Il monitoraggio aerobiologico: metodiche di routine e approcci molecolari

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1 Il monitoraggio aerobiologico: metodiche di routine e approcci molecolari Elisa Banchi & Claudio G. Ametrano Dipartimento di Science della Vita Università di Trieste 18 Aprile 2018

2 Aerobiologia Si occupa dello studio del trasporto degli organismi aerodiffusi e dei suoi effetti in ambienti aperti e confinati. Comprende lo studio delle particelle e componenti emessi direttamente dalla biosfera nell atmosfera: pollini, batteri, spore di funghi e felci, virus e frammenti di animali o piante.

3 Applicazioni Biodiversità Cambiamenti climatici Specie di interesse economico agronomico Piante e funghi patogeni o AIS Come indagare questi aspetti? Microscopia, morfologia, colture metodi molecolari: DNA barcoding, NGS, qpcr

4 Linee guida nazionali per il monitoraggio di pollini e spore fungine di interesse allergenico Campionatore volumetrico di tipo Hirst Pompa aspirante a portata costante (10 l/min -1 ) Tamburo campionatore con avanzamento (2 mm/h -1 ) Nastro ricoperto di silicone Calcolo della concentrazione media giornaliera (granuli*m -3 *d -1 )

5 Spore fungine: la forma di propagazione dei funghi Ci sono diversi tipi di spore: sessuate (ascospore, basidiospore - meiotiche, aploidi) e asessuate (conidiospore - mitotiche, aploidi o diploidi) Se presenti in alte concentrazioni (es. 100 Cladosporium spores l -1 ) possono causare patologie respiratorie e reazioni allergiche (Lacey,1996) Per riconoscerle al microscopio si utilizzano diversi caratteri (dimensione, forma, spessore della parete, presenza di setti, presenza di spine, colore)

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7 F. Borney; ARPA Valle d Aosta

8 Elaborazione del bollettino pollinico settimanale e del calendario pollinico L aggregazione dei dati giornalieri raccolti per i bollettini settimanali permette la redazione di un Calendario pollinico (annuale)

9 FRA-2016/17 Development of DNA meta-barcoding for the characterization of aerobiological samples Lucia Muggia, Alberto Pallavicini, Elisa Banchi, Claudio G. Ametrano, David Stankovic, Silvia Ongaro, Enrico Tordoni, Mauro Tretiach

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11 Microscopy Fungal DNA metabarcoding

12 DNA Barcoding Metodo tassonomico che usa una corta sequenza del DNA di un organismo per determinare la sua appartenenza ad una specie breve tratto di DNA variabile tra le specie conservato all interno della stessa specie semplice da amplificare e sequenziare GCTGTTGACTGCTA

13 Estrazione DNA Amplificazione (PCR)

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15 DNA Metabarcoding metodo di stima della biodiversità di campioni ambientali che combina: - DNA barcoding - Next Generation Sequencing (NGS)

16 Metabarcoding standard pipeline: Experimental design Sampling Raw reads DNA extraction Barcoding Library preparation NGS sequencing Molecular biology Quality filter Demultiplexing Chimera checking OTUs clustering Taxonomic assignment Normalization Bioinformatics WHO IS THERE??? Rarefaction curves Alpha diversity Beta diversity PCoA Statistics

17 I PCR II PCR Primer F Tail1 IIIIIII ITS2 IIIIIII Primer R Tail2 5 Primer F IIIIIII ITS2 + Tails IIIIIII P1 Amplicon (400 bp) Primer R ITS2 + Tails + BARCODE

18 ITS2 sequencing results ~ raw reads ~ (75%) passed quality filter (average 340 bp) ~ 34 chimeras ITS1 5.8S ITS2 rdna internal transcribed spacer

19 reads OTU 3 97% similarity clustering OTU 2 OTU1 Taxonomic assignment (blast) Alternaria alternata Cladosporium tenuissimum unidentified OTU = operational taxonomic unit

20 Rarefazione

21 Alfa e beta diversità

22 50 km

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24 Risultati 10 volte il numero di generi rispetto all analisi microscopica Rilevamento di licheni, specie invasive, patogeni animali e vegetali Alcuni taxa rilevati solo al microscopio Work in progress

25 Conclusioni: Microscopia Pro: quantitativo (poll/m 3 ) costi/tempi contenuti Contro: operatore-dipendente attribuzione tassonomica meno dettagliata (fam.) DNA metabarcoding Pro: accesso alla biodiversità totale attribuzione tassonomica più dettagliata operatore-indipendente Contro: costi/tempi elevati non quantitativo (da solo )

26 Grazie per l attenzione!