Interzioni farmaco-recettore Prof. Rosaria Meli Farmacologia generale
Concetto di recettore La maggior parte dei farmaci interagisce con macromolecole specifiche situate sulla superficie o all interno della cellula mediante precise interazioni fisiche e stereochimiche, mediante specifici gruppi chimici del farmaco. Questi siti di legame sono chiamati recettori. un recettore lega fisiologicamente più mediatori endogeni, da questo legame scaturisce una trasformazione conformazionale ed un signalling intracellulare capace di innescare, scaturire ma anche inibire una risposta biologica
Concetto di recettore specifico per i farmaci Un farmaco non crea un effetto ma modula una funzione presistente alterando lo stato funzionale del recettore Spesso l identificazione di un recettore per sostanze endogene (attraverso l uso di sostanze esogene e farmaci) ha preceduto la scoperta del ligando naturale endogeno (recettore degli oppiodi) REVERSE PHARMACOLOGY Es. albumina come proteina diversa dal recettore
Teoria dei recettori Il concetto di farmaci che agiscono sui recettori è generalmente accreditato agli studi di John Langley nel 1878. Langley, mentre studiava gli effetti antagonisti dell'atropina contro la salivazione indotta dalla pilocarpina, scrisse: "c'è qualche sostanza o alcune sostanze nelle terminazioni nervose o nelle ghiandole cellulari in grado di formare composti con l atropina e con la pilocarpina". Successivamente fece riferimento a questo fattore/i come una "sostanza ricettiva". Nonostante questa osservazione, la parola "recettore" è stato introdotto nella letteratura medica, solo alla fine del secolo da Paul Ehrlich
Paul Ehrlich (1854-1915) premio Nobel 1908 Nei suoi studi è stato guidato dall idea, sviluppata già nella sua tesi di laurea sulla colorazione selettiva, che «corpora non agunt nisi fixata». Vale a dire che le sostanze chimiche agiscono sui materiali organici, come le cellule o i prodotti biochimici dell attività fisiologica legandosi a questi. In virtù di tali possibili interazioni chimiche le cellule possono essere colorate o avvelenate, e si possono anche predisporre strategie per colpire o neutralizzare in modo mirato gli agenti patogeni e i loro prodotti tossici. Ehrlich fondò la sua ipotesi sulla sua esperienza nel trattamento delle malattie infettive con farmaci derivati dall'industria tedesca dei coloranti. Egli postulò che un farmaco potesse avere un effetto terapeutico solo se dotato della "giusta sorta di affinità. Negli anni 70 sono ancora un entità astratta (studi di binding)
Ach L Ach è il neurotrasmettitore rilasciato dai terminali presinaptici nei gangli autonomi sia simpatici che parasimpatici, di tutti i recettori postgangliari parasimpatici e dai terminali nervosi pregiunzionali nell organo effettore Recettore nicotinico e muscarinico
L'esperimento di Otto Loewi: Nel 1920, il neurochirurgo Otto Loewi eseguì un esperimento oggi ritenuto un classico i neurotrasmettitori *. Loewi sapeva che la stimolazione del nervo vago causava un rallentamento cardiaco. La questione era se questo fosse il diretto risultato di uno stimolo elettrico o l'indiretto risultato di un effetto chimico. L'ingenoso esperimento di Loewi (che a suo dire gli venne in sogno) comprendeva il cuore di una rana inserito in un recipiente con soluzione fisiologica ossigenata. Il recipiente era collegato ad un secondo recipiente contenente un altro cuore anch'esso immerso in soluzione fisiologica. * tratto da: 1997 da Mark E. McCourt - www.psych.ndsu.nodak.edu/mccourt/psy486/biochemistry Loewi stimolò il nervo vago del primo cuore per produrvi un rallentamento del battito e potè osservare che anche il secondo cuore rallentava dopo un certo ritardo. Loewi formulò l'ipotesi che la stimolazione elettrica che aveva rallentato il primo cuore rilasciasse nella soluzione una sostanza chimica che fluendo nel secondo recipiente rallentava anche il secondo cuore [il ritardo nella comparsa dell'effetto esclude una propagazione di tipo elettrico]. Egli chiamò questa sostanza "vagusstoff". Oggi sappiamo che questa sostanza chimica è l acetilcolina. Il lavoro pioneristico di Loewi segnò la nascita della neurofarmacologia.
Bersagli dei farmaci Recettori classici di sostanze endogene Enzimi ( es. DHFR, Ach-esterasi) (aspirina, antibiotici come la rifampicina) Canali ionici (del Na+) (calcio antagonisti, anestetici locali) Acidi nucleici (RNA o DNA) (antibiotici, antracicline, alchilanti) Proteine strutturali (es. tubulina) (alcaloidi della vinca, taxani) Proteine di membrana Glicoproteine, lipoproteine
Caratteristiche dell azione farmacologica Qualunque sia il bersaglio la variazione funzionale indotta dal farmaco può essere di due tipi: stimolante o inibitoria (aumento o riduzione dell attività funzionale del recettore) Si dice monofasica se l azione è indirizzata in un solo senso (inibitoria o stimolante) Si dice bifasica se prima è di un tipo e poi dell altro (generalmente l effetto stimolante precede quello inibente) in maniera dipendente dall aumento della dose Può essere inoltre dose-dipendente o rispondere alla legge del tutto o nulla
Non tutti i farmaci interagiscono con un recettore Alcuni farmaci agiscono con un meccanismo più semplice fisico o chimico Es. sostanze osmoticamente attive come glicerolo (stimola la diuresi) o mannitolo (per ridurre l edema cerebrale) H 2 0 2 Anticidi (reazione di neutralizzazione) Lassativi osmotici (azione lassativa) Bifosfonati (legano i sali di calcio nella matrice ossea e promuovono l apoptosi degli osteoclasti) usati per osteoporosi EDTA (chela gli ioni bivalenti) nell avvelenamento da Pb ++
Definizioni La sostanza che attiva il recettore viene, in genere, chiamata ligando Un agonista è un ligando fisiologico o un farmaco che legandosi ad un recettore ne modifica la percentuale presente in uno stato attivo generando una risposta biologica Generalmente in assenza del ligando il recettore è funzionalmente silente (eccezione recettore delle BZP)
Modello chiave-serratura e riconoscimento ligando-recettore chiave serratura Sito recettoriale agonista naturale affinità affinità intrinseca Chiave modificata agonista modificato Risposta biologica Risposta biologica Chiave falsa antagonista Blocco della risposta biologica Distinzione tra legame ed attivazione
Specificità del legame F-R E molto importante la complementarietà tra F e R (chiaveserratura) Un farmaco dovrebbe agire selettivamente su particolari cellule e tessuti come il ligando endogeno Es. sartani e angiotensina II Il riconoscimento di superfici molecolari diversi dal suo recettore principale può portare ad effetti secondari Inoltre minore è la potenza di un farmaco maggiore è la dose che bisogna somministrare per ottenere l effetto ed è più probabile l interazione del farmaco con altri siti diversi da quello principale (comparsa di effetti collaterali es. secchezza delle fauci degli antidepressivi triciclici)
Specificità del legame F-R La specificità su un tipo di recettore dipende anche dalla concentrazione, all aumentare della concentrazione di farmaco diminuisce la specificità (es. agonisti beta-2). Specificità complementare tra ligandi e siti recettoriali (un recettore può riconoscere solo un determinato steroisomero)
Reversibilità del legame Il legame F-R deve essere labile, cioè limitato nel tempo. Si ha quindi un equilibrio dinamico fra la forma libera e la forma legata del recettore. Avvenuto il legame, il farmaco esplica la sua azione e poi si stacca dal recettore (reversibilità del legame con durata temporale diversa) Questo legame può essere anche irreversibile (Es. legame covalente degli anticolinesterasici)
Forze di legame Interazioni Energia (kcal / mol) Legame covalente ~ 100 Ionico 10 20 Ione dipolo 1 7 Dipolo dipolo 1 7 Legami idrogeno 5) 1 7 (di solito 3 Legami idrofobici metilene ~ 0.7 per Van der Waals ~ 0.5 per gruppo
Teoria dell interazione F-R La combinazione o il legame al recettore causa diversi eventi che conducono alla risposta cellulare. La risposta ad un farmaco è graduale o dosedipendente. L interazione F-R segue semplici relazioni dell azione di massa, es. solo una molecola di farmaco occupa un sito recettoriale e tale legame è di tipo reversibile, es. 2 molecole di Ach/canale. Per un dato farmaco, l ampiezza della risposta è direttamente proporzionale alla frazione dei siti recettoriali totali occupata dalle molecole di farmaco (teoria occupazionale)
teoria occupazionale L entità dell effetto prodotto da un farmaco che si lega reversibilmente ai suoi recettori, è proporzionale al numero di recettori occupati dal farmaco e l effetto massimo si produce quando tutti i recettori sono stati occupati
Relazione fra concentrazione di farmaco e risposta La relazione tra la dose di farmaco somministrata e la risposta clinica osservata può essere abbastanza complessa. Per contro, in sistemi in vitro accuratamente controllati, la relazione tra la concentrazione di farmaco ed il suo effetto è spesso semplice e può essere descritta con modelli matematici semplici. Nel diagramma a sinistra (Fig. 1), la relazione tra concentrazione di farmaco e risposta, un'iperbole rettangolare, è data da un modello matematico già noto: l'equazione di Michaelis Menten. Il legame del farmaco al corrispondente recettore è caratterizzato da una cinetica di saturazione: la risposta tende ad un plateau via via che i recettori risultano
Il numero delle molecole di farmaco è supposta essere maggiore di quello dei siti recettoriali. Le interazioni farmaco-recettore sono analoghe alle interazioni enzima- substrato, seguendo nella maggior parte gli stessi principi. Infatti queste interazioni possono essere rappresentate da un equazione analoga all equazione di Michaelis Menten per le interazioni enzima-substrato
K1 F + R FR RISPOSTA BIOLOGICA K-1 All equilibrio Velocità di associazione = velocità di dissociazione K1 [F] [R] = K-1 [FR]
K1 [F] [R] = K-1 [FR] K-1 [F] [R] Kd costante di dissociazione K1 [FR] [R] = [R L ] = [R T ]-[FR] Kd = [F]([R T ]-[FR]) = [F][R T ]-[F][FR] [FR] [FR]
Kd = [F][R T ] - [F] [FR] Kd + [F] = [F][R T ] [FR] [FR]= [F][R T ] Kd + [F]
[FR]=B bound [RT]=B max B = [X] Bmax Kd + [X] Isoterma di legame o di Langmuir
Curva logaritmica dose-risposta Vantaggi dell espressione della curva logaritmica La relazione dose-risposta è espressa come una linea retta per un ampio range di dosi di farmaco. ampi range di dosi possono essere riportate su un singolo grafico permettendo una più immediata comparazione di differenti farmaci. Utilizzo di curve logartmiche dose-effetto per comparare farmaci diversi che producono la stessa risposta
Es studio dell aumento della pressione arteriosa indotta dall adrenalina (Multifattoriale effetto sulla gittata, sulla costrizione vasale, adattamento dell organismo) studio dell effetto dell Ach sui vasi Curva logaritmica dose-effetto Queste curve permettono di determinare la risposta massima che il farmaco può indurre = E max e la concentrazione o la dose necessaria per raggiungere il 50% della risposta massima (EC 50 o ED 50 ). Questi sono parametri utili per paragonare la potenza di due farmaci Differenza tra gli studi in vitro su tessuti con elevata [R] e le modificazioni che si ottengono in vivo
Tipi di Recettori In base alla localizzazione cellulare i recettori si dividono in due classi Recettori di membrana che trasducono il segnale di mediatori idrofilici che non superano la membrana generando modificazioni recettoriali o attraverso secondi messaggeri es.r. accopiati a proteine G (o 7M) R. per la matrice extracellulare R. canale R. dotati di attività enzimatica (tirosin chinasi o guanilato ciclasi intrinseca)
Recettori intracellulari (che trasducono il segnale di ormoni o mediatori lipofili che superano la membrana interagendo con tratti specifici del genoma, inducendo modificazioni dell espressione genica e quindi della sintesi proteica e/o della composizione proteica della cellula)
Classificazione in base al ligando endogeno R. colinergici (sottotipi muscarinici, sottotipi nicotinici) R. adrenergico (alfa e beta) R. serotoninergici (5HT 1, 5HT 2,5HT 3 e altri sottotipi) R. istaminergici (H1, H2, H3) Es. recettore della dopamina (D1,D2,D3,D4) differenti per sequenza aminoacidica e meccanismi di trasduzione del segnale
Recettori ionotropici (legati a canali ionici) Ci sono due tipi di classi di canali ionici: voltaggio- o ligando- dipendenti. Canali ionici voltaggio-dipendenti sono attivati da alterazioni del voltaggio di membrana per passaggio di ioni (cationi o anioni). Canali ionici ligando dipendenti sono attivati dopo il legame di specifici ligandi o farmaci. Molti neurotrasmettitori e farmaci attivano canali ionici di membrana, ad es. i diversi tipi di recettori del glutammato, la stessa Ach (recettore nicotinico)
I recettori canali sono dei complessi macroproteici transmembranari che formano un canale che viene aperto dal legame con il neurotrasmettitore o con farmaci agonisti. M L apertura di questi canali produce un entrata veloce di ioni con modificazioni delle concentrazioni ioniche e del potenziale elettrico di membrana Sono costituiti da 4 o 5 subunità che delimitano il canale idrofilico in cui passano gli ioni Ogni subunità è formata da una catena polipeptidica che attraversa almeno quattro volte la membrana plasmatica in corrispondenza delle regioni ricche di aa idrofobici (regione M)
Il recettore nicotinico Il recettore nicotinico è composto da 5 subunità (2α, β, γ, δ) che insieme formano un pentamero e delimitano il canale ionico che attraversa la membrana cellulare ed è permeabile agli ioni Na + Ogni subunità è costituita da una catena peptidica che presenta al terminale amminico, una porzione extracellulare. Nelle subunità α risiede il sito di legame per l Ach (X2) Nelle porzione extracellulare il canale è slargato poi vi è uno strozzamento di dimensioni tali da selezionare gli ioni per i quali il canale è permeabile
Il canale generalmente è chiuso e quindi non vi è flusso ionico, quando l Ach si lega alle subunità α1 si ha una modificazione conformazionale del recettore con conseguente apertura del canale Quasi tutte le cellule esprimono i recettori canale, tuttavia nelle cellule nervose essi sono presenti in maggiore quantità e varietà. Il recettore nicotinico dell Ach nei mammiferi è espresso nella giunzione neuro-muscolare ad alta densità a livello della membrana post-sinaptica Nella porzione citplasmatica dove il recettore si riallarga vi sono i siti di legame per li ligandi
L alterazione del posizionamento o del numero (come nel caso della miastenia grave) induce insufficienza della trasmissione nervosa. I recettori sono mantenuti nella posizione strategica nella membrana cellulare attraverso un legame con le strutture del citoscheletro
Oltre al nicotinico.. Recettore GABA A, importante nel controllo dell eccitabilità neuronale bersaglio delle BZ Recettore 5HT 3 localizzato sui neuroni sensoriali periferici nocicettivi, sui neuroni enterici e sul SNC dove media effetti eccitatori. E inibito da antagonisti specifici come ondansetron e tropisetron.
Particolarità del S.N.A. è il controllo delle funzioni viscerali (circolazione, digestione, secrezione), SNA Altra particolarità nelle sue componenti simpatica e parasimpatica, è che, mentre nel sistema nervoso somatico c è solo un neurone tra il sistema nervoso centrale e l organo bersaglio (motoneurone), in questo ne esistono due, uno pre ed uno post gangliare
Il simpatico è alla base del cosiddetto comportamento di LOTTA e/o FUGA. Il parasimpatico controlla il comportamento di RIPOSO e ASSIMILAZIONE
Recettori legati a proteine-g
Recettori metabotropici La cui interazione con il ligando determina l aumento di secondi messaggeri intracellulari che provocano un effetto biologico (in genere lento) Es. recettori accoppiati alle proteine G
Recettori legati a proteine-g Recettori legati a proteine-g costituiscono la più ampia classe dei recettori di membrana. La struttura proteica di questi recettori costituiti da una singola catena polipeptidica di 400-500 aa, comprende un dominio comune transmembranario con sette domini. In generale, I recettori legati alle proteine-g amplificano enormemente il segnale biologico in quanto attivano le proteine-g, che a loro volta possono attivare canali ionici o, più comunemente, altri enzimi (es. l adenilato ciclasi), che porta alla stimolazione di ancora altri enzimi (es. la protein- chinasi A). Tale sistema di amplificazione, può spiegare perchè effetti farmacologici massimali sono spesso osservati quando sono attivati soltanto anche piccole porzioni dei recettori.
Le G-protein sono una famiglia di molecole proteiche eterotrimeriche (subunità α, β, γ ) capaci di legare il GTP e con attività GTPasica intrinseca. Il legame del F al recettore stimola la formazione del complesso recettore proteina-g che lega normalmente il GDP. Il recettore stimola lo scambio GDP-GTP (la proteina G incorpora un GTP presente nel citosol) e la subunità α (α-gtp) si dissocia da β e γ e dal recettore, per legarsi al sistema effettore (effettori enzimatici es adenilato ciclasi) modulandone l attività (+ o a secondo del tipo di proteina G) L α-gtp idrolizza il GTP a GDP (grazie all attività GTPasica intrinseca) perde affinità per il sistema effettore e si riassocia alle subunità β e γ
Sono effettori enzimatici delle proteine G l adenilato ciclasi o le fosfolipasi La loro attivazione produce la sintesi di II messaggeri come l camp (x adenilato ciclasi) o IP3 e DAG (x PLC) Le proteine G diffondono liberamente sul piano della membrana infatti una stessa proteina può interagire con molti recettori ed effettori L attivazione di questi recettori può avere una durata anche di minuti, dipende non solo dalla durata del legame ligando-recettore, ma anche dall efficienza dei meccanismi di trasduzione e dalle concentrazioni di II messaggero
Le proteine - G Non sono tutte uguali, infatti le subunità α presentano notevoli variazioni. Esistono infatti diversi tipi, le principali sono 1. G s (stimola l adenilato ed attiva i canali del Ca ++, l camp fosforila proteine ed enzimi attraverso PKs che a loro volta fosforilano altri enzimi utilizzando ATP) 2. G i (inibisce l adenilato ed attiva i canali del K + es. apertura dei canali del K + nel muscolo cardiaco a seguito del legame dell Ach con i recettori muscarinici) 3. G q attiva la fosfolipasi (PLC con produzione di DAG e IP3. IP3 agisce sul suo specifico recettore intracellulare. Il DAG attiva la PKC di membrana, un enzima fosforilante di più di 50 tipi di proteine) 4. G o inibisce le correnti di Ca ++
RECETTORI E Neurotrasmettitori: G-PROTEIN EFFETTO Catecolamine R adrenergico α1 Gq fosfolipasi C R adrenergico α2 Gi adenilato ciclasi R adrenergico β1 Gs adenilato ciclasi R adrenergico β2, β3 Gs adenilato ciclasi Acetilcolina Muscarinico M1,M3,M5 Gq fosfolipasi C Muscarinico M2,M4 Gi adenilato ciclasi
Sistema dell adenilato ciclasi Enzima ubiquitario che converte ATP in camp (II messaggero) Il II messaggero regola l attività di un gruppo di protein chinasi camp-dipendenti o protein chinasi A. Questa è formata da due subunità distinte una regolatoria ed una catalitica. A basse concentrazioni di camp le due subunità formano un complesso inattivo, all aumentare dell c-amp, questo si lega alla subunità regolatoria causando il distacco di quella catalitica. La subunità catalitica è così libera di fosforilare (in serina o in treonina) altre proteine specifiche usando ATP come fonte di fosfato e regolandone l attività L attivazione di Gs rappresenta il meccanismo fondamentale attraverso il quale viene attivata l adenilato ciclasi
Esempio di recettore accoppiato alle proteine Gs (1) Attivazione del recettore beta-adrenergico (β3) 1. Aumento del camp 2. Attivazione delle protein chinasi 3. Attivazione della lipasi, della glicogenosintetasi, della fosforilasi chinasi Il risultato è che l energia conservata sotto forma di glicogeno e grasso viene utilizzata per la contrazione muscolare
Esempio di recettore accoppiato alle proteine Gs (2) Attivazione del recettore beta-adrenergico (β1) 1. Aumento del camp 2. Legame diretto ai canali cationici (azione non mediata dalle protein chinasi) 3. Aumento dell attività dei canali del Ca ++ delle cellule muscolari cardiache Il risultato è che la fosforilazione dei canali del Ca ++ permette l entrata dello ione all interno della cellula aumentando la forza di contrazione del cuore
Recettore accoppiato alle proteine Gq Tramite la Gq si ha attivazione di una fosfodiesterasi (la fosfolipasi C) La fosfolipasi C può essere attivata da altri recettori non accoppiati alla G- protein ma anche dai recettori della tirosin chinasi 1. Attivazione della fosfolipasi C, idrolisi si uno specifico fosfolipide di membrana (fosfatidil inositolo 2 fosfato PIP 2 ) 2. PIP 2 convertito in due II messaggeri il DAG (rimane a livello della membrana dove attiva la protein chinasi che fosforila in serina e in treonina numerosi substrati) e IP 3 (nel citoplasma interagisce con un recettore canale situato sulla membrana del RE e mobilita il Ca++ da depositi intracellulari specifici, la sua concentrazione molare passa da 10-7 a 10-6 -10-5 ) 3. l aumento di Ca ++ porta una serie di effetti Il risultato è contrazione della muscolatura liscia (α 1), aumento delle secrezioni delle ghiandole esocrine (M1 e M3), liberazione di ormoni
Il calcio come componente delle trasduzione Il calcio risulta controllare molti processi cellulari Contrazione del muscolo liscio Maggiore velocità di contrazione e rilasciamento dei miociti cardiaci Secrezione di molecole trasmettitrici o secrezioni ghiandolari Rilascio di ormoni Citossicità Attivazione di determinati enzimi La sua mobilitazione è collegata all attività di altri componenti di trasduzione. Il calcio è immagazzinato sulla membrana del reticolo endoplasmatico e viene rilasciato ad es. quando IP3 si lega al recettore specifico dell IP3
Esempio di recettore accoppiato alle proteine Gi Attivazione del recettore muscarinico M 2 cardiaco O Attivazione del recettore α 2 della muscolatura liscia o a livello presinaptico 1. Riduzione del camp 2. Apertura dei canali del K + (azione su M2), l uscita di K + ha un effetto bradichizzante con azione sul pacemaker del cuore In seguito alla formazione dell camp questo viene idrolizzato nelle cellule dalla fosfodiesterasi a 5 -AMP
Area di legame Con la G-protein
Riassumendo: le quattro superfamiglie di recettori Canale attivato dal recettore (neurotrasmettitori es.recettore nicotinico, media azione veloce) Recettori legati a proteina G (neurotrasmettittori ed ormoni ad azione più lenta) Recettori che sono enzimi (con sito di riconoscimento del ligando extracellulare ed uno catalitico intracellulare che possiede azione sia di tirosin chinasi che di guanilil chinasi, es molti fattori di crescita e l insulina) Recettori legati al DNA es ormoni steroidei e tirioideo
Recettori con attività tirosin chinasica Appartengono i recettori per molti fattori di crescita e per molte citochine Recettori ad attività enzimatica hanno soltanto un dominio transmembranario per subunità di proteina, con un sito enzimatico catalitico sul dominio citoplasmatico del recettore. La dimerizzazione di recettori attivati provoca dei cambiamenti conformazionali necessari per l espressione dell attività enzimatica. I siti catalitici sono comunemente delle proteine chinasi che fosforilano residui tirosinici di diversi substrati proteici Possono provocare come effetto la trascrizione genica o proliferazione e differenziazione
Sono abbastanza diversi strutturalmente I recettori tirosin chinasici sono coinvolti nella regolazione della crescita, differenziazione e risposte a stimoli metabolici, includono i recettori per l insulina e i fattori di crescita EGF e PDGF subiscono autofosforilazione
Recettori Intracellulari Sostanze lipofile capaci di attraversare la membrana plasmatica possono attivare recettori intracellulari: steroidi sessuali, mineralocorticoidi, glucocorticoidi e ormoni tiroidei attivano specifici recettori intracellulari
Ormoni steroidei
Steroidi Nucleari: E2, ORG, Citoplasmatici: Cortisolo aldosterone ormoni tiroidei, vitamina D, retinoidi
Recettore dei glucocorticoidi
R e c e t t o r e e s t r o g e n o