Principi di Citofluorimetria di flusso
Il citofluorimetro è un microscopio modificato
Definizioni Flow Cytometry (Citofluorimetria di Flusso) Misurazione delle proprietà di cellule in flusso Flow Sorting (separazione cellulare mediante citofluorimetria) Separare (sorting) le cellule basandosi su proprietà misurate in citofluorimetria di flusso, altrimenti detto Fluorescence-Activated Cell Sorting
Fondamentali di Citofluorimetria Cellule in sospensione Fluidic a flusso in singola-fila attraverso uno spazio illuminato in cui Ottica diffrangono la luce ed emettono fluorescenza che sono raccolte, filtrate e Elettronic a convertite a valori digitali che sono immagazzinati su di un computer
A cytometer consists of: Electronics Fluidics Light detectors FL3 PerCP, Cy5 FL2 PE Computer FL1 FITC Laser Light 488nm SSC FSC
Rack elettronico MoFlo Ottica, Fluidica Summit WorkStation
Fluidica Necessità di avere cellule in sospensione che fluiscono in una singola fila attraverso un volume illuminato Nella maggior parte degli strumenti ciò si ottiene iniettando un campione in un liquido di scorrimento (sheath fluid) mentre passa attraverso un piccolo orifizio (50-300 µm) Quando le condizioni sono ottimali, il campione fluisce in una zona centrale senza mescolarsi al liquido di scorrimento (Flusso laminare)
Fluidica - Flusso Laminare Si può determinare se un flusso sia laminare tramite il numero di Reynolds Se R e < 2300, il flusso è laminare Se R e > 2300, il flusso è turbolento
Fluidica Il termine Focalizzazione Idrodinamica indica l introduzione di un ampio volume di fluido all interno di un volume più piccolo in maniera tale che il primo venga focalizzato nell asse di scorrimento
Fluidica Come si ottengono l iniezione del compione e la regolazione della velocità di flusso del campione? Pressione Differenziale Iniezione Volumetrica
Pressione differenziale
La pressione del liquido di scorrimento determinerà quale volume di liquido di scorrimento passa attraverso il nozzle per unità di tempo (assumendo che il flusso del campione sia trascurabile) La differenza di pressione tra liquido di scorrimento e campione controllerà quale volume di campione passa attraverso il nozzle per unità di tempo Il controllo non è assoluto in quanto cambiamenti nei coefficienti di attrito fra i due componenti influenzano il secondo parametro
Sistema di Iniezione Volumetrica Pressurizzazione tramite gas per regolare il volume di liquido di scorrimento che passa nell unità di tempo Uso di una pompa connessa ad una siringa per iniettare il campione => volume di campione che passa attraverso il nozzle per unità di tempo può essere variato cambiando la velocità del motore Il controllo è assoluto
Fluidica - Orientamento e Deformazione delle Cellule La focalizzazione idrodinamica fa sì che le cellule siano sottoposte a differenti forze deformanti in punti distinti della loro superficie => cellule vengono allineate lungo asse di scorrimento e deformate
Fluidica - Flow Chambers La Flow Chamber definisce asse e dimensioni dello scorrimento del liquido e del campione definisce il punto di ottimo focus idrodinamico può servire come punto di interrogazione (volume di illuminazione)
Jet-in-air (ottimo per sorting, proprietà ottiche inferiori)
Flow-through cuvette (eccellenti properietà ottiche, può essere usato per sorting)
Closed cross flow (eccellenti properietà ottiche, NON può essere usato per sorting)
Ottica Sorgente luminosa che deve essere focalizzata nel punto di illuminazione Due sorgenti luminose Laser Lampade ad arco
Ottica: Sorgenti luminose Lasers possono fornire una luce dotata di un unica lunghezza d onda (laser line) Potenza da milliwatt a watt Più economici raffreddati ad aria e più costosi raffreddati ad acqua fornisce un fascio di luce coerente
Ottica: Cammini ottici Un cammino ottico è il percorso che segue la luce dal volume di illuminazione al detettore Elementi ottici separano i canali e selezionano le lunghezze d onda
Ottica: Canale del Forward Scatter Quando si usa una sorgente laser l ammontare di luce diffratta in direzione frontale (lungo lo stesso asse in cui procede il raggio laser) viene rilevato dal canale del forward scatter L intensità del forward scatter è proporzinale a dimensioni, forma ed omogeneità ottica delle celllule
Forward Angle Light Scatter Laser FALS Sensor Purdue University Cytometry Laboratories
Ottica: Canale del Side Scatter Quando si usa una sorgente laser l ammontare di luce diffratta in direzione laterale (perpendicolarmente rispetto all asse in cui procede il raggio laser) viene rilevato dal canale del side scatter L intensità del canale è proporzionale a dimensione, forma ed omogeneità ottica delle cellule
90 Degree Light Scatter Laser FALS Sensor 90LS Sensor Purdue University Cytometry Laboratories
Ottica: Diffrazione della Luce Forward scatter più sensibile alle proprietà di superficie delle particelle può essere usato per distinguere cellule vive da cellule morte Side scatter tende ad essere più sensibile agli inclusi intracellulari distingue cellule granulate da non granulate
Ottica: Canali di Fluorescenza La fluorescenza emessa viene convogliata in specifici canali di fluorescenza La specificità di tali canali è controllata dalla selettività della lunghezza d onda di specchi e filtri
Fluorescence Detectors Laser FALS Sensor Fluorescenc e Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.) Purdue University Cytometry Laboratories
Ottica: Proprietà dei Filtri Long pass filters trasmettono lunghezze d onda al di sopra di una specifica lunghezza cut-on Short pass filters trasmettono lunghezze d onda al di sotto di una specifica lunghezza cut-off Band pass filters trasmettono lunghezze d onda in un range piuttosto stretto (band width) attorno ad una specifica lunghezza d onda
Standard Long Pass Filters Light Source 520 nm Long Pass Transmitted Filter Light >520 nm Light Standard Short Pass Filters Light Source 575 nm Short Transmitted Pass Filter Light <575 nm Light Purdue University Cytometry Laboratories
Standard Band Pass Filters 630 nm BandPass Filter White Light Source Transmitted Light 620-640 nm Light Purdue University Cytometry Laboratories
Ottica: Proprietà dei Filtri Quando un filtro è posto a 45 dalla sorgente luminosa ed è costituito in maniera tale che la luce che verrebbe bloccata viene in realtà riflessa si parla di specchio dicroico
Dichroic Filter/Mirror Filter placed at 45 o Light Source Transmitted Light original from Purdue University Reflected light Cytometry Laboratories;
Common Laser 350 457488 514 610 632 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Lines PE-TR Conj. Texas Red PI Ethidium PE FITC cis-parinaric acid Purdue University Cytometry Laboratories
Cy7APC PE-Cy5 LASER (488) APC D T PE-TxRed SHUTTE R PI Cy7PE Hoechst PE FITC SSC FS C I T U T
Ottica: Detettori Due tipi Fotodiodi Per segnali molto forrti (quando la saturazione è un potenziale problema: forward scatter) Fotomoltiplicatori più sensibile, ma può essere distrutto dall esposizione ad una quantità di luce eccessiva
Analisi: Istogrammi vs Dot Plot Sample 2 Sample 2 10 4 10 3 150 FL1-H: CD8.8 10 2 10 1 # Cells 100 50 10 0 0 100 200 300 400 500 FSC-H: Forward Scatter 0 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 FL1-H: CD8.8
Analisi: Parametri Fisici Sample 2 10 4 SSC-H: Side Scatter 10 3 10 2 10 1 10 0 0 100 200 300 400 500 FSC-H: Forward Scatter
Analisi: Compensazione No Compensation FL4-% FL-3 Side Scatter CD56 APC CD56 APC Forward Scatter CD3 PerCP CD3 PerCP
Analisi: Gating 258: HL15P3 HOECST + PI 258: HL15P3 HOECST + PI Pulse Width, FSC subset 4000 4000 99.2 3000 3000 FSC 2000 50.1 SSC 2000 1000 1000 0 0 1000 2000 3000 4000 Pulse Width 258: HL15P3 HOECST + PI FSC, SSC subset 0 0 1000 2000 3000 4000 FSC 258: HL15P3 HOECST + PI FL3 subset 4000 3000 3000 2000 # Cells 96.6 FL6 2000 1000 1000 0 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 FL3 0 0 1000 2000 3000 4000 FL5
APPLICAZIONI
Apoptosis Increased uptake or release of dyes Decrease in antigen expression Phosphatidyl serine exposure
Dendritic Cells untreated Dendritic Cells treated
UV 5.6% 9.4% 0.5% 16.7% PI FL 2 78.4% 6.7% 41.9% 40.9% Annexin V FL 1 Nick Kassouf
The Cell Cycle G 1 G 0 S G1: Gap 1 S: Synthetic G2: Gap 2 M: Mitosis G0: cells that cease division M G 2
In an ideal world. # of Events Increase in Fluorescence Intensity
In the real world. # of Events CV: SD/mean x 100. Increase in Fluorescence Intensity
Typical dual parameter plot Anti-BrdU FITC S Phase G1 G2/ M Propidium Iodide
Flow FISH sui Telomeri
Flow Karyotyping
Cytokine secretion