ANALISI DI FENOMENI NON-CLASSICI RIGUARDANTI NEURONI DERIVATI DA CELLULE STAMINALI NEURALI ADESI SU MEA

UNIVERSITÀ STATALE DEGLI STUDI DI MILANO FACOLTÀ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE NATURALI GENOMICA FUNZIONALE E BIOINFORMATICA TESI DI LAUREA SECONDO LIVELLO ANALISI DI FENOMENI NON-CLASSICI RIGUARDANTI NEURONI DERIVATI DA CELLULE STAMINALI NEURALI ADESI SU MEA Relatore: Prof.ssa RITA PIZZI Correlatore: Dott. ANDREA FANTASIA Laureando: ALBERTO REDOLFI Matricola N. 670379 Anno Accademico 2004-2005

INDICE Introduzione.......................................................... 5 1. Aspetti fondamentali di neurobiologia............................. 10 1.1 Premessa.................................................... 11 1.2 Morfologia e fisiologia del neurone............................... 11 1.3 Ruolo dei microtubuli e dei filamenti di actina nel neurone............. 15 1.4 Lo stimolo nervoso.............................................18 1.5 Sinapsi.......................................................24 1.6 Cosa sono le cellule staminali e perché un loro utilizzo.................28 1.7 Dalle cellule staminali neurali ai neuroni............................32 2. Ruolo della Fisica Quantistica nei modelli cerebrali.................. 36 2.1 Dalla fisica classica alla meccanica quantistica....................... 37 2.2 Concetti fondamentali e principi della meccanica quantistica............ 38 2.3 Modelli quantici cerebrali........................................47 2.4 Fenomenologie fondamentali dei modelli quantici cerebrali............. 48 2.5 Teoria orch-or di R.Penrose e S.Hameroff.........................56 2.6 Teoria Olonomica di K. Priebram..................................67 2.7 Considerazioni riguardo ai Quantum Brain Models.................... 69

3. Strumentazione hardware.............................................71 3.1 Set-Up sperimentale............................................ 72 3.2 Prime esperienze d interfaccia neuroni chip e meccanismi di comunicazione................................................................74 3.3 Microelectrode array (MEA).....................................80 3.4 Interfaccia delle nostre cellule staminali neurali con dispositivi MEA..... 85 3.5 Schermature elettromagnetiche ed ottiche........................... 87 3.6 Emissione impulsi laser......................................... 89 3.7 Amplificatore................................................. 91 3.8 Oscilloscopio................................................. 92 3.9 Scheda d acquisizione (NI 6052E DAQ)............................ 93 3.10 Caratteristiche generali del circuito elettronico per la registrazione...... 94 3.11 Protocollo esperimenti......................................... 95 4. Analisi dei segnali registrati in Matlab / R................................97 4.1 Dai segnali analogici ai segnali digitali............................. 98 4.2 Descrizione algoritmo implementato.............................. 101 Visualizzazione del segnale.................................. 103 Analisi del segnale......................................... 112 Determinazione e validazione modello ARIMA cross-correlato......139 4.3 Considerazioni finali...........................................142 4.4 Architettura dell algoritmo DSP-system mediante schema a blocchi..... 143 5. Risultati ottenuti.............................................. 144 5.1 Premessa...............................................145 5.2 Problemi riscontrati in fase di registrazione....................145

5.3 Registrazioni a vuoto esperimenti IX e X.......................... 146 5.4 Stimolazione piastra neuroni, seconda piastra neuroni schermata otticamente........................................................... 150 5.5 Stimolazione piastra neuroni, piastre matrigel e liquido schermate otticamente.............................................................158 5.6 Stimolazione piastra matrigel, piastre neuroni e liquido schermate otticamente................................................. 159 5.7 Stimolazione piastra liquido coltura, piastre neuroni e matrigel schermate otticamente..................................................174 5.8 Stimolazione piastra neuroni, piastra matrigel e liquido libere da schermatura ottica...................................................... 174 5.9 Stimolazione piastra matrigel, piastre neuroni e liquido libere da schermatura ottica.......................................................177 5.10 Stimolazione piastra liquido coltura, piastre neuroni e matrigel liberi da schermaura ottica............................................ 178 5.11 Laser schermato da una pellicola a doppio strato di alluminio, cosicché nessuna emissione possa propagarsi, attivato sopra i neuroni..........179 5.12 Laser è portato a 1 metro di distanza, nascosto alla piastra di neuroni, attivato e diretto in direzione opposta.................................. 180 5.13 Stimolazione mediante luce LED................................ 181 5.14 Considerazioni................................................183 Conclusioni.....................................................185 Bibliografia.................................................... 190

Introduzione Introduzione 5

Introduzione E possibile ritenere che i modelli classici fino ad oggi utilizzati per spiegare i processi cognitivi cerebrali siano parzialmente inadeguati? E lecito ricercare strade alternative per l interpretazione di taluni processi localizzati all interno del cervello umano? Queste sono le domande che, di recente, vengono poste ai più autorevoli esponenti della disciplina che studia le funzioni, i meccanismi, e le caratteristiche del sistema nervoso: la neurofisiologia. La possibilità di formulare una spiegazione di carattere scientifico dei diversi processi cognitivi s affermò nella seconda metà del diciannovesimo secolo con la nascita della psicofisica. Da questo momento i cultori delle neuroscienze diffusero l idea che come tutti i fenomeni biologici anche la mente, intesa come l insieme delle operazioni che il sistema nervoso centrale esegue, avesse le proprietà della materia. La ricerca scientifica ha poi obbligato a determinare una soluzione al problema in termini fisico riduzionistici, quindi in termini di cellule nervose e circuiti nervosi. Tuttavia, nonostante si siano fatti numerosi passi in avanti nella comprensione citologica del neurone, dei meccanismi funzionali alla base della sua attività, ad oggi la comprensione dei processi cognitivi risulta essere sostanzialmente irrisolta. L unico modo per tentar di comprendere la dinamica cerebrale potrebbe essere quello di cambiare l usuale approccio classicista nella descrizione del problema. Si devono abbandonare gli strumenti, le metodologie e il formalismo della fisica classica tentando di aprire la magica scatola del cervello e della mente umana sfruttando come chiave la fisica dell infinitamente piccolo, ovvero, i principi che regolano la meccanica quantistica. Pertanto, il cervello e tutti i suoi componenti non vengono più considerati come oggetti che obbediscono alle leggi classiche; bensì come oggetti quantici macroscopici obbedienti a quelle leggi caratterizzanti la scala di Planck. L oggetto di studio della meccanica quantistica è il comportamento della materia su scale atomiche o inferiori. La fisica quantistica s è affermata nel panorama scientifico per il fatto di riuscire a descrivere situazioni che non potevano essere giustificate con l ausilio dalla meccanica classica come ad esempio gli spettri a righe, le radiazioni dei corpi neri, l effetto fotoelettrico e l effetto Compton. 6

Introduzione L impiego della fisica quantistica nello studio delle dinamiche riguardanti il cervello umano ha trovato un suo fondamento nel 1984 con gli studi del fisico tedesco Herbert Fröhlich. Allora, egli affermò che fenomeni di coerenza quantica avrebbero potuto manifestarsi anche in particolari strutture organiche caratterizzate da temperature biologiche, da alte energie metaboliche e da particolari proprietà dielettriche, indicando il cervello come possibile candidato per l avvento di tali fenomenologie. Da questo momento in poi si assistette alla diffusione di numerosi quanto differenti modelli quantici cerebrali da parte di numerosi fisici teorici, neurobiologi e neurofisiologi. Sebbene le numerose speculazioni fatte a riguardo della teoria quantistica nel cervello in tutti questi anni distino ancora parecchio dell essere localizzate in un quadro chiaro, completo, omogeneo ed articolato, l utilizzo di tale approccio potrebbe rivelarsi l unico strumento per fornire una spiegazione sufficientemente attendibile, rigorosa e scientifica del funzionamento della mente umana. Questo lavoro si inserisce in un progetto di ricerca che coinvolge, oltre all università degli Studi di Milano, anche il Laboratorio di Cellule Staminali del DIBIT (Ospedale San Raffaele di Milano) dal quale provengono le coltivazioni delle cellule staminali neurali umane. Il presente progetto, utilizzando array planari di microelettrodi (MEA) per la registrazione elettrofisiologica in vitro del segnale neurale, si pone come obbiettivo quello di mettere a punto un algoritmo che consenta di processare efficacemente l ingente mole di dati raccolti. Il software di indagine, screening ed analisi dei tracciati neurali implementato si articola in tre parti distinte. La prima, caratterizzata da una fase di scelta della porzione del segnale da analizzare. La seconda, caratterizzata dall analisi dei tracciati neurali sia nel dominio del tempo che nel dominio delle frequenze. La terza, caratterizzata dall analisi di serie temporali applicando un modello di autoregressione integrata a media mobile. Un metodo ideale di analisi dovrebbe essere rapido, efficace da un punto di vista computazionale, intuitivo, ben strutturato e meno complesso dei metodi a scopo generale commercialmente già esistenti. L algoritmo descritto in questo lavoro è stato implementato utilizzando due linguaggi di programmazione ad alto livello: Matlab ed R. 7

Introduzione Matlab è un ambiente software in cui problemi e soluzioni, vengono espressi mediante notazioni matematiche, mentre le informazioni sono rappresentate mediante matrici. Essendo questo un programma sia compilativo che interpretativo le diverse operazioni d analisi fisico-matematiche implementate possono essere eseguite in due modi sostanzialmente differenti: essere tradotte completamente dalla prima all ultima istruzione, oppure, essere eseguiti riga per riga sfruttando un interfaccia interattiva. R, a differenza di Matlab, è un programma open-source caratterizzato da un ambiente di lavoro e di sviluppo che consente anch esso di lavorare interattivamente con i dati. R è fornito di insiemi di operatori ad alto livello per effettuare calcoli su array e matrici, supporta paradigmi di programmazione object-oriented e funzionale. Sia Matlab che R, in definitiva, risultano essere due forti strumenti per l analisi statistica. Dalle analisi condotte sugli oltre 750 Mb di dati raccolti sono state evidenziate caratteristiche difficilmente spiegabili attraverso le usuali teorie classiche; inoltre sono state notate risposte specifiche ed organizzate a differenti pattern di stimolazioni proposti. Tuttavia, nonostante questi risultati siano molto suggestivi, affascinanti nonché di grande interesse nel panorama delle dinamiche cerebrali, il preciso significato fisico e le implicazioni a livello macroscopico dovranno essere indagate ulteriormente. Nel primo capitolo, dopo aver presentato una descrizione del neurone da un punto di vista fisiologico, s è proceduto nella descrizione delle cellule staminali neurali umane utilizzate per derivare i neuroni impiegati negli esperimenti condotti. Il secondo capitolo focalizza dapprima l attenzione sui diversi principi della fisica classica impiegati per la descrizione del funzionamento e delle proprietà dei neuroni. In seguito, vengono descritti i principi fondamentali della fisica dei quanti validi teoricamente anche a livello cerebrale. Infine, sono esposte le teorie di Stuart Hameroff, Roger Penrose, Karl Pribram riguardo allo studio delle dinamiche cerebrali sfruttando differenti nozioni di meccanica quantistica precedentemente esposte. Nel terzo capitolo, viene descritta la strumentazione hardware necessaria per l acquisizione dei segnali neurali da analizzare. Verranno riportati gli esperimenti condotti in letteratura riguardanti l interfaccia tra neurone-silicio e la crescita di reti nervose biologiche coltivate. Particolare attenzione sarà posta alle ricerche svolte presso il Max Planck Institute di Monaco. Di seguito saranno dettagliatamente trattati anche i 8

Introduzione restanti strumenti hardware impiegati, ovvero: la scheda di acquisizione NI 6052E DAQ della National Instruments Society, il modulo hardware dedicato alla calibrazione degli impulsi, e infine, la strumentazione per l invio delle stimolazioni alle cellule tramite laser ad alta frequenza. Nel quarto capitolo, è stata quindi effettuata un esaustiva trattazione dell algoritmo creato per la selezione dei file da processare, per la visualizzazione delle porzioni di segnale di interesse, per il computo delle diverse analisi implementate spiegando anche il motivo per cui sono state scritte tali procedure. Il quinto capitolo fornisce una raccolta dei risultati più significativi ottenuti in seguito alle analisi effettuate. Al termine, quindi, vengono tratte le conclusioni di questo lavoro. 9

1. Aspetti fondamentali di neurobiologia 1. Aspetti fondamentali di neurobiologia 10

1. Aspetti fondamentali di neurobiologia 1.1 Premessa La struttura delle unità operative del cervello, ovvero delle singole cellule nervose, è relativamente semplice. Sebbene il sistema nervoso dell uomo contenga un numero straordinariamente elevato di neuroni (circa 10 11 ), i quali possono venire classificati in un migliaio di tipologie differenti, tutte le cellule nervose sono riconducibili ad un unica architettura di base [Kan&Al03]. 1.2 Morfologia e fisiologia del neurone Da un punto di vista prettamente morfologico le cellule nervose possono essere suddivise in quattro zone principali: il corpo cellulare, i dendriti, l assone e le terminazioni pre-sinaptiche (figura 1). La struttura interna del neurone è qualitativamente identica a quella di tutti gli altri tipi di cellule: è presente quindi una membrana cellulare (costituita da due strati di molecole fosfolipidiche), un nucleo (contenente l informazione genetica organizzata in cromosomi), un nucleolo (sede di produzione dell RNA ribosomiale) e il citoplasma (contenente lisosomi, ribosomi, mitocondri, il complesso di Golgi e il reticolo endoplasmaico liscio e ruvido). Il corpo cellulare (soma) è il vero centro metabolico del neurone. Esso ha una struttura approssimativamente sferica di circa 70 µm di diametro. Dal soma prendono origine due differenti tipi di processi: numerosi dendriti prevalentemente di breve estensione, e un lungo processo tubulare denominato assone. La microscopia elettronica ha rivelato che il contenuto dei dendriti prossimali (grossi dendriti che non si allontanano molto dal soma) è assai simile a quello del citoplasma cellulare, rafforzando l ipotesi secondo la quale i dendriti (e più in generale gli assoni) costituiscono semplici estensioni del corpo cellulare e non organelli distinti come ad esempio ciglia e flagelli in alcune cellule. I dendriti, comunque, si protraggono dal corpo cellulare dei neuroni formando una specie di arborizzazione; inoltre, rappresentano il principale apparato destinato alla ricezione dei messaggi provenienti da altre cellule nervose. L assone, al contrario, si estende dal corpo cellulare per lunghe distanze rappresentando il principale elemento di conduzione capace di trasmettere messaggi agli altri neuroni. Un assone può trasmettere segnali elettrici a distanze differenti comprese tra 11

1. Aspetti fondamentali di neurobiologia 0.1 mm e 3 m. I segnali elettrici trasmessi vengono detti potenziali d azione, questi sono impulsi nervosi rapidi e transitori con carattere di tutto o nulla [Kan&Al03]. I potenziali d azione prendono inizio a livello di una zona d innesco localizzata all origine dell assone detta cono d emergenza (o segmento iniziale) a partire dalla quale i potenziali vengono condotti senza decremento né distorsione lungo l assone, a velocità variabili fra 1 e 100 m al secondo. L ampiezza del potenziale d azione non si modifica lungo il suo decorso rimanendo sempre costante in quanto esso si rigenera ad intervalli regolari viaggiando lungo l assone. Figura 1: Struttura di un neurone Per aumentare la velocità con cui vengono condotti i potenziali d azione gli assoni di dimensioni maggiori sono circondati da un involucro lipidico isolante di mielina. Questo involucro è interrotto a intervalli regolari dai nodi di Ranvier ed è appunto a livello di questi siti privi di rivestimento isolante che si rigenera continuamente l energia del potenziale d azione. Vicino alla terminazione dell assone esistono numerose branche mediante le quali l assone entra in contatto con altri neuroni. I punti in cui due neuroni entrano in comunicazione sono noti come sinapsi. La cellula nervosa che trasmette il segnale viene 12

1. Aspetti fondamentali di neurobiologia detta cellula presinaptica mentre quella che lo riceve è detta cellula postsinaptica. La cellula presinaptica trasmette i propri segnali a livello di rigonfiamenti specializzati in prossimità delle ramificazioni terminali dell assone: questi rigonfiamenti prendono il nome di terminazioni presinaptiche. In realtà, la cellula presinaptica non entra anatomicamente in contatto con la cellula postsinaptica in quanto le due cellule sono separate a questo livello da uno spazio detto fessura sinaptica [Kan&Al03]. Esistono due principi fondamentali riguardanti la funzionalità degli elementi base del sistema nervoso: il principio della polarizzazione dinamica e il principio della specificità delle connessioni. Il primo di questi due principi generali afferma che in ogni neurone i messaggi nervosi viaggiano sempre in una singola direzione: dalle zone di ricezione del neurone (in generale dai dendriti e dal corpo cellulare) verso la zona d innesco, a livello dell assone. Da qui il potenziale d azione si propaga poi unidirezionalmente per tutta la lunghezza dell assone fino alle terminazioni presinaptiche. Il secondo principio afferma invece che le cellule nervose non si connettono indifferentemente le une alle altre formando reti nervose casuali; ciascuna cellula stabilisce invece connessioni specifiche a livello di zone specializzate di contatto solamente con particolari cellule bersaglio postsinaptiche ma non con altre. La caratteristica che più distingue un neurone da un altro neurone è la sua forma: in particolare, il numero e il tipo dei processi nervosi che dipartono dal suo corpo cellulare. A seconda della loro forma, i neuroni vengono classificati in tre grandi gruppi: unipolari, bipolari e multipolari (figura 2). I neuroni unipolari costituiscono la classe più semplice di neuroni. Hanno un solo processo primario, in generale fornito di molte ramificazioni. Una di queste rappresenta l assone, mentre le altre servono come strutture dendritiche di ricezione. Le cellule unipolari sono preponderanti nel sistema nervoso degli invertebrati; nei vertebrati vanno a formare i gangli del sistema nervoso autonomo. I neuroni bipolari hanno un corpo ovoidale che dà origine a due processi: un dendrite, che porta informazioni provenienti dalla periferia del corpo, e un assone, che invia informazioni al sistema nervoso centrale. Molti neuroni bipolari sono di natura sensitiva, come ad esempio le cellule bipolari della retina e quelle dell epitelio olfattivo. Le cellule 13

1. Aspetti fondamentali di neurobiologia sensitive che portano informazioni tattili, di pressione e dolorifiche al midollo spinale costituiscono un tipo particolare di cellule dette cellule pseudounipolari. Queste si sviluppano inizialmente come cellule bipolari; i due processi vanno in seguito incontro a fusione formando un unico assone che emerge dal corpo cellulare e si suddivide quindi in due branche: una decorre verso la periferia mentre l altra entra nel midollo spinale. I neuroni multipolari predominano nel sistema nervoso dei vertebrati. Queste cellule hanno un unico assone e una o più branche dendritiche che, in generale, posono nascere da ogni parte del corpo cellulare. Le forme dei neuroni multipolari possono essere molto variabili specialmente per ciò che concerne la lunghezza degli assoni e il numero, la lunghezza e la complessità del loro albero dendritico [Kan&Al03]. Figura 2: Differenti tipologie di cellule nervose: a) neurone unipolare b) neurone bipolare c) neurone pseudo-unipolare d) tre tipi di neuroni multipolari 14

1. Aspetti fondamentali di neurobiologia 1.3 Ruolo dei microtubuli e dei filamenti di actina nel neurone Anche il neurone, così come le altre cellule eucariotiche, è caratterizzato da un denso reticolo di proteine fibrose costituenti il citoscheletro. Il citoscheletro, responsabile della consistenza gelatinosa del citoplasma, contribuisce su larga scala alla disposizione ordinata degli organelli citoplasmatici. Come sarà ampiamente trattato in seguito, i filamenti che costituiscono il citoscheletro, in particolar modo i microtubuli e l actina, ricoprono un ruolo di fondamentale importanza anche nei processi di comunicazione neurale. Secondo l approccio classico invece, questi elementi, assieme ai filamenti intermedi, sono paragonabili rispettivamente alle travi, ai cavi e ai bulloni che sostengono, mantengono e danno forma ai neuroni. Per ora, cerchiamo di comprendere esclusivamente la concezione classica. I microtubuli (figura 3) hanno un diametro di circa 25 nm, lunghezze variabili di diversi µm, e sono caratterizzati da una conformazione molto particolare: sono infatti dei cilindri cavi [Tob&Al98]. Figura 3: Composizione dei microtubuli Queste strutture possiedono una regione centrale cava circondata da una parte di filamenti lineari chiamati protofilamenti (in genere 13 per microtubulo, ma occasionalmente il loro numero può anche aumentare). I microtubuli sono polimeri costituiti da due proteine globulari simili identificate attraverso studi biochimici. Queste proteine sono chiamate α e β tubulina. Ogni tubulina ha peso molecolare di 55.000 ed è caratterizzata da circa 450 amminoacidi. Le tubuline α e β si associano spontaneamente in un dimero di peso molecolare di 110.000 [Tob&Al98] (figura 4). 15

1. Aspetti fondamentali di neurobiologia Figura 4: sx) Struttura 3D dimero di tubulina dx) Interazione tubuline a formare microtubulo In condizioni appropriate il dimero si può assemblare in vitro per formare lunghe strutture che appaiono come i microtubuli osservati nelle cellule. La polimerizzazione in provetta è stata difficile da ottenere in quanto s è dovuto scoprire che l assemblaggio richiedeva temperature più elevate (37ºC) di quelle usate classicamente negli esperimenti biochimici (4ºC). Era necessaria, inoltre, la rimozione degli ioni Ca 2+ e l aggiunta di guanosina-trifosfato (GTP). Una molecola di GTP si lega ad ogni dimero e, in seguito all assemblaggio del microtubulo, il GTP viene idrolizzato in guanosina-difosfato (GDP). I microtubuli hanno una polarità intrinseca, sia se osservati in vitro che in vivo e, le due estremità vengono indicate plus e minus. I dimeri di tubulina possono essere aggiunti o rilasciati da entrambe le estremità, ma la crescita è più rapida all estremità positiva (effetto treadmilling). Microtubuli che contengono GTP nei dimeri aggiunti di recente cresceranno più velocemente di quelli con GDP. In un microtubulo in accrescimento rapido, l assemblaggio può procedere più rapidamente dell idrolisi del GTP a GDP e, quindi, l estremità positiva può formare un cappuccio con numerosi GTP-dimeri di tubulina. La rimozione del cappuccio del GTP per mezzo di raggi ultravioletti porta ad un rapido disassemblaggio ed accorciamento dei microtubuli, mostrando l importanza funzionale del cappuccio nel determinare la dinamica dell accrescimento microtubulare [Tob&Al98]. L estremità negativa dei microtubuli si origina dal centro di organizzazione dei microtubuli (MTOC) (figura 5). Nel citoplasma delle cellule degli eucarioti, l MTOC è 16

1. Aspetti fondamentali di neurobiologia solitamente situato in una struttura chiamata centrosoma la quale contiene anche un organello particolare: il cetriolo. Figura 5: Centro d organizzazione dei microtubuli Studi biochimici hanno identificato un certo numero di proteine associate ai microtubuli (MAP) costituenti più del 10 15 % della massa totale dei microtubuli. Queste proteine legandosi ne influenzano la funzione e l organizzazione. Le MAP possono essere suddivise in due grandi categorie principali: fibrose e proteine motore. Le MAP fibrose legano i microtubuli adiacenti in fasci; le MAP proteine-motore (chinesina e dineina) scorrono invece lungo il filamento in base alla loro differente polarità svolgendo un attività di trasporto. I filamenti di actina invece, di soli 7 nm di diametro, sono gli elementi più flessibili del citoscheletro. Essi costituiscono una rete subito sotto la superficie cellulare, formando cavi intrecciati che forniscono un consistente supporto meccanico (figura 6). Ogni molecola di actina è una proteina globulare costituita da 375 amminoacidi con un peso molecolare di circa 42.000 [Tob&Al98]. I filamenti di actina vengono continuamente costruiti e distrutti. Figura 6: Filamento di actina 17

1. Aspetti fondamentali di neurobiologia Molecole isolate di actina (chiamate actine G globulari) possono assemblarsi, anche in provetta, con altre molecole di actina G per formare una doppia elica (chiamata F filamentosa). Attraverso studi biochimici e microscopici s è stabilito che una estremità di questo filamento cresce più rapidamente. Ciò significa che, al terminale positivo, esiste una probabilità maggiore che avvengano aggiunti monomeri d actina, mentre al terminale negativo esiste una maggiore probabilità di perdere monomeri. Ciò comporta che la polimerizzazione dell actina tenda a far muovere i filamenti in un unica direzione. Ogni monomero di actina può legare una molecola di ATP, che può essere idrolizzata ad ADP (formando actina-adp). La velocità di aggiunta di monomeri è maggiore per l actina ATP che per l actina-adp e quindi, in presenza di ATP, un filamento di actina cresce molto più rapidamente. Quindi, l ATP influenza attivamente i movimenti dei filamenti di actina [Tob&Al98]. Inoltre la polimerizzazione dell actina è in grado di determinare la trasformazione del citoplasma da gel a sol e viceversa. In vitro la trasformazione gel-sol si verifica in presenza di ioni calcio e ATP. In questo processo di transizione giocano un ruolo di primaria importanza anche due proteine: l α-actinina e la gelsolina. La prima promuove la formazione di un gel tridimensionale la seconda invece legandosi all estremità positiva consente il passaggio verso lo stato di sol a minor viscosità. Tutti questi elementi sono peculiarità del citoscheletro, quindi potrebbe apparire strana la trattazione dei microtubuli e dei microfilamenti in questo capitolo; in realtà, in seguito verranno messe in evidenza importanti proprietà neuronali influenzate da queste importanti strutture. 1.4 Lo stimolo nervoso Lo stimolo nervoso è una variazione della differenza di potenziale elettrico tra l interno della cellula nervosa e il liquido extracellulare. A riposo, tutte le cellule, ivi compreso il neurone, mantengono una certa differenza di potenziale elettrico ai capi della loro membrana plasmatica, definito potenziale di membrana di riposo. In generale, questa differenza di potenziale si aggira attorno ai 70 mv. Poiché la carica netta presente all esterno della membrana viene arbitrariamente posta pari a zero, si suol dire che il 18

1. Aspetti fondamentali di neurobiologia potenziale di membrana di riposo di ogni neurone coincida con il valore di 70 mv [Kan&Al03]. La differenza di potenziale elettrico in una cellula a riposo dipende principalmente da due fattori: 1) Dall ineguale distribuzione degli ioni presenti sulle due facce della membrana: in particolare dalla presenza degli ioni sodio e potassio carichi positivamente, e delle proteine e degli amminoacidi carichi negativamente. 2) Dalla permeabilità selettiva della membrana verso uno solo di questi ioni: il potassio. L ineguale distribuzione degli ioni positivi su ciascun lato della membrana viene mantenuta da una speciale proteina (pompa sodio-potassio), la quale pompa Na + fuori dalla cellula e K + al sua interno (figura 7). Figura 7: Pompa Na + -K + Inoltre, a riposo, la membrana cellulare neurale è selettivamente permeabile agli ioni K + in quanto possiede numerosi canali ionici che attraversano la membrana da parte a parte e sono molto più permeabili al potassio che non al sodio. Quando la cellula è a riposo questi canali sono aperti e i K + tendono spontaneamente ad uscire all esterno. Man mano che i K + abbandonano la cellula essi lasciano una nuvola di cariche negative non neutralizzate, così la carica all interno risulta essere più negativa che non quella esterna. 19

1. Aspetti fondamentali di neurobiologia Tuttavia, una volta che la cellula nervosa viene sottoposta a stimolazione, la membrana plasmatica della cellula diviene molto più permeabile agli ioni Na + che ai K +. L ingresso del sodio carico positivamente tende a neutralizzare le cariche negative presenti all interno della cellula, il che determina una riduzione del potenziale di membrana, fino ad assumere un potenziale di +30 mv. Tale variazione rigenerativa del potenziale di membrana viene denominata potenziale d azione o spike (figura 8). Figura 8: Potenziale d azione La variazione della differenza di potenziale non avviene simultaneamente lungo tutta la superficie della cellula: essa insorge in prossimità della regione stimolata e da qui si propaga velocemente, mentre alle sue spalle tutto torna come prima. Perché si possa manifestare uno potenziale d azione si deve manifestare un evento depolarizzante di almeno 15 20 mv, condizione necessaria e sufficiente per permettere il superamento del potenziale soglia e far insorgere uno spike. Il potenziale d azione viene condotto lungo l assone della cellula fino alle sue terminazioni che sono in rapporto con altri elementi eccitabili (neuroni o fibbre muscolari), dando inizio ad un processo di comunicazione con altre cellule. Come già detto in precedenza, il potenziale d azione è un impulso di tutto o nulla che si propaga attivamente lungo l assone in modo tale che la sua ampiezza resti inalterata fino alle terminazioni periferiche dell assone stesso. In generale il potenziale d azione dura circa un millisecondo, al termine del quale la membrana riacquista le sue 20

1. Aspetti fondamentali di neurobiologia proprietà di riposo, caratterizzate dalla normale separazione delle cariche e dalla maggior permeabilità verso ai K + rispetto ai Na +. Il meccanismo con cui si genera l impulso nella cellula nervosa è congegnato in modo tale da rendere impossibile un variazione dell ampiezza. L impulso, dunque, c è o non c è: non è possibile che esso sia più forte o più debole. L ampiezza fissa dello stimolo nervoso sembrerebbe una grave limitazione alla possibilità di trasmettere sfumature intermedie in un messaggio, tuttavia la cellula nervosa aggira l ostacolo: essa riesce a modulare il messaggio variando la frequenza dell impulso anziché la sua ampiezza. Sostanzialmente quindi, il sistema nervoso trasmette impulsi in modulazione di frequenza [Kan&Al03]. La cellula nervosa ha sviluppato nel corso della propria evoluzione un raffinato meccanismo per la conduzione dei segnali a lunga distanza. Il meccanismo è basato anche su numerose ed importantissime proteine canale, che si possono aprire o chiudere in risposta a variazioni della differenza di potenziale tra esterno ed interno della cellula. Queste proteine canale sono denominate voltage gated channels (canali regolati dal voltaggio). Possiamo immaginare tali canali come delle porte caratterizzate da tre differenti posizioni (figura 9): chiusa aperta chiusa e bloccata Canale chiuso e pronto ad aprirsi Canale aperto Canale chiuso e bloccato Figura 9: I tre stati dei voltage gated channels Nella cellula a riposo questi canali sono in posizione chiusa. L apertura avviene bruscamente quando la differenza di potenziale si abbassa al di sotto di un certo limite; ad 21

1. Aspetti fondamentali di neurobiologia essa segue poi automaticamente, dopo un brevissimo tempo, la fase chiusa e bloccata; infine si ripristina la fase di chiusura. I più importanti canali regolati dal voltaggio sono quelli che lasciano passare specificamente lo ione sodio, i quali prendono il nome di canali del sodio. Anche altri canali sono importanti per la propagazione dello stimolo ma la loro trattazione esula dallo scopo di questa tesi. E stato osservato che con un breve impulso di corrente elettrica sia possibile annullare momentaneamente il potenziale di riposo in una zona molto ristretta di una fibra nervosa, cioè provocare una depolarizzazione. La depolarizzazione causa l apertura dei canali del sodio nella zona in cui è stata immessa la corrente. Di conseguenza, il sodio entra rapidamente sotto una doppia spinta: la differenza di concentrazione (maggiore all esterno) e la differenza di potenziale elettrico (l interno della fibra è infatti più negativo e quindi l ingresso dello ione Na +, carico positivamente, è facilitato). In seguito all ingresso del sodio, la differenza del potenziale prima si annulla e poi si inverte, cioè l interno dell assone diventa più positivo rispetto all esterno. Si è generato così un potenziale d azione. Dopo un tempo brevissimo, dell ordine di qualche millisecondo, i canali per il sodio si chiudono e la pompa Na + -K + ripristina il potenziale di riposo, ma intanto la depolarizzazione provocata dall entrata del sodio ha fatto aprire altri canali per il sodio più lontani dallo stimolo. Il potenziale dazione si lascia dietro una zona temporaneamente insensibile ad un altro stimolo, poiché i canali del sodio, una volta chiusi, restano bloccati fino a che non si è ripristinato il potenziale di riposo, mentre nella zona non attraversata dalla perturbazione essi sono pronti ad aprirsi. In tal modo la perturbazione può allontanarsi dal punto di origine ma non può tornare indietro. Tutto il ciclo: stimolazione scatenamento del potenziale d azione preparazione per una nuova stimolazione dura pochi millesimi di secondo (figura 10). Nelle fibre avvolte da guaina mielinica la conduzione avviene in modo un po diverso. I canali del sodio sono tutti concentrati nei nodi di Ranvier. La depolarizzazione si propaga lateralmente nelle zone coperte dalla guaina, perdendo gradualmente di intensità. La depolarizzazione iniziata in un nodo è dunque diminuita al nodo successivo ma è ancora sufficiente per far aprire i canali del sodio. Abbiamo dunque due fasi nella propagazione: una passiva da un nodo all altro, ed una attiva nei nodi. Questo tipo di 22

1. Aspetti fondamentali di neurobiologia conduzione è più efficiente rispetto a quella delle fibre senza mielina, in cui i canali di sodio sono sparsi dappertutto. Figura 10: Propagazione dello stimolo nervoso In conclusione i principali protagonisti del meccanismo di conduzione sono la pompa sodio-potassio e i voltage gated channels. Questi ultimi permettono alla perturbazione di propagarsi con rapidità esplosiva senza attenuazioni lungo il percorso. Infatti la loro apertura non è proporzionale al grado di depolarizzazione: è sufficiente che essa superi un certo valore minimo per farli spalancare completamente. Ciò spiega il carattere tutto o nulla dello stimolo nervoso. E la pompa sodio potassio che crea la differenza tra concentrazioni interne ed esterne di ioni, tipica della cellula a riposo, ridotta poi dai potenziali d azione. Si potrebbe paragonare questo fenomeno alla carica di una batteria che viene gradualmente scaricata dai potenziali d azione: la pompa tuttavia lavora senza sosta per ricaricare la batteria, riportando la concentrazione degli ioni ai valori originari. 23

1. Aspetti fondamentali di neurobiologia 1.5 Sinapsi I neuroni sono in contatto l uno con l altro per poter trasmettere l'impulso nervoso. I punti di giunzione tra i prolungamenti delle cellule nervose vengono denominati sinapsi, parola di origine greca il cui significato può essere tradotto col termine di collegamento. Un neurone può formare circa 1.000 connessioni sinaptiche e riceverne anche in numero maggiore, probabilmente intorno a 10.000, e addirittura, le cellule del Purkinje del cervelletto ricevono fino a 100.000 connessioni. Classicamente tutti i neuroni fanno uso soltanto di due meccanismi fondamentali di trasmissione sinaptica: la trasmissione elettrica e la trasmissione chimica. Nel sistema nervoso la trasmissione elettrica avviene in maniera rapida e piuttosto stereotipata. Le sinapsi elettriche servono, anzitutto, per inviare segnali depolarizzanti semplici; esse non consentono in prima istanza l invio di messaggi inibitori e non determinano variazioni di lunga durata delle proprietà elettriche delle cellule postsinaptiche. Al contrario, le sinapsi chimiche sono più duttili e tendono a produrre comportamenti più complessi. Le sinapsi chimiche evocano sia risposte eccitatorie che inibitorie nelle cellule postsinaptiche e vi possono indurre modificazioni dello stato elettrico di durata variabile da qualche millisecondo a molti minuti. Di particolare importanza appare la loro capacità di amplificare i segnali neurali, facendo sì che anche una piccola terminazione presinaptica possa modificare la risposta di una cellula postsinaptica di grandi dimensioni. Per capire come funzionano questi due tipi di sinapsi è indispensabile conoscerne la struttura (figura 11). Figura 11: sx) Sinapsi elettrica dx) Sinapsi chimica 24

1. Aspetti fondamentali di neurobiologia In tabella 1 vengono di seguito riassunte e messe a confronto le differenti proprietà caratterizzanti i due tipi di sinapsi: elettriche e chimiche [Kan&Al03]. Tabella 1: Caratteristiche delle sinapsi elettriche e chimiche Le sinapsi elettriche rappresentano l accoppiamento elettrico diretto tra le giunzioni comunicanti e vengono definite per mezzo di connessioni specializzate a bassa resistenza elettrica denominate gap junction. Questi tipi di sinapsi si rinvengono in diverse zone del sistema nervoso di vertebrati ed invertebrati e consistono, essenzialmente, nella giustapposizione delle due membrane delle cellule che devono essere in comunicazione, separate da uno spazio di soli 2-4 nm. Tale giunzione permette il passaggio bidirezionale di ioni di piccole molecole (dell ordine di 300 1.500 dalton). Questo spazio è attraversato da speciali strutture proteiche, i canali delle giunzioni comunicanti, che sono composti ognuno da due emicanali (connessoni), uno dei quali appartiene alla cellula presinaptica e l altro a quella postsinaptica. Ogni connessone è formato, a sua volta, da sei subunità proteiche identiche chiamate connessine (figura 11 sx). Il grosso vantaggio evolutivo delle sinapsi elettriche è il fatto che la trasmissione si verifica senza alcun ritardo evidente. Tuttavia queste sinapsi non offrono come già detto la regolazione e il controllo assicurati dalle sinapsi chimiche, cui si deve la maggior parte dei collegamenti che coinvolgono i neuroni. Il principio base della comunicazione chimica risiede nel fatto che la cellula presinaptica o sorgente rilasci (previa apertura dei canali del calcio in seguito allo stimolo depolarizzante) per esocitosi nel mezzo extracellulare un messaggero chimico destinato a 25

1. Aspetti fondamentali di neurobiologia legarsi ai recettori di membrana della cellula postsinaptica. Il messaggero chimico è detto neurotrasmettitore, il cui percorso attraverso lo spazio intersinaptico è coperto per diffusione e non supera la frazione dei micrometri. La sinapsi chimica può essere definita come un aggregato di strutture, nella quale sono incluse: la terminazione assonica; la membrana dendritica o postsinaptica immediatamente adiacente; e lo spazio separante la terminazione assonica dal dendrite, detta fessura intersinaptica. La terminazione assonica adiacente allo spazio intersinaptico, è chiamata membrana presinaptica, in relazione alla sua controparte dendritica. In prossimità della membrana presinaptica la sinapsi chimica presenta specializzazioni di membrana e numerose vescicole di forma ellissoidale o sferica. Queste vescicole sinaptiche sono quelle che contengono il neurotrasmettitore che deve essere rilasciato (figura 11 dx). Quando un potenziale d azione giunge in prossimità della terminazione assonica si ha inizio ad una sequenza di eventi che determinano una variazione caratteristica nel potenziale della cellula postsinaptica (PSP o Potenziale Post Sinaptico). Con un certo ritardo, la depolarizzazione della terminazione assonica produce il rilascio del neurotrasmettitore, il quale diffonde rapidamente nello spazio intersinaptico e interagisce con la membrana postsinaptica. Non tutte le molecole di neurotrasmettitore giungono a destinazione, in quanto alcune si perderanno per diffusione nell ambiente cellulare o saranno distrutte da enzimi specifici. La diversità di recettore a cui un neurotrasmettitore può legarsi dà luogo ad effetti che si instaurano rapidamente e durano poco, oppure possono insorgere e durare più a lungo. Il primo tipo è mediato da recettori che si comportano da canali ionici a sbarramento (tipo a controllo di ligando): in tal caso l associazione recettore-neurotrasmettitore provoca un istantaneo flusso ionico attraverso la membrana della cellula postsinaptica. Poi vi sono dei neurotrasmettitori che agiscono su scale di tempo più lunghe, agendo come ormoni o mediatori chimici locali: per esempio si associano con recettori a loro volta accoppiati con enzimi e producono variazioni prolungate di conduttanza postsinaptica, alterando la concentrazione di un secondo messaggero intracellulare. Quindi, le sinapsi possono anche rispondere in relazione a diverse scale temporali consentendo ad una rete biologica di processare le informazioni adeguatamente. In natura esistono due tipi di sinapsi chimiche: le sinapsi inibitorie (IS), che tendono a iperpolarizzare la membrana cellulare attraverso la 26

1. Aspetti fondamentali di neurobiologia generazione di un Potenziale Post Sinaptico Inibitorio (IPSP) e le sinapsi eccitatorie (ES), che a differenza delle precedenti causano una depolarizzazione locale della membrana per mezzo della generazione di un Potenziale Post Sinaptico Eccitatorio (EPSP). Un tipico EPSP determina una depolarizzazione di circa 0,5mV, molto inferiore ai 15-20 mv richiesti per raggiungere il potenziale soglia e innescare il potenziale d azione; tuttavia, singoli EPSP possono combinarsi tra loro e permettere di ottenere risposte eccitatorie, esistono infatti due importanti principi che risultano essere spesso verificati: sommazione temporale : si verifica quando a livello di una singola sinapsi, arriva un secondo EPSP prima che gli effetti del primo siano scomparsi. sommazione spaziale: effetti cumulativi di più bottoni sinaptici. È spesso possibile che si verifichino contemporaneamente, nella stessa porzione di membrana cellulare, diversi EPSP e IPSP. Infatti, in ogni momento, le attività dei singoli neuroni riflettono un loro costante bilanciamento. La natura eccitatoria o inibitoria di una sinapsi è infine determinata dalla particolare specie di neurotrasmettitore con cui il recettore sinaptico interagisce. Infatti nel caso di una ES l interazione del neurotrasmettitore con i siti recettori di membrana provoca l apertura dei canali del sodio e del potassio (Na + /K + ). Tuttavia, poiché la corrente entrante del sodio è molto più grande di quella del potassio, l effetto risultante sul potenziale di membrana è una depolarizzazione (da qui la denominazione di sinapsi eccitatoria). A differenza delle ES, le IS provocano l apertura dei canali (Cl-) e del potassio (K + ). L effetto risultante, provocato dalla corrente del cloro e dalla corrente uscente del potassio, è una iperpolarizzazione locale della membrana. Recenti studi hanno messo anche in luce un legame curioso esistente tra l azione di uno stimolo e l efficacia delle connessione sinaptiche [Kan&Al03]. In questi studi si è visto che questa relazione varia se lo stimolo è somministrato ripetutamente. Questo legame tra stimolo ed efficacia sinaptica è considerata la base di partenza per costruire una teoria dell apprendimento. A tale proposito ha notevole rilevanza l ipotesi di Hebb secondo la quale, se un neurone A ed un neurone B tendono ripetutamente ad essere eccitati simultaneamente, questa concordanza di fase induce ad un aumento delle sinapsi tra A e B (si dice che la sinapsi venga rafforzata). Secondo questa ipotesi solo la 27

1. Aspetti fondamentali di neurobiologia correlazione tra l attività corrispettiva di due neuroni è responsabile del rinforzo delle sinapsi tra i due. Torniamo ora alla base dei meccanismi di funzionamento stanti alla base delle sinapsi chimiche e descriviamo rapidamente le differenti tipologie di neurotrasmettitore esistenti che di fatto sono utilizzate per trasdurre i diversi segnali neuronali. Il neurotrasmettitore più diffuso è certamente l acetilcolina, utilizzato da tutti gli assoni motori del midollo spinale. E anche il trasmettitore di tutti i neuroni autonomi pregangliari e delle fibre parasimpatiche. Oltre a questo, nel gruppo delle amine biogene vanno citate anche l acetilcolina, l adrenalina e la noradrenalina, facenti tutte parti del sottogruppo delle catecolammine; infine, ricordiamo anche la serotonina nonché l istamina. Tra i neurotrasmettitori eccitatori è bene ricordare l acido glutammico e l acido aspartico. La glicina, invece, è un amminoacido semplice che svolge il compito di neurotrasmettitore inibitorio così come l acido γ amminobutirrico (GABA). In sostanza, quindi, la conduzione lungo la fibra nervosa e quella attraverso le sinapsi sono profondamente differenti fra di loro. Nella fibra nervosa si propaga un segnale elettrico che, a livello delle sinapsi, viene trasformato in un segnale chimico (rilascio del neurotrasmettitore). Al di là delle sinapsi, successivamente, il segnale chimico ridiventa nuovamente un segnale elettrico in seguito a depolarizzazione o iperpolarizzazione. 1.6 Cosa sono le cellule staminali e perché un loro utilizzo Le cellule staminali sono cellule primitive, non specializzate, dotate della singolare capacità di assumere qualunque tipologia di cellula del corpo dell organismo considerato. Le cellule staminali (SC) sono quindi elementi indifferenziati che fungono da eventuale riserva per i differenti precursori dei tessuti. Giocano un ruolo omeostatico essenziale rimpiazzando cellule di tessuto morte o distrutte a causa di traumi o malattie. Esistono tre classi principali di cellule staminali: 1) Unipotenti: quando possono dare origine ad un solo tipo di cellula. Ad esempio, nel midollo osseo esistono cellule staminali che sono in grado di dare origine solo ai globuli rossi e non ai globuli bianchi. 28

1. Aspetti fondamentali di neurobiologia 2) Multipotenti (o Pluripotenti): quando possono dare origine a più tipi di cellule. Sempre nel midollo osseo, esistono delle staminali da cui originano più tipi di staminali unipotenti (per esempio, quelle che danno origine ai globuli rossi e quelle per i vari tipi di globuli bianchi) 3) Totipotenti: quando danno origine a tutte le possibili cellule di un determinato organismo. Attualmente è noto che solo le cellule che compongono l embrione ai primi stadi di vita (cellule staminali embrionali) possiedono questa capacità. La differenza tra queste cellule risiede nel differente grado di specializzazione. Infatti, prima che una cellula diventi adulta e maturi, deve passare attraverso fasi diverse di specializzazione. Perciò, le cellule staminali totipotenti danno origine a più cellule multipotenti, ciascuna delle quale dà origine a determinate cellule unipotenti che, infine, producono le cellule adulte. Le cellule staminali si classificano anche in base alla loro provenienza in: SC embrionali: sono ottenute a mezzo di coltura, ricavate dalle cellule interne di una blastocisti, ovvero un embrione non ancora cresciuto sopra le 150 cellule. Una volta isolate da blastocisti possono essere cresciute in vitro. In seguito, possono differenziarsi in diversi tipi cellulari senza causare problemi. Sono cellule dotate di una elevata capacità proliferativa e possono dare origine a tutti i tipi cellulari di un organismo. SC fetali: cellule staminali derivanti da aborti spontanei, possiedono caratteristiche intermedie fra quelle embrionali e quelle adulte. SC adulte: sono cellule non specializzate reperibili tra cellule specializzate di un tessuto specifico e sono prevalentemente multipotenti. Questi tipi di cellule sono già oggi utilizzate in cure per oltre cento malattie e patologie. Sono dette più propriamente somatiche (dal Greco σωµα sōma = corpo), perché non provengono necessariamente da adulti ma anche da bambini o da sangue placentare. Recentemente, alcuni ricercatori della New York University School of Medicine hanno avanzato un interessante ipotesi secondo la quale questi tipi di SC risultino essere più versatili rispetto ad altre cellule staminali. Infine, le SC adulte sono localizzabili in generale in tutto il corpo d un organismo. 29

1. Aspetti fondamentali di neurobiologia SC derivate da cordone ombelicale e midollo osseo: Il sangue residuo della placenta e del cordone ombelicale costituisce una fonte di cellule staminali emopoietiche adulte. Le cellule staminali da cordone ombelicale sono oggi impiegate per curare il morbo di Gunther, la sindrome di Hunter, la sindrome di Hurler e la leucemia linfocitica acuta. Alcuni medici statunitensi hanno anche identificato possibili cellule staminali provenienti dal midollo osseo di un adulto. Qualsiasi cellula staminale è caratterizzata inoltre da quattro proprietà funzionali fondamentali (figura 12): Stato indifferenziato (assenza di marcatori di lineage). Proliferazione (variazione ciclica dei prodotti genici). Capacità di automantenimento (generazione di almeno una cellula staminali ad ogni divisione cellulare). Multipotenzialità (capacità di generare una progenie funzionalmente differenziata). Figura 12: Proprietà delle cellule staminali Il primo carattere distintivo delle SC, comune a tutti i tipi di staminali, è il loro stato altamente indifferenziato. Questo significa che non possiedono le caratteristiche 30