o-cresolo e FENOLO URINARI in FLUORIMETRIA Codice Z55010 BIOCHIMICA L o-cresolo è un metabolita urinario del Toluene, sostanza che viene impiegata nella produzione di materiali d uso corrente (colle, vernici, lacche, inchiostri ecc.) ed è presente anche come microinquinante ambientale. Questo fa si che tutta la popolazione sia esposta a modeste concentrazioni di Toluene. Inoltre una sorgente indoor importante di Toluene è costituita dal fumo di tabacco. Secondo Nise e coll. i valori di o-cresolo sono influenzati soprattutto dal fumo di tabacco, in quanto sono state riscontrate concentrazioni di 60 µg/g creatinina nei non fumatori e concentrazioni 3 o 4 volte superiori nei fumatori. L o-cresolo urinario può originare da due fonti di inquinamento; trasformazione del Toluene oppure da assorbimento di o-cresolo, infatti l o-cresolo, come sostanza tossica, può essere assorbito anche per contatto attraverso la cute. L escrezione urinaria di o-cresolo è molto bassa: la velocità di eliminazione è di circa 1,08 mg/h e notevole è la variabilità interindividuale. Sono state riscontrate concentrazioni medie di 38 µg/g creatinina nei maschi e 25 µg/g creatinina nelle femmine. Il dosaggio a livello urinario è indice di esposizione al Toluene. Il FENOLO viene usato in numerose sintesi organiche di interesse industriale e come disinfettante. E tossico di per sé e in particolare può determinare grave irritazione alla cute perché viene rapidamente assorbito per contatto. Il dosaggio a livello urinario può anche indicare esposizione a BENZENE, visto che il Fenolo è il principale metabolita di tale composto. Livelli urinari compresi tra 100 e 400 mg/litro di Fenolo sono stati osservati in soggetti esposti a concentrazioni ambientali di Benzene di 4,2 12,5 mg/m 3 mentre livelli urinari di 75 mg/litro di Fenolo sono stati osservati a seguito di esposizioni pari a 10 ppm di Benzene. EUREKA srl LAB DIVISION VAT N 01547310423 E-mail:info@eurekaone.com www.eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi 25 60033 Chiaravalle (AN) ITALY Tel. +39 071 7450790 Fax + 39 071 7496579 Release N 006 Giugno 2009 1
CARATTERISTICHE DEL KIT Principio del Metodo : L o-cresolo ed il Fenolo, dopo idrolisi a 80 C per 15 minuti, vengono prima diluiti con uno stabilizzante e successivamente trattati con un complessante specifico per eliminare le possibili interferenze; la soluzione viene direttamente iniettata in HPLC. Recupero del Metodo : 100 % Sensibilità del Metodo : 2 µg/l per l o-cresolo 0,1 mg/l per il Fenolo Valori normali per non esposti: o-cresolo urinario: 30-350 µg/l Fenolo urinario: < 20 mg/l Indici biologici di Esposizione I.B.E. Fenolo urinario : 0 50 mg/l Esposizione a Benzene 0 250 mg/l Esposizione a Fenolo Riferimento: G Ital Med Lav Erg 2002;24:3 Suppl Contenuto della confezione : Reagente A Soluzione per Idrolisi, 1 x 20 ml Tutti i reagenti sono pronti all'uso e stabili 3 anni a Temperatura Ambiente ( 20 C). Il Calibratore è stabile 48 mesi a 2 8 C. Reagente B Soluzione Stabilizzante, 1 x 40 ml Reagente C Soluzione Complessante, 1 x 5 ml Reagente D Soluzione Starter, 1 x 2,5 ml Reagente E Soluzione Test o-cresolo, 1 x 5 ml Reagente F Soluzione Test Fenolo, 1 x 5 ml Reagente G Soluzione Test combinata, 1 x 5 ml Reagente H Calibratore liofilo, 2 x 10 ml Vedi Avvertenze Reagente I Soluzione Diluente, 1 x 90 ml Reagente M Fase Mobile, 2 x 500 ml Dotazione strumentale minima richiesta : Dotazione opzionale : Strumento HPLC isocratico con loop da 50 µl. Detector Fluorimetrico λ EX =270 nm λ EM =300 nm Registratore di cromatogrammi Autocampionatore. Computer gestionale Modalità di raccolta delle urine : Urine di fine turno. Se l analisi deve essere differita, congelare il campione a 20 C. Stabili oltre 4 mesi. 2
FASE PREANALITICA In una provetta pipettare : 990 µl di H 2 O di grado HPLC 10 µl di Reagente G - Soluzione Test combinata NOTA : Prima di iniziare la seduta analitica è consigliabile iniettare 50 µl di questa soluzione in HPLC per identificare il tempo di ritenzione dell o-cresolo e del Fenolo che devono essere simili a quelli riportati in fig. 1. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. PROCEDURA ANALITICA FASE 1 : Preparazione dei Campioni Dispensare in provette di vetro idonee con tappo a vite in teflon: Calibratore Campione Campione 2000 µl Reagente H Calibratore 2000 µl Reagente A Sol. per Idrolisi 200 µl 200 µl Agitare al vortex per 10 secondi FASE 2 : Porre la serie di provette in stufa a 80 C per 15 minuti. Lasciar raffreddare a temperatura ambiente FASE 3 : In provette tipo Eppendorf, aggiungere in sequenza: 100 µl di Calibratore o Campione Idrolizzato 400 µl di Reagente B Sol. Stabilizzante 50 µl di Reagente C Sol. Complessante 25 µl di Reagente D Sol. Starter FASE 4 : Procedura di Diluizione Agitare al vortex per 10 secondi e Attendere almeno 1 minuto In provette tipo Eppendorf, aggiungere in sequenza: 900 µl di Reagente I Soluzione Diluente 100 µl di campione precedentemente preparato Vortex per 10 secondi N.B.: il campione così preparato è stabile 7 giorni a 2-8 C INIEZIONE: Iniettare 50 µl della soluzione nel Cromatografo HPLC e attendere la stampa del cromatogramma. 3
REAGENTE E : SOLUZIONE TEST o-cresolo o-cresolo e FENOLO URINARI - Avvertenze o-cresolo 31,40 mg/l REAGENTE F : SOLUZIONE TEST FENOLO FENOLO 40,00 mg/l REAGENTE G : SOLUZIONE TEST COMBINATA o-cresolo FENOLO 15,70 mg/l 20,00 mg/l REAGENTE H : CALIBRATORE URINARIO LIOFILO - Lotto n ZUR637 o-cresolo FENOLO Modalità d uso e Ricostituzione: i Calibratori devono essere usati per calibrare il sistema HPLC. Aggiungere esattamente 10 ml di H 2 O di grado HPLC e agitare delicatamente per 15 min. fino a quando tutto il materiale non è dissolto. Conservazione e stabilità : i Calibratori liofili sono stabili 48 mesi dalla data di preparazione se conservati a 2 8 C. Almeno 12 ore a T Amb., 15 giorni se conservati a 2 8 C e 2 mesi a -20 C una volta ricostituiti. Non usarli dopo la data di scadenza. Confezionamento : 2 x 10 ml Precauzioni : questo calibratore in matrice umana deve essere trattato con cura e considerato come potenzialmente infettivo. 2,00 mg/l 3,80 mg/l PARAMETRI DEL DETECTOR FLUORIMETRICO 363 VARIAN λ EX λ EM SENSIBILITA TEMPO DI INTEGRAZIONE 270 nm 300 nm 2 - MEDIUM 5 secondi PROTEZIONE DELLA COLONNA ANALITICA Per salvaguardare la colonna analitica Reverse Phase GENESIS 4,6 x 150 mm, 4 µ, è tassativo l uso della Guard Column Cartridge Holder/CARTUCCIA PRECOLONNA, cod. ZUCC270 e dei PREFILTRI per CARTUCCIA PRECOLONNA (1 x 10 pz.) cod. ZUCC752. CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA Installare la colonna analitica nuova Reverse Phase GENESIS 4,6 x 150 mm, 4 µ. Disconnettere il detector e far passare 30 ml di una soluzione di H 2 O : Metanolo o Acetonitrile (20:80 v/v) e successivamente 30 ml di H 2 O per HPLC, al flusso di 1,2 ml/minuto. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Condizionare la colonna con la fase mobile al flusso di 1,2 ml/minuto e scaricare i primi 30 ml. Condizionare ulteriormente per 30 minuti anche a ricircolo di fase. E possibile effettuare analisi a ricircolo di fase, purchè si abbia l accortezza di filtrare la stessa Fase Mobile con filtro da 0,22 µ prima di ogni seduta analitica. Se la T Ambiente del Laboratorio è > 20 C si consiglia di conservare a 2-8 C la Fase Mobile fra una seduta analitica e l altra. PULIZIA DELLA COLONNA PARAMETRI HPLC Disconnettere il detector. Flussare 30 ml di H 2 O e scaricare. Flussare una soluzione di H 2 O : Metanolo o Acetonitrile (20:80 v/v) per 30 minuti scaricandola. Quando la colonna verrà usata di nuovo far passare 30 ml di H 2 O prima di condizionarla con la Fase Mobile. LOOP 50 µl Flusso di lavoro consigliato 1,5 ml/minuto Pressione corrispondente Circa 150 bar PARAMETRI INTEGRATORE ATTENUAZIONE 8 PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE 4
ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE Z9969 Calibratore multiparametrico per metabolici di composti tossici organici 5 x 10 ml Z8867 Controllo multiparametrico per metabolici di composti tossici organici-livello 1 10 x 10 ml Z8868 Controllo multiparametrico per metabolici di composti tossici organici-livello 2 10 x 10 ml Z8869 Controllo multiparametrico per metabolici di composti tossici organici_livelli 1 e 2 2 x 10 x 10 ml ZFM15960E Colonna Analitica Genesis C 18 (150 x 4,6mm -4 um) 1 PZ ZUCC270 Guard Column Cartridge Holder, Biocompact 1 PZ ZUCC752 Prefiltri per colonna C18 (4,3 mm x 1 cm) 1 x 10 PZ 5
o-cresolo e FENOLO URINARI (Cromatogrammi di Riferimento) Fig. 1 Test Combinato Fig. 2 Calibratore liofilo R.T. 6.786 Fenolo R.T. 7.505 Fenolo 6,70 mg/l R.T. 14.981 o-cresolo R.T. 16.961 o-cresolo 1,88 mg/l 6
o-cresolo e FENOLO URINARI (Cromatogrammi di Riferimento) Fig. 3 Controllo urinario alto Fig. 4 Controllo urinario basso R.T. 7.858 Fenolo 9,80 mg/l R.T. 7.504 Fenolo 2,50 mg/l R.T. 16.692 o-cresolo 4,01 mg/l R.T. 15.982 o-cresolo 1,04 mg/l 7