O.P. Grandi Colture Italiane s.c.a.

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1 O.P. Grandi Colture Italiane s.c.a.

2 Claudio Selmi, Renato Canestrale CRPV Centro Ricerche Produzioni Vegetali Il Gruppo Operativo MICOntrollo: i risultati conclusivi Bologna, 6 giugno 2019

3 Partner leader: C.R.P.V Centro Ricerche Produzioni Vegetali (Cesena) Imprese agricole O.P. Grandi Colture Italiane (Ferrara) Azienda Agraria Sperimentale Stuard (Parma) Ricerca UCSC - Università Cattolica Sacro Cuore (Piacenza) Di.Pro-Ve.S., responsabile scientifico Paola Battilani CRPA - Centro Ricerche Produzioni Animali (Reggio Emilia) O.P. Grandi Colture Italiane s.c.a.

4 Il progetto prevede la messa a punto di strategie di prevenzione e controllo del rischio di micotossine dalla fase di campo a quella di conferimento delle produzioni e di stoccaggio, fino alla possibilità di utilizzare per uso energetico quelle partite di mais con contenuto di micotossine superiore ai limiti di legge per l uso alimentare e mangimistico. Diverse delle innovazioni proposte derivano e sviluppano delle tematiche affrontate nel corso di una lunga serie di esperienze portate avanti da CRPV in collaborazione con il mondo della ricerca e della produzione cerealicola.

5 Alcuni dei Progetti di ricerca e sperimentazione sulle micotossine dei cereali finanziati principalmente dalla L.R 28/98 dell Emilia-Romagna: Fusariosi e micotossine ( ) Monitoraggio e riduzione micotossine mais ( ) MICOCER ( ) Progetto interregionale Agrotecnica e controllo micotossine mais ( ) Progetto di supporto all Assistenza Tecnica Mico-Inform ( ) Riduzione Rischio Contaminazione da Micotossine nei Cereali ( ) MYCO.PREV. Strategie per la prevenzione e il controllo delle micotossine nei cereali ( ) Definizione e aggiornamento di Linee Guida regionali (fase di campo) per la riduzione del rischio micotossine su mais e cereali autunno-vernini Linee guida per un piano di autocontrollo aziendale dalla fase di raccolta alla vendita post- stoccaggio del mais ad uso zootecnico finalizzato alla gestione del rischio contaminazione da aflatossine

6 Il progetto si articola su 5 diverse linee di sviluppo dell innovazione: Impiego di biocompetitori in campo per la riduzione del rischio aflatossine su mais Messa a punto di modelli previsionali multitossina su mais Verifica di impiego di metodiche analitiche rapide (naso elettronico) Tecnica di irrigazione del mais e micotossine Effetti della digestione anaerobica (biodigestori) sul mais contaminato da micotossine

7 Impiego di biocompetitori per la riduzione del rischio aflatossine su mais. Nel 2017 e 2018, l OP GCI, in collaborazione con le cooperative socie, ha provveduto all allestimento di 4 campi dimostrativi di mais nell areale ferrarese ponendo a diretto confronto delle aree difese (ordine grandezza: 1 ha) con il prodotto biologico AFX1, a base di Aspergillus non tossigeno, con analoghe superfici non trattate.

8 Messa a punto di modelli previsionali multitossina (fumonisine e aflatossine) su mais. L UCSC ha provveduto alla validazione di un modello previsionale multitossina su mais per la previsione della contaminazione da aflatossine e fumonisine durante la coltivazione e alla raccolta. A tal scopo sono stati raccolti, nel corso del triennio, circa 150 campioni di mais sotto trebbia, completi di dati colturali, presso diverse strutture di stoccaggio regionali.

9 Messa a punto di modelli previsionali multitossina (fumonisine e aflatossine) su mais. I risultati delle simulazioni, per le fumonisine e le aflatossine e per due epoche di emergenza, sono stati divulgati, tra luglio e agosto, tramite dei bollettini di rischio ad una mailing list comprendente rappresentanti del mondo produttivo, dell assistenza tecnica e istituzionale.

10 Verifica di impiego di metodiche analitiche rapide (naso elettronico). L UCSC, presso i propri laboratori, ha verificato l impiego di un naso elettronico (Airsense Analytics PEN3) volto alla determinazione di deossinivalenolo in frumento e aflatossine e fumonisine in mais. Per la taratura dello strumento, oltre ai campioni di mais prima citati, sono stati raccolti da GCI oltre 100 campioni di frumento.

11 Tecnica di irrigazione del mais e micotossine Nel 2017 e 2018, l'az. Agr. Sperim. Stuard di Parma ha allestito due prove di campo per porre a confronto due diverse modalità di irrigazione, aspersione e manichette, e tre volumi di restituzione idrica, ai fini di valutare l ottimizzazione della tecnica irrigua in un ottica di sostenibilità e di determinare quanto questa possa incidere sulla contaminazione da micotossine.

12 Infine, CRPA ha provveduto, nei suoi reattori da laboratorio, alla valutazione degli effetti della digestione anaerobica sul mais contaminato da micotossine e non utilizzabile altrimenti per scopi alimentari o mangimistici. In particolare ha verificato la percentuale di abbattimento dell aflatossina B1 dovuta al processo di digestione anaerobica.

13 Grazie per l attenzione Claudio Selmi - CRPV (Faenza RA) cselmi@crpv.it Piani di Innovazione: Il Gruppo Operativo MICOntrollo: i risultati conclusivi Bologna, 6 giugno 2019

14 Gruppo Operativo per l Innovazione MICOntrollo Effetti della digestione anaerobica sul mais contaminato da micotossine Mariangela Soldano, Sergio Piccinini Incontro tecnico Il gruppo Operativo MICOntrollo (Micotossine dei cereali): I risultati conclusivi giovedì 6 giugno 2019 Regione Emilia-Romagna Bologna CRPA Centro Ricerche Produzioni Animali Iniziativa realizzata nell ambito del Programma regionale di sviluppo rurale Tipo di operazione Gruppi operativi del partenariato europeo per l innovazione: produttività e sostenibilità dell'agricoltura Focus Area 2A Progetto Micotossine dei cereali: strategie di controllo e integrazione di filiera per uso energetico Coordinatore

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16 Azione 5 - integrazione filiera cerealicola e filiera biogas: micotossine e prodotti conformi per biodigestori. Fase 1: Definizione delle caratteristiche merceologiche e qualitative del «prodotto ad uso energetico». Verifica di eventuali effetti inibenti delle aflatossine sulla corretta funzionalità del processo di digestione anaerobica e le conseguenze sul processo biologico e sulla loro eventuale degradazione/inattivazione; verifica del livello di abbattimento rispetto alla concentrazione iniziale. Lo studio è stato condotto mediante lo svolgimento di test di digestione anaerobica in laboratorio

17 Reattori di laboratorio di digestione anaerobica con carico in continuo 4 reattori anaerobici (CSTR), 23 litri Alimentazione giornaliera Misura in continuo quantità biogas prodotto (metodo manometrico) Analisi biogas: CH4, CO2, H2S Bilancio di massa Mesofilia (40 C) Analisi chimiche (miscela in ingresso e digestato in uscita)

18 Protocollo di lavoro, materiali e metodi 1. Reperimento materiale naturalmente contaminato Materiali campionati AFB 1 AFB 2 AFG 1 AFG 2 [µg/kg] [µg/kg] [µg/kg] [µg/kg] Granella di mais 1 72,46 3,19 1,93 0,31 Granella di mais 2 34,45 1,73 5,37 < 0,05 Granella di mais 3 29,1 1,21 < 0,05 < 0,05 Granella di mais 4 115,6 15,1 < 0,05 < 0,05 Granella di mais 5 31,8 2,17 4,35 < 0,05 Spezzato di mais 6 195,9 7,08 < 0,05 < 0,05 Spezzato di mais 7 25,64 1,79 0,21 0,18 Granella di mais 8 276,4 ± 61,2 14,3 ± 4,2 2,1 ± 1,8 < 0,05 Granella di mais 9 941,6 ± 95,5 57,7 ± 7,5 83,3 ± 27,9 < 0,05 Granella di mais 10 21,2 ± 10,2 1,4 ± 0,4 0,8 ± 0,6 < 0,05 Metodo HPLC. LOD 0,05 µg kg -1 e LOQ 0,15 µg kg -1 for AFB 1. Analisi eseguite dall Università Cattolica di Piacenza, DISTA.

19 Protocollo di lavoro, materiali e metodi 2. Impostazione tesi e test in continuo Mix carico: Silomais (45%) + Liquame bovino (45%) + Farina di mais (10%) Farina di mais AFB 1 = 942 µg/kg Farina di mais AFB 1 = 21 µg/kg HRT = 45 giorni COV = 4,0 kg SV/giorno per m 3 di reattore Durata prova: 11 settimane Analisi Aflatossine Misura quantità e qualità

20 Protocollo di lavoro, materiali e metodi 3. Analisi biomasse al carico: silomais e liquame bovino AFB 1 AFB 2 AFG 1 AFG 2 [ g/kg] [ g/kg] [ g/kg] [ g/kg] Liquame bovino 1* 11,1 7,6 0,39 < 0,05 Liquame bovino 2* < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 Media 5,6 3,8 0,2 < 0,05 Dev.st. 7,8 5,4 0,2 0 Silomais 1* < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 Silomais 2* 0,7 < 0,05 < 0,05 < 0,05 Media 0,4 < 0,05 < 0,05 < 0,05 Dev.st. 0, *Le analisi si riferiscono a campioni essiccati a 50 C.

21 Risultati 1. L efficienza di processo risente della presenza delle micotossine? Non si sono osservati effetti di inibizione del processo biologico; i risultati della produzione in biogas delle tesi con farine con alta contaminazione non sono significativamente differenti dal risultato ottenuto dalla tesi con contaminazione trascurabile (controllo). Produzione specifica di metano media e dev.st. misurata nei reattori alimentati con la miscela costituita da farina di mais contaminata da AFB 1, silomais e liquame bovino. Percentuale di metano nel biogas media misurata nei reattori alimentati con la miscela costituita da farina di mais contaminata da AFB 1, silomais e liquame bovino.

22 Risultati 2. La digestione anaerobica è in grado di ridurre l entità di contaminazione da micotossine nelle condizioni di processo adottate? Non sono stati misurati effetti di accumulo come conseguenza del carico giornaliero di micotossine e la concentrazione di AFB 1 misurata nei digestati è risultata inferiori a quella attesa. Nelle condizioni di prova (farina pari al 10% in peso tal quale della dieta giornaliera), l abbattimento misurato della AFB 1 è risultato, per le tesi altamente contaminata, mediamente del 91% della quantità caricata. Confronto tra la concentrazione media attesa e la concentrazione media misurata di AFB 1 nei digestati estratti dai reattori pilota nelle ultime quattro settimane del test.

23 Conclusioni L efficienza del processo di digestione anaerobica non risente della presenza delle micotossine; l abbattimento misurato della AFB 1 è risultato mediamente del 91% della quantità caricata; i risultati ottenuti confermano quanto verificato nella precedente sperimentazione condotta da CRPA nell ambito del progetto Biogas micotossine clostridi, finanziato dalla regione Emilia Romagna nel Inoltre concordano anche con altri studi in cui la quantità e la qualità del biogas non risulta influenzata dalla presenza di AFB 1 nei substrati di alimentazione (De Gelder et al., 2017, Salati et al., 2014); un ulteriore verifica su cui bisognerebbe indagare è la eventuale presenza di metaboliti intermedi da degradazione delle AFB 1.

24 Grazie per l attenzione! m.soldano@crpa.it Incontro tecnico Il gruppo Operativo MICOntrollo (Micotossine dei cereali): I risultati conclusivi giovedì 6 giugno 2019 Regione Emilia-Romagna Bologna Iniziativa realizzata nell ambito del Programma regionale di sviluppo rurale Tipo di operazione Gruppi operativi del partenariato europeo per l innovazione: produttività e sostenibilità dell'agricoltura Focus Area 2A Progetto Micotossine dei cereali: strategie di controllo e integrazione di filiera per uso energetico Coordinatore

25 Biocontrollo e modelli per la prevenzione della contaminazione da micotossine Paola Battilani, Marco Camardo Leggieri Dipartimento di Scienze di Produzioni Vegetali Sostenibili, Piacenza, Italy

26 Attività previste dal progetto Biocontrollo Aspergillus flavus Modelli previsionali Naso elettronico

27 Aspergillus flavus & aflatossine Stress Tmin Tmax Topt a w min Crescita Produzione AF Gary Payne, N. C. State University

28 A. flavus, comunità complessa Funghi tossigeni e atossigeni coesistono Ci sono diversi gruppi genetici I gruppi genetici hanno un sistema che limita lo scambio di geni

29 Biocontrollo A. flavus Esclusione per competizione Ceppi produttori di aflatossine Ceppi non produttori di aflatossine

30 Cosa è stato cercato Funghi autoctoni, naturalmente presenti e diffusi nel territorio Non tossigeni (senza i geni necessari alla produzione) Forti competitori con i ceppi tossigeni Efficaci in pieno campo, facili da utilizzare

31 Applicazione di campo Fase fenologica BBCH 33-39, dopo la lavorazione Distribuzione con spandiconcime

32 Cos è AF-X1 Aspergillus flavus MUCL54911 AF-X1 è UN FITOFARMACO BIOLOGICO 2.1 Classificazione della sostanza o miscela Il prodotto non è classificato pericoloso ai sensi delle disposizioni di cui alle Direttive 67/548/CEE e 1999/45/CE e/o del Regolamento CE 1272/2008 (CLP e successive modifiche ed adeguamenti Dal punto di vista tecnico AF-X1 è sorgo devitalizzato conciato con spore del ceppo selezionato di Aspergillus

33 Prove di campo progetto PSR

34 AF-X1, la storia Raccolta isolati Caratterizzazione isolati Prove in campo Selezione candidato Deposito ceppo Deposito brevetto OK Distribuzione in pieno campo DOSSIER

35 Modelli previsionali Basati sul ciclo d infezione del patogeno INPUT dati meteorologici orari(t, UR e pioggia) OUTPUT prevedere tutti gli step del ciclo d infezione del patogeno e rischio di contaminazione di micotossine alla raccolta

36 Modelli meccanicistici disponibili per micotossine FER-maize 2003 Fusarium verticillioides Battilani et al., 2003 AFLA-maize 2012 Aspergillus flavus Battilani et al., 2012 DON-maize F. graminearum

37 Applicazione in Emilia Romagna Previsioni di rischio settimanali Raccolta 50 campioni/anno Analisi micotossine (AFLA e FUMO) Validazione modelli previsionali

38 Applicazione in Emilia Romagna 100% 75% Modello AFLA meteo Modello AFLA meteo + tec. colturali 100% 80% 75% 50% 25% 0% 47% 39% 14% Sottostime Corrette Sovrastime 50% 25% 0% 14% 6% Sottostime Corrette Sovrastime Importanza del ruolo delle tecniche colturali sulle 100% 75% Modello FER meteo 63% 100% 75% Modello FER meteo + tec. colturali 80% previsioni di rischio 50% 34% 50% 25% 25% 17% 0% 3% Sottostime Corrette Sovrastime 0% 2% Sottostime Corrette Sovrastime

39 Nuove sfide Cambiamento climatico Co-presenza Battilani et al., 2016 Ibanez-Vea et al., 2012

40 Studi d interazione fungina In-vivo In-vitro

41 Effetto dell interazione nei modelli previsionali Rischio fumonisine B1+B2 FER-maize apr 1-mag 31-mag 30-giu 30-lug 29-ago 28-set Stagione colturale FV è più sensibile alla presenza di AF, Variazione sulle performance del 77% FER_sing FER_inter Rischio AFB1 AFLA-Maize apr 1-mag 31-mag 30-giu 30-lug 29-ago 28-set Stagione colturale AF meno sensibile alla presenza di FV Variazione sulle performance del 39% AFLA_sing AFLA_inter

42 Il naso elettronico Il naso elettronico è uno strumento costituito da una serie di sensori elettronici con specificità parziale e un sistema di riconoscimento capace di riconoscere odori semplici o complessi

43 Naso elettronico Consists of 3 basic building blocks: Spazio di testa Conversione Set di segnale Software sensori sensore analisi dati campione

44 Naso elettronico Consists of 3 basic building blocks:

45 Marco Camardo Leggieri Paola Giorni Terenzio Bertuzzi Amedeo Pietri In collaborazione con