Cromosoma del batterio donatore Trasferimento della ORF nel vettore di espressione PRODUZIONE DELLA PROTEINA RICOMBINANTE Abbondante e facilmente purificabile

Contiene una ORF continua!! 5 NT non tradotto 3 NT Retrotrascrizione in cdna

PURIFICAZIONE DELLA FRAZIONE polya+ Catene di oligo dt legate alla matrice

Si generano estremità piatte

TESSUTO O COLTURA CELLULARE mrna COSTRUZIONE DI UNA LIBRARY DI cdna cdna Inserimento nel vettore Trasformazione in cellule batteriche SCREENING

PIASTRA PETRI DA 10 cm

Fosforilazione al 5 OH i deossi-oligonucleotidi sintetici hanno sempre il 5 con solo un OH

Nitrocellulosa trattata con NaOH: Lisi delle cellule batteriche Legame covalente del DNA al supporto Denaturazione del DNA 1. Ibridazione in liquido 2. Lavaggi 3. Autoradiografia

ds cdna sonde degenerate Denaturazione (NaOH) e ibridazione 5 5 5 Fosforilazione al 5 OH i deossi-oligonucleotidi sintetici hanno sempre il 5 con solo un OH

C 8h 12h 15h Proteina ricombinante

Biofarmaci o Farmaci proteici In un primo tempo solo come farmaci che replicano la funzione. La loro attività è uguale a quella naturale. Le proprietà farmacologiche non sono migliorate rispetto al prodotto naturale

PROTEINE TERAPEUTICHE RICOMBINANTI DI PRIMA GENERAZIONE Proteine identiche a quelle naturali INSULINA ERITOPOIETINA G-CSF FATTORI ANTIEMOFILICI VACCINI RICOMBINANTI DI SECONDA GENERAZIONE Proteine che sono state manipolate (muteine) VACCINI RICOMBINANTI tpa INSULINA ANTICORPI

L INSULINA E UNA PROTEINA DI SECREZIONE Sequenza (o peptide) segnale Sequenza di inizio della traslocazione al RER Peptide segnale che verrà prontamente digerito dalla peptide-segnalepeptidasi

Pre-proinsulin: per la secrezione dal pancreas è presente anche il peptide segnale all N-terminale Il peptide segnale Si perde dopo l entrata nel RER

Espressione di INSULINA UMANA ricombinante in batteri

Aggiunta di un peptide segnale per facilitare la purificazione (proteina nel sopranatante ) Purificazione del r-hgh dal terreno di coltura (dopo centrifugazione) Ormone della crescita umano hgh

PROTEINE DI SECREZIONE IN BATTERI Prima la SINTESI e poi la SECREZIONE Taglio del peptide segnale

CREAZIONE DI PROTEINE IBRIDE CON L AGGIUNTA DI SPECIFICI DOMINI PROTEICI PROTEINE DI FUSIONE

PROTEINE TERAPEUTICHE RICOMBINANTI DI PRIMA GENERAZIONE Proteine identiche a quelle naturali INSULINA ERITOPOIETINA G-CSF FATTORI ANTIEMOFILICI VACCINI RICOMBINANTI DI SECONDA GENERAZIONE Proteine che sono state manipolate (muteine) VACCINI RICOMBINANTI tpa INSULINA ANTICORPI

Azione della Pol I In vitro si usa il frammento di Klenow

MUTAGENESI SITO-SPECIFICA Oligonucleotide-diretta

MUTAGENESI SITO-SPECIFICA Oligonucleotide-diretta DUPLICAZIONE SEMI-CONSERVATIVA

Codice genetico Ridondante (degenerato) Codoni sinonomi Non ambiguo Universale (quasi!) Letto in direzione 5 3 Produce polipeptide in direzione NH2 - COOH Senza punteggiatura Un mrna ha un solo frame di lettura (determinato da AUG)

Mutagenesi oligonucleotide-diretta INSULINA INSULINA Lys-Pro: inversione in posizioni 28 e 29 oppure mutazione Pro/Asp maggiore solubilità e minore formazione di polimeri. Altre mutazioni per causare precipitazione a ph neutro dopo iniezione per un rilascio graduale Insulina per via orale

Mutagenesi oligonucleotide-diretta ATTIVATORE TISSUTALE DEL PLASMINOGENO VACCINO PER LA PERTOSSE

MUTAGENESI SITO-SPECIFICA Utilità nella ricerca di base Utilità a fini applicativi

TNF - Tumor Necrosis Factor Induttore della via estrinseca della apoptosi (recettori di morte) Regolatore del sistema immunitario Citochina prodotta dai macrofagi, con un ruolo chiave nella regolazione della risposta infiammatoria Elevati livelli ematici presenti in condizioni patologiche (artrite reumatoide, spondilite anchilosante, inflammatory bowel disease / Crohn s disease) Farmaci che ne bloccano l azione sono utili nel controllo di tali patologie

DOMINANTI NEGATIVI TNF TNF TRIMERO DEL RECETTORE del TNF TNF Mutato Dominante negativo Un trimero recettoriale si forma e si attiva interagento con tre molecole di TNF

Vaccino ricombinante per la pertosse ADP-ribosilasi Tossina attiva Enzima inattivo Proteina non tossica

Tossicità mediata da ADP-ribosilazione di proteine G ADP-ribosilazione NAD +

CONCENTRAZIONE DI ANTICORPI SPECIFICI NEL SIERO