulare positiva sul vetrino Control Slide fornito da Dako. 3. Colorazione di fondo dei vetrini eccessiva. non appropriato. 2b. Smascheramento antigenico inadeguato. 3a. Paraffina rimossa in modo incompleto. metodi di fissazione approvati. 2b. Verificare che la procedura di pretrattamento 3-in-1 sia stata eseguita correttamente. 3a. Verificare che la procedura di pretrattamento 3-in-1 sia stata eseguita correttamente. ( ) P03914IT_02/SK / p. 17/18

18 4. Distacco del tessuto dai vetrini. 3b. Essiccazione dei vetrini durante il caricamento su Autostainer Link 48. 3c. Legame aspecifico dei reagenti alla sezione di tessuto. 4a. Utilizzo di vetrini per microscopio non appropriati. 3b. Assicurarsi che i vetrini siano sempre bagnati con il tampone durante il caricamento e prima di iniziare il ciclo. 3c. Verificare che la fissazione del campione sia appropriata e/o valutare l'eventuale presenza di necrosi. 4a. Utilizzare Dako FLEX IHC Microscope Slides, (codice K8020), o vetrini caricati (come Fisherbrand Superfrost Plus). 4b. Le sezioni tagliate devono essere collocate in un forno a 58 ± 2 C per 1 ora prima della colorazione. 5a. Assicurarsi che vengano utilizzati solo fissativi e metodi di fissazione approvati. 5b. Utilizzare esclusivamente Dako Wash Buffer, codice K Ciò è normale e non influenza la colorazione. 4b. Preparazione inadeguata dei campioni 5. Colorazione specifica del vetrino 5a. Utilizzo di un metodo di fissazione eccessivamente intensa. non appropriato. 5b. Utilizzo di tampone di lavaggio non appropriato. 6. La soluzione Target Retrieval 6. Quando riscaldata, la soluzione Solution appare torbida quando Target Retrieval Solution assume un riscaldata. aspetto torbido. NOTA: se il problema non è imputabile a nessuna delle cause sopracitate o se l'intervento correttivo consigliato non si rivela efficace, contattare l'assistenza tecnica Dako per ricevere ulteriori suggerimenti. Ulteriori informazioni sulle tecniche di colorazione e sulla preparazione dei campioni sono disponibili nel documento di Dako "Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods" (Manuale di formazione: metodi di colorazione istochimica) (15) (fornito da Dako). Bibliografia 1. Topalian SL, Drake CG, Pardoll DM. Targeting the PD-1/B7-H1 (PD-L1) pathway to activate anti-tumor immunity. Curr Opin Immunol 2012; 24(2): Wang C, Thudium KB, Han M, et al. In vitro characterization of the anti-pd-1 antibody nivolumab, BMS , and in vivo toxicology in non-human primates. Cancer Immunol Res 2014; 2(9): OPDIVO package insert. 4. YERVOY package insert. 5. Borghaei H, Paz-Ares L, Horn L, et al. Nivolumab versus Docetaxel in advanced nonsquamous non-small-cell lung cancer. N Engl J Med 2015; /NEJMoa Phillips T, Simmons P, Inzunza HD, et al. Development of an automated PD-L1 immunohistochemistry (IHC) assay for non-small cell lung cancer. Appl Immuno Molec Morph 2015; 23(8): Phelps RM, et al. NCI-navy medical oncology branch cell line data base. J. Cell. Biochem. 1996; 63: Weber JS, D Angelo SP, Minor D, et al. Nivolumab versus chemotherapy in patients with advanced melanoma who progressed after anti-ctla-4 treatment (CheckMate 037): a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet Oncol 2015; 16: Postow M, Chesney J, Pavlick A, et al. Nivolumab and ipilimumab versus ipilimumab in untreated melanoma. N Engl J Med. 2015; 372(21): Larkin J, Chiarion-Sileni V, Gonzalez R et al. Combined Nivolumab and Ipilimumab or Monotherapy in Untreated Melanoma. N Engl J Med. 2015; 373(1): Topalian SL, Hodi FS, Brahmer JR, et. al. Safety, Activity, and Immune Correlates of Anti-PD-1 Antibody in Cancer. New Eng. J. Med. 2012; 366(26): Department of Health, Education and Welfare, National Institutes for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No , Current 13. August 16, Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Fourth Edition. CLSI document M29-A4 [ISBN ]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 950 West Valley Road, Suite 2500, Wayne, Pennsylvania USA, Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCCLS). Quality assurance for Design Control and Implementation of Immunohistochemistry Assays; Approved guideline. CLSI document I/LA28-A2; Vol. 31 No. 4 (ISBN ) CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA; Taylor CR and Rudbeck L. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. Sixth Edition. Dako, Carpinteria, California; Edizione 04/16 ( ) P03914IT_02/SK / p. 18/18