Innovazione Leggere il Dna Rosario Iacono Dal metodo Sanger al Next generation sequencing: il genoma a disposizione della ricerca scientifica. Nel 1977 fu pubblicato il metodo per il sequenziamento delle molecole di Dna che ha segnato per sempre la storia della ricerca biologica. L avventura iniziò più di un quarto di secolo prima, quando gli studi di Sanger sulla struttura dell insulina (che gli avrebbero valso il Nobel nel 1959) dimostrarono l importanza dell ordine (sequenza) nel quale sono disposti gli amminoacidi, i mattoni molecolari di cui sono composte le proteine. Da lì a poco seguirono le scoperte sulla sequenza di un altra classe di molecole, gli acidi nucleici (Dna, Rna). Una volta compreso che esisteva una relazione che legava codice (Dna), messaggio (mrna) ed esecuzione del messaggio (trna, proteine) fu chiaro che la nuova sfida era imparare quella nuova lingua per riuscire a leggere il codice degli acidi nucleici, composto di una sequenza più o meno lunga di soli 4 nucleotidi (i mattoni di cui è fatto il Dna). Il metodo Sanger Già nel 1975 Sanger e Coulson, allora ricercatori a Cambridge, avevano proposto il loro innovativo metodo di sequenziamento noto come plus and minus [1] che rappresentò un passo fondamentale verso i successivi metodi di sequenziamento. Il metodo plus and minus prevedeva due reazioni successive mediate da due enzimi: la Dna polimerasi I e dalla T4 polimerasi. Nella prima reazione la Dna polimerasi neosintetizzava Dna partendo dallo stampo, ma in maniera lenta e asincrona producendo una popolazione di molecole di Dna composta da tutti i possibili prodotti aventi un estensione da uno fino ad alcune centinaia di paia di basi. Quindi, il prodotto di amplificazione della prima fase veniva diviso in aliquote e sottoposto a una seconda reazione della polimerasi in presenza di nucleotidi detti terminatori che, se aggiunti, determinano l arresto dell estensione della catena. In particolare, il metodo prevedeva l uso di due sistemi di reazione differenti. Il sistema di reazione minus nel quale la reazione della polimerasi avveniva in assenza di uno dei 4 nucleotidi fosfato e la sintesi di Dna procedeva in maniera accurata fino al punto in cui doveva essere incorporato il nucleotide mancante. La miscela random degli oligo-nucleotidi che era ancora legata al Dna stampo veniva re-incubata con la Dna polimerasi I in presenza di 3 dei 4 nucleotidi trifosfato (le quattro aliquote erano poste in 4 miscele differenti per il nucleotide mancante). Nell analizzare i prodotti per elettroforesi su gel di poliacrilammide, l altezza delle bande in ogni miscela forniva la posizione occupata nella sequenza dal nucleotide mancante. Di per sé il sistema minus permetteva già di determinare la sequenza, ma a questo fu affiancato il sistema plus. In questo metodo, la reazione della polimerasi avveniva in una miscela contenente un singolo nucleotide deossiribotrifosfato. La Dna polimerasi usata era la T4 polimerasi, ottenuta da Escherichia coli infettato da fago T4. Questa, dopo aver aggiunto il singolo nucleotide in prima posizione, iniziava, dove necessario, a lavorare da esonucleasi degradando la singola elica del Dna partendo dall estremità 3 e si fermava in corrispondenza del nucleotide trifosfato aggiunto. Ne risultava una miscela di frammenti di diversa lunghezza. Ogni frammento ottenuto nella miscela plus aveva un corrispettivo nel prodotto con miscela minus, più corto di una base. Dal confronto delle corse elettroforetiche dei due frammenti omologhi era possibile determinare l identità e la posizione della base terminatrice. Il metodo plus and minus permetteva di ottenere in modo accurato sequenze di 50 paia di basi di lunghezza, 1
per ogni corsa elettroforetica. Tuttavia, nel caso di lunghe successioni di basi uguali si ottenevano le sequenze iniziali e finali, ma non quelle intermedie. Questo inconveniente del metodo plus and minus fu risolto nel 1977 quando Sanger ne pubblicò una versione migliorata: nel metodo dei dideossi [2], oggi noto come metodo Sanger, la terminazione dell estensione era ottenuta non più con una miscela di nucleotidi naturali, ma con dei dideossinucleotidi, non discriminabili dai nucleotidi naturali da parte della Dna-polimerasi ma che causavano l interruzione della sintesi quando incorporati nella catena. La reazione della polimerasi avveniva in quattro miscele, contenenti come stampo lo stesso Dna da sequenziare, ma aventi ognuna un nucleotide terminatore diverso. Si ottenevano così 4 miscele con prodotti di lunghezza diversa, ma aventi in comune il fatto che l ultimo nucleotide incorporato era quello terminatore della miscela. Analizzati per elettroforesi su gel di poliacrilammide, la lunghezza di questi prodotti corrispondeva alle posizioni in cui la base azotata terminatrice in quella miscela era stata incorporata nella sequenza, l insieme dei dati delle 4 corse forniva la sequenza nucleotidica completa. La tecnica permetteva di avere una lunghezza di lettura affidabile per molecole di Dna lunghe fino a 400 paia di basi. Il passo successivo avvenne nel 1986, quando il laboratorio di Leroy Hood a Caltech (Usa), in collaborazione con Applied biosystems (Abi), riportò per la prima volta la possibilità di automatizzare il sequenziamento tramite dispositivi automatici che usavano nucleotidi terminatori marcati con fluorofori di colori diversi e in cui la corsa elettroforetica avveniva su gel di poliacrilammide in colonna. I prodotti all uscita dalla colonna erano analizzati con un foto-sensore elettronico collegato a un computer. Per oltre 35 anni, il metodo Sanger automatizzato è stato il più affidabile e universalmente utilizzato per il sequenziamento di sequenze più o meno lunghe fino alla recente ricostruzione di interi genomi (tra cui quello umano). Next generation sequencing In biologia non esistono traguardi ma solo nuove partenze e ogni risultato è il punto di partenza per una nuova sfida. Così, ottenuta la sequenza completa del genoma di alcuni individui di una specie nacque l idea di ottenere la sequenza di più genomi da più individui possibile. Questo portò all esigenza di avere nuovi metodi di sequenziamento in grado di produrre un numero maggiore di sequenze velocemente e in modo accurato e alla messa a punto di quelli che sono oggi i metodi di sequenziamento di nuova generazione Next generation sequencing (Ngs) o ad alta capacità (High troughput). Caratteristica comune a tutte le Ngs è il fatto che il Dna da sequenziare è immobilizzato su una superficie che consente di portare a termine miliardi di reazioni di sequenziamento contemporaneamente [3, 4, 5]. Si tratta di tecniche sviluppate combinando in maniera innovativa metodologie già note di preparazione del Dna da sequenziare, sequenziamento, acquisizione dei dati e assemblaggio delle sequenze ottenute, al fine di ottenere enormi quantità di dati (miliardi di sequenze per corsa) di ottima qualità e a basso costo, aprendo nuove e inaspettate possibilità alla ricerca. Le tecniche di preparazione del Dna da sequenziare utilizzate nelle Ngs possono avere il Dna amplificato tramite clonaggio in sistemi batterici e amplificazione. La tecnica della Pcr a emulsione (empcr) ha il vantaggio di eliminare la perdita di parti di sequenza, un problema tipico dei metodi di amplificazione in sistemi batterici. I frammenti da sequenziare sono legati ad adattatori universali e catturati su sfere di gel in condizioni che favoriscono il legame di una singola molecola per sfera. L amplificazione su base solida, invece, è usata per produrre frammenti distribuiti casualmente su una superficie vetrosa. La singola molecola di Dna, invece, è una tecnica più diretta che richiede una minore quantità di Dna di partenza (<1µg). Evitare l amplificazione significa ridurre il rischio di mutazioni nella sequenza Dna. In questo caso, le molecole sono immobilizzate seguendo tre differenti approcci. Nel primo le molecole singole di primer sono legate in maniera covalente a un supporto solido. Nel secondo, al Dna da amplificare tagliato a pezzi, sono aggiunti adattatori che gli permettono di legarsi a primer generici. Le molecole singole di Dna da sequenziare sono legate in maniera covalente a un supporto solido tramite estensione di molecole di Dna da sequenziare a singola elica. Quindi, un primer comune è legato a tutte le molecole da sequenziare. In questi primi due casi, la Dna polimerasi può legarsi alle molecole di Dna immobilizzate sul supporto e iniziare la reazione di Ngs. Il terzo, infine, prevede che le molecole singole di Dna polimerasi sono attaccate al supporto solido e a esse si 2
lega una molecola di Dna da sequenziare già unita ai primer. Preparato il Dna, si passa al sequenziamento vero e proprio e all acquisizione della sequenza. Esiste una differenza sostanziale nel caso si tratti di una sequenza amplificata per clonaggio, ovvero di una singola molecola di Dna, in quanto il Dna ottenuto con questa tecnica, risulta composto da una popolazione di molecole da sequenziare identiche, ognuna delle quali subisce la reazione di sequenziamento. In fase di acquisizione del segnale ciò che si osserva è una sequenza consenso a seconda dei nucleotidi o delle sonde aggiunte a ogni ciclo. Questo pone una forte domanda di efficienza nei processi di aggiunta dei nucleotidi, un estensione incompleta della catena porta al fenomeno di Lagging-strand dephasing per cui i due primer lavorano in maniera differente sulle molecole creando errori di lettura. Nel caso di singole molecole, invece, il Lagging-strand dephasing non è un problema: è minore l esigenza di efficienza di estensione a ogni ciclo. Tuttavia l aggiunta contemporanea di più nucleotidi o sonde a ogni ciclo può portare a errori per effetto dell annullamento del segnale tra molecole di fluorofori. Tra le techiche di sequenziamento oggi in commercio si annovera Cyclic reversible termination (Crt), usato dal ciclo a quattro colori di Illumina/Solexa e dal ciclo a un colore di Helicos bio sciences. Questo è caratterizzato dalla terminazione ciclica dell estensione con il ripetersi di tre fasi in cui la Dna polimerasi si lega al Dna da sequenziare già munito di primer e aggiunge o incorpora un singolo nucleotide modificato fluorescente complementare a quello presente nel Dna stampo da sequenziare. L interruzione reversibile dell estensione dopo questa aggiunta è il passaggio chiave di metodi Crt. I rimanenti nucleotidi, non incorporati, sono allontanati. Quindi si acquisisce il segnale al fine di determinare l identità del nucleotide incorporato e infine, il lavaggio rimuove il gruppo del nucleotide che ha interrotto la sintesi. Un ulteriore lavaggio è effettuato prima di riprendere il ciclo. Il sequenziamento per ligazione Sequencing by ligation (Sbl) è un metodo ciclico che si differenzia dal Crt perché utilizza una Dna-ligasi al posto della Dnapolimerasi e delle sonde mono o bi-nucleotidiche colorate al posto dei singoli nucleotidi colorati. Nella sua forma più semplice, una sonda marcata per fluorescenza si lega a una porzione di Dna adiacente al primer sul Dna da sequenziare. Si aggiunge la Dna-ligasi e successivamente le sonde non ibridizzate sono allontanate dai lavaggi. L emissione di fluorescenza permette di acquisire l identità della sonda legata. Quindi, il ciclo riprende. Partendo da questo metodo, Life/Apg ha messo in commercio la sua piattaforma basata sul sequenziamento Sbl chiamata Oligonucleotide ligation detection (Solid). Il metodo lavora su Dna amplificato per empcr e usa sonde binucleotidiche. La piattaforma Solid, grazie al metodo di acquisizione del colore detto Single nucleotide variation (Snv), è caratterizzata da una maggiore accuratezza del sequenziamento. Il sequenziamento per addizione di singoli nuecleotidi (pyrosequencing) è un metodo per bioluminescenza non elettroforetico che misura il rilascio di pirofosfato inorganico usato per marcare le sonde nucleotidiche, convertendolo in una quantità proporzionale di luce tramite una serie di reazioni enzimatiche. Il metodo di pyrosequencing agisce sull attività della Dna-polimerasi tramite l aggiunta di un singolo dntp in quantità limitata. Dopo l aggiunta di un singolo nucleotide complementare, la Dna polimerasi estende il primer di una base e si ferma. La sintesi di Dna è ripresa solo in seguito all aggiunta del successivo dntp complementare che causa il rilascio del pirofosfato e l emissione di luce. L ordine e l intensità dei picchi di luce sono registrati come flowgrams che rivelano la sequenza del Dna. La piattaforma commerciale che utilizza il pyrosequencing è commercializzata da Roche/454 e lavora su Dna amplificato per em-pcr. Il sequenziamento in tempo reale (Real-time sequencing) è un metodo che arriverà presto in commercio grazie alla Pacific biosciences. Questo metodo di sequenziamento coinvolge la rilevazione dei singoli nucleotidi incorporati in tempo reale senza che la sintesi debba essere interrotta. La verifica dell efficienza del metodo ha mostrato un accuratezza nella lettura dell 83%. Il sequenziamento tramite nanopori (Nanopore sequencing) [6] è una tecnologia innovativa, basata sul principio della misurazione della corrente ionica attraverso tecniche elettrofisiologiche tradizionali: quando una piccola differenza di potenziale elettrico (100mV) è imposta attraverso un nanoporo in una membrana impermeabile che separa due camere contenenti elettroliti acquosi, la risultante attraverso il poro può essere misurata con le tecniche elettrofisiologiche. Ricordando che l apertura e la chiusura di molti canali biologici dipende da porzioni peptidiche relativamente piccole che bloc- 3
cano fisicamente il canale e ne modificano la ionizzazione, Deamer D. W. all Università della California e Church G. dell Università di Harvard, indipendentemente uno dall altro, hanno ipotizzato che, se un filamento a singola elica di Dna o uno di Rna fossero stati spinti elettroforeticamente attraverso un nanoporo di diametro opportuno, le basi azotate avrebbero modulato in modo caratteristico la ionizzazione del canale. Di conseguenza Deamer, Branton e colleghi [6] hanno dimostrato che sequenze di Dna a singola elica o Rna possono essere sequenziate facendole passare attraverso un canale proteico costruito ad-hoc e rilevando l effetto sulla ionizzazione del canale al loro passaggio. Dopo il sequenziamento, le sequenze dei frammenti ottenute sono allineate per ricostruire il genoma complessivo. L assemblaggio può essere fatto ex novo sfruttando, per esempio le parziali zone di sovrapposizione tra le sequenze. Piante sequenziate Il progredire delle tecnologie ha permesso una relativa economicità e velocità del processo di sequenziamento mediante macchinari complessi. In virtù delle innovazioni acquisite negli ultimi decenni sono diverse le specie di interesse agrario il cui genoma è stato sequenziato. Nel 2007 è stata sequenziata la vite grazie al lavoro di due progetti di ricerca, uno ministeriale-universitario italo-francese Vigna e l altro italo-americano dell Istituto agrario di San Michele all Adige (Iasma). L attività di ricerca dello Iasma nel 2010 ha condotto, inoltre, al sequenziamento del melo nell ambito di un progetto internazionale. Nello stesso anno in America si completava in sequenziamento del mais. Nel dicembre del 2010 è stato avviato, con un finanziamento del Ministero delle politiche agricole, alimentari e forestali il progetto di ricerca Olea sulla Genomica e miglioramento genetico dell olivo, finalizzato all applicazione di approcci di analisi genomica avanzata. Il progetto Olea propone di attuare ricerche finalizzate all acquisizione di conoscenze e allo sviluppo di mezzi e prodotti indispensabili per la salvaguardia della grande variabilità genetica e delle produzioni olivicole delle regioni italiane. Altre specie a essere state sequenziate sono Arabidopsis thaliana, pioppo e pomodoro. L ultima specie a essere stata sequenziata è il pesco. The International peach genome initiative (Ipgi) ha pubblicato sulla rivista Nature genetics la sequenza completa del genoma del pesco (Prunus persica). L iniziativa è partita in Italia nel 2005 con il progetto Drupomics e- volvendosi qualche anno più tardi in una partnership Italia-Usa che ha visto la partecipazione anche di istituzioni cilene, spagnole e francesi per un totale di 53 ricercatori appartenenti a più di 20 istituzioni. L interesse su Prunus persica è dovuto al crescente ruolo nella frutticoltura e al fatto di essere specie modello per la famiglia delle Rosacee in quanto mostra diploidia e un genoma contenuto con un periodo improduttivo molto limitato (2-3 anni). La disponibilità di linee omozigoti a tutti i loci, grazie all autogamia, aiuta le procedure di sequenziamento. Il progetto italiano è stato coordinato dal Cra (Centro di ricerca per la frutticoltura) di Roma ed è stato sviluppato con la collaborazione di 14 istituzioni di ricerca. Operativamente il progetto si è articolato in 4 linee di ricerca, la prima delle quali dedicata al sequenziamento del genoma di un doppio aploide della cultivar Lovell. Il sequenziamento del Dna e in particolare dei geni funzionali utili (compresi i fattori di trascrizione) e la relativa mappatura (cioè la loro localizzazione all interno di ciascun cromosoma), integrano il breeding convenzionale attraverso la Marker assisted selection (Mas) nella selezione delle varianti alleliche positive per le caratteristiche maggiormente premiate dal mercato. La selezione assistita consente, infatti, anche qualora determinate caratteristiche non sono espresse (a causa dell ambiente oppure soprattutto nelle piante arboree semplicemente perché la fruttificazione avviene dopo alcuni anni dall impianto), di programmare incroci tesi ad esaltare la produttività e la resistenza ad avversità biotiche ed abiotiche, e soprattutto a migliorare le caratteristiche qualitative dei frutti valorizzando il prodotto. Avendo le sequenze dell intero genoma a disposizione è possibile ottenere marcatori molecolari che, all interno o in prossimità dei geni maggiormente rilevanti ai fini agronomici e commerciali, riescono a identificare i genotipi partendo da qualsiasi tessuto e fase fenologica. La disponibilità della sequenza di interi genomi contribuisce significativamente all avanzamento del lavoro degli evoluzionisti che ora possono confrontare le sequenze delle diverse specie descrivendo con maggiore precisione la distanza filogenetica. 4
Riferimenti bibliografici [1] Sanger F., Coulson R., 1975. A rapid method for determining sequences in Dna by primed synthesis with Dna polymerase. Journal of molecular biology, 94, 441-448. [2] Sanger F., Nicklen S., Coulson A. R., 1977. Dnasequencing with chain-terminating inhibitors. Procedings of national academy of sciences Usa, 74, 5463-5467. [3] Hutchinson C. A., 2007. Dna sequencing: bench to bedside and beyond. Nucleic acid research, 35(18), 6227-6237. [4] Mardis E. R., 2008. Next-generation Dna sequencing methods. Genomics and human genetics, 9, 387-402. [5] Metzeker L. M., 2010. Sequencing technologies the next generation. Nature reviews genetics, 11, 31-46. [6] Deamer D. W., Marziali A., Bayley H., Benner S. A., Butler T., Di Ventra M., Garaj S., Hibbs A., Huang X., Jovanovich S. B., Krstic P. S., Lindsay S., Ling X. S., Mastrangelo C. H., Meller A., Oliver J. S., Pershin Y. V., Ramsey J. M., Riehn R., Soni G. V., Tabard-Cossa V, Wuanunu M., Wiggin M., Schloss J. A., 2008. The potential and challenges of nanopore sequencing. Nature biotechnology, 10, 1146-1153. Rosario Iacono è laureato in Scienze e tecnologie agrarie presso l Università di Catania. www.intersezioni.eu 5