Lezioni di biotecnologie
Lezione 1 Il clonaggio 2
Cosa sono le biotecnologie? Le biotecnologie sono tutte quelle tecniche utilizzate (fin dall antichità) per produrre sostanze specifiche a partire da organismi viventi o da loro derivati. A metà del Novecento la biologia molecolare offre gli strumenti per lo sviluppo dell ingegneria genetica. Ceppo di batteri E. coli che produce insulina
Cos'è l'ingegneria GENETICA? L unione dei termini Ingegneria e Genetica sta ad indicare un atteggiamento progettuale (ingegneria), rivolto verso il patrimonio genetico di un organismo vivente. La Biotecnologia avanzata (che si impegna a creare nuovi organismi a partire dal trasferimento di geni da un organismo ad un altro), si avvale dell Ingegneria genetica. Quest ultima nacque circa vent anni fa, fondendo competenze di genetica e di biologia molecolare. Basilare la scoperta della struttura del DNA (acido desossiribonucleico) da parte di James Watson e Francis Crick nel 1953 e la scoperta di D.T. Avery negli anni 40, riguardante il DNA come la sostanza in cui risiedono tutte le informazioni genetiche.
Cosa sono le Tecnologie del DNA RICOMBINANTE? Complesso insieme di tecniche di manipolazione del DNA che consentono di isolare dei brevi segmenti di tale molecola, per moltiplicarli, studiarne la sequenza nucleotidica, trasferirli nel genoma di altre cellule controllandone l incorporazione e l espressione.
Il clonaggio non è la clonazione Si definisce clonaggio un sistema per ottenere molte copie di un tratto di DNA inserendolo in un ospite mediante l uso di vettori molecolari. La clonazione in biologia è invece la riproduzione agamica, naturale o artificiale, di individui o cellule con identico patrimonio genetico (cloni). Esempi di processi clonogenici naturali sono la scissione binaria dei batteri o la mitosi delle cellule eucariotiche.
Le tappe del clonaggio Il clonaggio richiede: l isolamento di una particolare sequenza di DNA (non necessariamente codificante per una proteina) dall insieme di tutte le sequenze del DNA di un organismo (genoma); l inserimento della sequenza di DNA in una cellula ospite, spesso diversa da quella da cui origina il DNA da clonare, tramite l utilizzo di molecole di DNA trasportatrici (vettori molecolari); la moltiplicazione delle cellule riceventi; la selezione delle cellule che effettivamente contengono la sequenza del DNA di interesse.
L isolamento del DNA di partenza Il DNA da clonare può essere un segmento del genoma oppure una copia a DNA di un RNA messaggero (mrna). Nel primo caso è possibile isolare anche sequenze non codificanti, come i promotori o gli introni presenti all interno dei geni eucariotici. Nel secondo invece si può prelevare solo la sequenza espressa di un gene, allo scopo di fare esprimere la proteina corrispondente in un organismo diverso da quello originario: è questo l approccio più usato in biotecnologia.
Funzione dei geni Un gene-un carattere Gregor Mendel; seconda metà dell 800 Un gene-un enzima Un gene-una proteina Archibald Garrod; prima metà del 900 George Beadle ed Edward Tatum Un gene-un polipeptide Un gene-un RNA Il gene è l unità di trascrizione, costituita da un segmento di DNA che codifica per una molecola di RNA e dalle sequenze necessarie alla sua trascrizione
L unità di trascrizione Il promotore è la regione del DNA che segnala: qual è la direzione della trascrizione qual è il sito di inizio della trascrizione quale dei due filamenti di DNA deve essere trascritto
In un tipico gene eucariotico, subito prima della regione codificante troviamo un al quale si lega l RNA polimerasi per dare inizio al processo di trascrizione. Tuttavia l RNA polimerasi eucariotica, a differenza di quella procariotica, non riconosce direttamente la sequenza del promotore, ma ha bisogno di altre molecole. All estremità opposta del gene, dopo la sequenza codificante, si trova una sequenza di DNA chiamata terminatore, che segnala il punto di arresto della trascrizione. Il terminatore non deve essere confuso con il codone di stop (che fa parte del gene): la sequenza del terminatore infatti si trova fuori dal tratto codificante, di regola dopo il codone di stop, e segnala la fine della trascrizione a opera dell RNA polimerasi.
Gli studi sul genoma eucariotico hanno portato ad una sorprendente scoperta: molti geni che codificano proteine contengono anche sequenze di basi non codificanti, dette introni, intercalate ai tratti codificanti, definiti esoni.i geni formati da esoni e introni sono chiamati geni interrotti; ognuno di essi inizia e finisce con un esone.
Cosa sono gli introni? Gli introni sono sequenze di un gene che vengono trascritte in RNA, ma non vengono tradotte in proteine Caratteristiche degli introni Variano per numero (nell uomo da 0 a 60) Variano per lunghezza (da 200 fino a 50000 nucleotidi) Sono in genere più lunghi degli esoni Negli eucarioti superiori il numero medio di introni per gene aumenta all aumentare della complessità degli organismi Sono presenti quasi esclusivamente nei geni eucariotici
Nei geni degli eucarioti le sequenze codificanti per proteine (esoni) sono interrotte da sequenze non codificanti (introni). e ricucitura Il trascritto primario, prima di abbandonare il nucleo, viene sottoposto ad un processo di taglio (splicing): gli introni vengono eliminati e gli esoni riuniti uno all altro. La molecola di mrna maturo che esce dal nucleo sarà costituita da una sequenza codificante continua
Le biblioteche di cdna La copia a DNA di un mrna viene detta DNA complementare o cdna. L insieme dei cdna clonati viene detto biblioteca di cdna. 16
Le biblioteche di cdna: isolamento degli mrna cellulari (I) Per isolare gli mrna di una cellula a partire dalla miscela di tutto l RNA, si sfrutta la loro caratteristica di avere una sequenza all estremità 3, costituita da circa 200 residui di adenosina (coda poli-a).
Le biblioteche di cdna: isolamento degli mrna cellulari (II) La miscela degli RNA cellulari viene messa in contatto con una resina a cui sono attaccati dei corti oligonucleotidi costituiti da timidine (poli-t).
Le biblioteche di cdna: isolamento degli mrna cellulari (III) Gli mrna vengono successivamente staccati dalla resina e raccolti in forma pura.
Le biblioteche di cdna: conversione degli mrna in cdna (I) Per preparare i cdna a partire da mrna, si utilizza un enzima virale: la trascrittasi inversa (RT). Questa polimerasi, la cui scoperta fruttò il premio Nobel per la Medicina nel 1975 a David Baltimore e Howard Temin, è l unico enzima esistente in grado di generare una copia di DNA a partire da una stampo di RNA e viene usato dai retrovirus come HIV per la replicazione del loro genoma.
Le biblioteche di cdna: conversione degli mrna in cdna (II) La trascrittasi inversa copia il singolo filamento dell mrna, generando un doppio filamento ibrido DNA/RNA.
Le biblioteche di cdna: conversione degli mrna in cdna (III) La trascrittasi inversa è in grado di degradare il filamento a RNA, esponendo la singola elica di DNA. https://www.youtube.com/watch?v=lvafbeb-el8
Le biblioteche di cdna: conversione degli mrna in cdna (IV) La trascrittasi inversa sintetizza il filamento complementare di DNA, generando un cdna a doppia elica.
Le biblioteche di cdna: i vettori di clonaggio (I) Per inserire i cdna all interno di una cellula ospite si utilizzano molecole di DNA circolare: i vettori plasmidici. Si tratta di elementi genetici naturali dei batteri (plasmidi) modificati dall uomo.
Le biblioteche di cdna: i vettori di clonaggio (II) I vettori plasmidici contengono un origine di replicazione per potersi duplicare insieme al DNA cellulare, un gene marcatore (resistenza a un antibiotico) per poter selezionare le cellule che li contengono e siti di taglio unici per enzimi di restrizione.
Le biblioteche di cdna: gli enzimi di restrizione (I) Per preparare il cdna e il vettore per il clonaggio è necessario utilizzare le endonucleasi di restrizione, enzimi batterici in grado di legarsi a specifiche sequenze del DNA (generalmente di 4 6 paia di basi) e tagliare la doppia elica all interno della sequenza bersaglio.
Le biblioteche di cdna: gli enzimi di restrizione (II) Il taglio genera estremità che possono essere piatte oppure sporgenti, nel qual caso si definiscono coesive (sticky ends). 27
Le biblioteche di cdna: le ligasi Per inserire il cdna all interno di un vettore è necessario utilizzare le DNA ligasi, enzimi presenti in tutte le cellule e in grado di ripristinare il legame fosfodiesterico tra due nucleotidi adiacenti in una catena di DNA. In questo modo è possibile saldare insieme due frammenti di DNA distinti.
Le biblioteche di cdna: il clonaggio e la selezione (I) I cdna e il vettore di clonaggio vengono digeriti con la stessa endonucleasi di restrizione. In questo modo le estremità del vettore e quelle dei cdna saranno complementari.
Le biblioteche di cdna: il clonaggio e la selezione (II) Tramite la DNA ligasi i cdna vengono saldati all interno del vettore pasmidico.
La reazione della DNA ligasi (I) La reazione della DNA ligasi ha tre passaggi. Nel primo si ha il legame tra un gruppo NH della lisina del sito attivo dell enzima e un AMP (donato dall ATP negli eucarioti o dal NAD + nei procarioti) con formazione dell intermedio covalente enzima adenilato.
La reazione della DNA ligasi (II) L AMP quindi si trasferisce dalla lisina dell enzima al 5 fosfato del nucleotide da saldare.
La reazione della DNA ligasi (III) Questo permette l attacco nucleofilo da parte dell estremità 3 OH del nucleotide adiacente al 5 fosfato legato all AMP, che risulta nella formazione del nuovo legame fosfodiesterico tra i due nucleotidi con rilascio di AMP.
Le biblioteche di cdna: il clonaggio e la selezione (III) I DNA ricombinanti (cioè vettori contenenti i cdna) vengono inseriti in cellule batteriche.
Le biblioteche di cdna: il clonaggio e la selezione (IV) Le cellule geneticamente modificate (ovvero contenenti il vettore) acquisiranno la resistenza all antibiotico portata dal vettore stesso, quindi le cellule sopravvissute conterranno tutti i cdna. Ogni singola cellula originerà un clone di un singolo cdna. L insieme dei cloni sarà la biblioteca a DNA. 35
Clonaggio diretto di una sequenza genica: la PCR (IV) Utilizzando inneschi che contengono le sequenze di taglio per endonucleasi di restrizione, le copie del cdna di interesse generate per PCR possono essere direttamente inserite nei vettori di clonaggio con la DNA ligasi.