25-OH VITAMINA D 3 e 25-OH VITAMINA D 2 PLASMATICHE IN LC/MS Codice LC19015 INTRODUZIONE La vitamina D ha un ruolo fondamentale nel controllo delle concentrazioni di calcio e fosforo nel liquido extracellulare e quindi nel controllo dei processi di mineralizzazione ossea e nel mantenimento dell integrità scheletrica. Insieme al Paratormone (PTH) e alla Calcitonina è responsabile del mantenimento dell omeostasi di Ca ++ e Fosforo. La Vitamina D più importante è la Vitamina D 3 o colecalciferolo, la quale, per essere attiva, deve subire una serie di trasformazioni metaboliche di idrossilazione. In una prima fase il colecalciferolo subisce una idrossilazione in posizione 25 formando il primo metabolita attivo, il 25-Idrossicolecalciferolo o Vitamina 25-OH-D 3. La Vitamina 25-OH-D 3 costituisce la forma circolante di Vitamina D 3 più rappresentata. Basse concentrazioni di 25-OH-D 3 possono anche concorrere all aumento della concentrazione sierica di PTH, stimolando il riassorbimento di Ca ++ dall osso e intensificando i processi osteoporotici. La sua concentrazione plasmatica dipende dal grado di esposizione dell individuo ai raggi ultravioletti e, normalmente, è compresa tra 20 e 120 ng/ml. In un secondo tempo questo metabolita subisce una seconda idrossilazione in posizione 1 alfa con produzione di 1,25 Diidrossi D 3 ed anche una ulteriore idrossilazione in posizione 24 con produzione di 24,25 Diidrossi D 3. Il test della 25-OH-D 3 ha assunto un importanza rilevante quale marker della quantità di ormone circolante disponibile per la produzione dei metaboliti diidrossilati. EUREKA srl LAB DIVISION VAT N 01547310423 E-mail:info@eurekaone.com www.eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi 25 60033 Chiaravalle (AN) ITALY Tel. +39 071 7450790 Fax + 39 071 7496579 Questo prodotto adempie a tutte le esigenze della Direttiva 98/79/CE del 27/10/1998 e del Dl.ivo n.332 del 08/09/2000 sui dispositivi medico-diagnostici in vitro (IVD). La dichiarazione di conformità CE è disponibile su richiesta. Release N 003 Vitamina 25-OH-D3 e Vitamina 25-OH-D2 plasmatiche in LC/MS Novembre 2014 1
Principio del metodo : CARATTERISTICHE DEL KIT Il presente metodo consente di determinare la Vitamina 25-OH-D3 e la Vitamina 25-OH-D2 dopo una semplice deproteinizzazione e lettura in LC-MS. Recupero del metodo : / Sensibilità del metodo (LLOD) : 0.2 ng/ml Minima concentrazione analizzabile (LLOQ) : 2 ng/ml Linearità del metodo : 2-1000 ng/ml Range di normalità : 20-120 ng/ml Accuratezza intra serie (errore relativo %) 25-OH- Vitamina D3 : Ci Cs 10 ng/ml 70 ng/ml 7,5% 1,9% Accuratezza inter serie (errore relativo %) 25-OH- Vitamina D3 : Ci Cs 10 ng/ml 70 ng/ml 6,9% 2,1% Riproducibilità intra serie (errore relativo %) 25-OH- Vitamina D3 : C LLOQ Cm Cs 2 ng/ml 45 ng/ml 140 ng/ml 2,6% 1,3% 0,8% Riproducibilità inter serie (coefficiente di variazione %) 25-OH-Vitamina D3 : C LLOQ Cm Cs 2 ng/ml 45 ng/ml 140 ng/ml 6,5% 5,6% 3,6% Coefficiente di Correlazione R2 + Dev Std 0,9971 + 0,0027 Accuratezza intra serie (errore relativo %) 25-OH- Vitamina D2 : Ci Cs 10 ng/ml 70 ng/ml 5,0% 4,8% Accuratezza inter serie (errore relativo %) 25-OH- Vitamina D2 : Ci Cs 10 ng/ml 70 ng/ml 5,4% 4,3% Riproducibilità intra serie (errore relativo %) 25-OH- Vitamina D2 : C LLOQ Cm Cs 2 ng/ml 45 ng/ml 140 ng/ml 1,6% 1,3% 0,8% Riproducibilità inter serie (coefficiente di variazione %) 25-OH-Vitamina D2 : C LLOQ Cm Cs 2 ng/ml 45 ng/ml 140 ng/ml 4,7% 4,0% 3,6% 2
Contenuto della Confezione (500 test): Tutti i reagenti sono pronti all uso e stabili 3 anni a 2 8 C, eccetto il Reagente A che va stoccato a 20 C. Reagente A Soluzione Deproteinizzante + Standard Interno, 1 x 100 ml Stabile 6 mesi a 20 C Reagente B1 Calibratore liofilo plasmatico Livello 1, 5 x 1 ml Reagente B2 Calibratore liofilo plasmatico Livello 2, 5 x 1 ml Reagente B3 Calibratore liofilo plasmatico Livello 3, 5 x 1 ml Reagente B4 Calibratore liofilo plasmatico Livello 4, 5 x 1 ml Reagente B5 Calibratore liofilo plasmatico Livello 5, 5 x 1 ml Reagente M1 Fase Mobile M1, 5 x 500 ml Reagente M2 Fase Mobile M2, 5 x 500 ml Dotazione strumentale minima richiesta : Modalità di prelievo ematico : Strumento LC-MS triplo quadrupolo medio-alto livello (S/N di almeno 10.000/1 per 1 pg di Reserpina iniettato) Modalità di lavoro MRM, APCI positivo Valvola Divert a 6 vie Pompa binaria Provetta con anticoagulante EDTA Stabile per circa 4 settimane a 2 8 C o 4 mesi a 20 C. 3
PROCEDURA ANALITICA: FASE 1: In provette tipo eppendorf dispensare in sequenza. Calibratore Campione Controlli Reagente B Calibratore liofilo 100 µl Campione 100 µl Controlli 100 µl Reagente A Sol. Deproteinizzante + Standard Interno (prelevato direttamente da -20 C ed utilizzato freddo) 200 µl 200 µl 200 µl Al vortex per 30 secondi FASE 2 : Centrifugare a 15.000 rpm per 15 minuti FASE 3 : Prelevare il surnatante e trasferire in vials a calicetto INIEZIONE : Iniettare 20 µl della soluzione nel sistema LC Release N 003 Vitamina 25-OH-D3 e Vitamina 25-OH-D2 plasmatiche in LC/MS Novembre 2014 4
Vitamina 25-OH-D3 e Vitamina 25-OH-D2 plasmatiche - Avvertenze REAGENTE B1-B2-B3-B4-B5 : CALIBRATORI LIOFILI Lot. 002 LIVELLI 1 2 3 4 5 Vitamina 25-OH-D3 (ng/ml) 5,0 10,0 15,0 25,0 100,0 Vitamina 25-OH-D2 (ng/ml) 5,0 10,0 15,0 25,0 100,0 Modalità d uso e Ricostituzione: i Calibratori devono essere usati per calibrare il sistema LC. Aggiungere esattamente 1 ml di H 2O di grado HPLC e agitare delicatamente per 30 min. fino a quando tutto il materiale non è dissolto. Prima del campionamento rimescolare gentilmente per assicurarne l omogeneità. Conservazione e stabilità: i Calibratori sono stabili 36 mesi se conservati a - 20 C. Una volta ricostituiti 7 giorni se conservati a 2 8 C e 1 mese a 20 C. Non usarli dopo la data di scadenza. Confezionamento : 5 x 5 x 1 ml Precauzioni: questo calibratore in matrice umana deve essere trattato con cura e considerato come potenzialmente infettivo. CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA Installare la colonna analitica nuova RAPTOR BIPHENYL (50 x 2,1 mm, 2,7 um), termostatata a 60 C Disconnettere il detector e far passare Acetonitrile per 30 minuti a 300 ul/min. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Condizionare la colonna con una soluzione di Fase Mobile M1 : Fase Mobile 2 (80 : 20 v/v) per 10 minuti al flusso di 400 ul/min. Effettuare una iniezione di Acqua di grado HPLC prima di procedere con la serie analitica. NON è possibile effettuare analisi a ricircolo di fase. Se la T Amb del Laboratorio è > 25 C si consiglia di conservare a 2-8 C la Fase Mobile fra una seduta analitica e l altra. PULIZIA DELLA COLONNA Lavare con una soluzione contenente Fase Mobile M2 al flusso di 400 ul / minuto per 10 min. La colonna va stoccata in una soluzione contenente Fase Mobile M2. LAVAGGIO SIRINGA AUTOCAMPIONATORE Lavare con una soluzione contenente Metanolo. SETTAGGIO DEI FLUSSI GRADIENTE Tempo (min) % M1 (POMPA A) % M2 (POMPA B) Flusso (ml/min) 0.2 60 40 0.4 0.3 25 75 0.4 2.5 20 80 0.4 2.6 0 100 0.4 3.5 0 100 0.4 3.51 60 40 0.4 4.5 60 40 0.4 5
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Vitamina 25-OH-D3 e Vitamina 25-OH-D2 plasmatiche (Cromatogrammi di riferimento LC-MS) Fig. 1 : Calibratore Vitamina 25-OH-D3 Livello 2 Fig. 2 : Controllo alto Vitamina 25-OH-D3 R.T. 2.39 Vitamina 25-OH-D3 R.T. 2.36 Vitamina 25-OH-D3 7
Vitamina 25-OH-D3 e Vitamina 25-OH-D2 plasmatiche (Cromatogrammi di riferimento LC-MS) Fig. 3 : Calibratore Vitamina 25-OH-D2 Livello 2 Fig. 4 : Controllo alto Vitamina 25-OH-D2 R.T. 2.55 Vitamina 25-OH-D2 R.T. 2.51 Vitamina 25-OH-D2 8
Vitamina 25-OH-D3 e Vitamina 25-OH-D2 plasmatiche (Cromatogrammi di riferimento LC-MS) Fig. 5 : Standard interno non deuterato R.T. 3.26 Standard interno 9