Soluzioni Biorazionali per il controllo ecosostenibile di Zanzare e Simulidi

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1 Soluzioni Biorazionali per il controllo ecosostenibile di Zanzare e Simulidi Caratteristiche e modalità applicative dei formulati a base di Bacillus thuringiensis subsp. israelensis e Bacillus sphaericus

2 Sumitomo Chemical Italia Srl SOLUZIONI BIORAZIONALI PER IL CONTROLLO ECOSOSTENIBILE DI ZANZARE E SIMULIDI Caratteristiche e modalità applicative dei formulati a base di Bacillus thuringiensis subsp. israelensis e Bacillus sphaericus Nessuna parte di questa pubblicazione può essere riprodotta, memorizzata o trasmessa in nessun modo o forma, sia essa elettronica, elettrostatica, fotocopie, ciclostile ecc., senza il permesso scritto di Sumitomo Chemical Italia Srl. L Editore è a disposizione degli aventi diritto con i quali non è stato possibile comunicare, nonchè per eventuali involontarie omissioni o inesattezze nella citazione delle fonti e delle illustrazioni riprodotte nel seguente volume. Finito di stampare nel mese di novembre 2013

3 Sommario Introduzione Parte generale Prefazione Sumitomo Chemical Valent BioSciences Corporation Il valore dei larvicidi Biorazionali di Valent BioSciences nei programmi di controllo integrato Larvicidi VBC registrati in Italia Controllo qualità e standardizzazione Definizione del ceppo nei larvicidi microbiologici...18 Bacillus thuringiensis subsp. israelensis Generalità Caratteristiche biologiche Meccanismo d azione Specie bersaglio Efficacia in condizioni di campo Specie non bersaglio Specie di zanzara controllate con i formulati a base di Bti in condizioni di campo Bacillus sphaericus Generalità Caratteristiche biologiche Meccanismo d azione Specie bersaglio Efficacia in condizioni di campo Persistenza d azione Resistenza nelle specie bersaglio Specie non bersaglio Fauna non bersaglio testata e risultata non sensibile a Bsph Combinazione tra Bti ceppo AM65-52 e Bsph ceppo ABTS Informazioni tossicologiche ed ecotossicologiche Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ceppo AM Bacillus sphaericus ceppo ABTS Indicazioni operative per la corretta distribuzione dei larvicidi Calibrazione di irroratori spalleggiati Misurazione della velocità di avanzamento Misurazione della fascia trattata Misurazione del volume di irrorazione Standardizzazione operativa Gestione della lotta larvicida e valutazione dell efficacia Mappatura dei focolai larvali Valutazione di efficacia dei trattamenti VectoMax FG VectoMax FG: prove sperimentali condotte in Italia Leinì (TO) Marano di Castenaso (BO) Padova Firenze VectoBac 12AS Teknar SC VectoBac WG VectoBac G VectoBac DT

4 Sommario Parte speciale Le zanzare: classificazione scientifica Morfologia Ciclo biologico Schede delle principali specie presenti sul territorio italiano Le zanzare: genere Aedes Aedes geniculatus Aedes albopictus Aedes (Ochlerotatus) rusticus Aedes vexans Aedes (Ochlerotatus) detritus Aedes (Ochlerotatus) mariae - Aedes (Ochlerotatus) zammitii Aedes (Ochlerotatus) caspius Le zanzare: genere Culex Culex modestus Culex theileri Culex pipiens molestus Le zanzare: genere Anopheles Anopheles atroparvus Anopheles claviger Anopheles superpictus Anopheles labranchiae Anopheles plumbeus Le zanzare: genere Coquillettidia Coquillettidia richiardii Le zanzare: genere Culiseta Culiseta annulata Principali malattie trasmesse dalle zanzare Malaria Dengue Febbre da Chikungunya Febbre del Nilo Occidentale Febbre gialla Filariosi I Simulidi: classificazione scientifica Morfologia Ciclo biologico Principali malattie trasmesse dai Simulidi L oncocercosi Il controllo dei Simulidi Bibliografia Contatti e ringraziamenti

5 Prefazione Il miglioramento della qualità della vita e il conseguente aumento della sensibilità dei cittadini alla molestia delle zanzare ha determinato l esigenza di contenerne la popolazione adulta a livelli molto bassi. La lotta biologica contro i vettori di malattie ha recentemente avuto un rinnovato impulso dopo la presa di coscienza dei problemi tossicologici e di resistenza posti dalla lotta chimica tradizionale. I batteri sporigeni entomopatogeni hanno offerto in particolare una opportunità maggiore di realizzazione di tali interventi contro i Culicidi, in confronto alle possibilità pratiche offerte dagli altri organismi patogeni, associati agli stadi larvali di varie specie di zanzare. Le proprietà di questi Biocidi sono state studiate sotto vari aspetti. Tali studi hanno permesso di prendere in considerazione i formulati a base di batteri sporigeni per la lotta antivettoriale. La lotta larvicida con l ausilio di preparati microbiologici assicura buona efficacia, impatto ambientale estremamente ridotto, rischi tossicologici per l uomo assenti e costi di gestione accettabili. L agente di controllo microbiologico più utilizzato finora è il Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (Bti), il cui impiego si è progressivamente diffuso anche nel nostro Paese. Negli ultimi anni, grazie all impegno nella ricerca di Valent BioSciences Corporation (VBC), è stato possibile ampliare le possibilità nel campo della lotta a basso impatto ambientale in modo da disporre prodotti alternativi in grado di meglio soddisfare le esigenze applicative. Nei focolai inquinati, in particolare nelle tombinature stradali, popolati da Culex pipiens e Aedes albopictus, sono necessari prodotti che offrono un controllo residuale prolungato per entrambe le specie considerando che, fino ad oggi, nessun larvicida batterico ha fornito la necessaria persistenza d azione. Questa tecnologia offre, agli operatori del settore, la possibilità di sfruttare i punti di forza dei due larvicidi microbiologici, riducendo significativamente i limiti che ognuno di essi possiede. Per le sue peculiari caratteristiche, VectoMax FG garantisce quindi un controllo larvale con elevata residualità, senza nessun rischio tossicologico e ambientale, sia nelle aree urbane per i trattamenti delle caditoie stradali che in quelle rurali ed agricole. Mantenendo un taglio tecnico-divulgativo ho cercato di coniugare una precisa impostazione scientifica con una esposizione semplice e chiara, augurandomi che il lavoro svolto e l impegno profuso trovi un adeguato apprezzamento e rappresenti un valido contributo per l impiego dei larvicidi microbiologici. Vorrei inoltre ringraziare tutte le persone che mi hanno aiutato e mi sono state vicine durante la realizzazione di questo lavoro. Roberto Barbolini PM prodotti Biorazionali VBC Sumitomo Chemical Italia Srl La necessità di dover utilizzare prodotti con maggiore persistenza ha stimolato i ricercatori verso il Bacillus sphaericus (Bsph) in grado di persistere potenzialmente per lungo tempo negli ambienti dove si sviluppano le larve. VectoMax FG è un innovativo formulato che combina attraverso la tecnologia BioFuse, sviluppata e brevettata da Valent BioSciences Corporation, i due principi attivi a base di Bti e Bsph all interno di ogni singola microparticella. RIDUCI IL RISCHIO è la campagna di prevenzione promossa da Sumitomo Chemical Italia contro gli insetti vettori di malattie 7

6 Introduzione Un grande protagonista della chimica globale, che controlla oltre 100 aziende in tutti i continenti Sumitomo Chemical affonda le sue origini nella storia stessa del Giappone, passando attraverso tutta l evoluzione storica ed economica di questo grande Paese. Gli inizi partono da Masatomo Sumitomo ( ), il fondatore, che agli inizi del XVII secolo aprì un negozio di libri e di medicine a Kyoto in un periodo estremamente complesso della storia del Giappone, che vide il consolidarsi dell unità del Paese sotto la dinastia Tokugawa, nel periodo Edo, che si protrasse fino al 1868, ed il definitivo affermarsi di Tokyo come capitale del paese. Contemporaneamente la dinastia affermava il proprio potere attraverso un progressivo isolamento del paese dall esterno, rendendo le risorse interne sempre più importanti. In questi anni Masatomo elaborò i precetti di condotta negli affari che ancora oggi ispirano lo Spirito di Sumitomo. Nel frattempo un consuocero di Masatomo, Riemon Soga ( ) inventò e sviluppò una tecnologia di lavorazione del rame grezzo chiamata Nanban-buki che consentiva la separazione del minerale d argento contenuto nel minerale di estrazione del rame. Il metodo consisteva nella fusione del minerale di estrazione del rame con il piombo che portava alla separazione del rame e dell argento, che si fissava al piombo. Da qui poi i due minerali venivano separati e quindi lavorati. Il metodo di lavorazione fu di estremo successo e portò tutto il minerale di rame del Giappone ad essere lavorato nella zona di Osaka, dove Riemon Soga aveva installato il proprio impianto di lavorazione. La tecnica veniva tra l altro insegnata gratuitamente a tutti, e questo portò al sorgere di diversi impianti di lavorazione. L attività venne sviluppata da Tomomochi Sumitomo ( ), il figlio maggiore di Riemon, che divenne un membro della casa di Sumitomo sposando una figlia di Masatomo, e nel 1636 costruì la più 8

7 Introduzione grande raffineria di rame del Giappone a Nagahori, nella provincia di Osaka, dove esisteva una grande disponibilità di acqua, indispensabile al processo di raffinazione. Questo impianto lavorava circa un terzo di tutto il rame del Giappone, attraverso l attività di 100 diversi forni che producevano un rame puro al 99,9% per un periodo di circa 300 anni. Anche quando il Giappone si chiuse al resto del mondo, il rame fu l unico prodotto ad essere esportato in Olanda, Cina, Corea fino all India ed all Europa, dove il rame veniva utilizzato per le monete, prodotti militari, sartiame ed altro. Dopo avere sviluppato le tecniche di raffinazione del metallo grezzo, la famiglia si dedicò alle miniere di rame, e nel 1691 venne aperta la miniera di Besshi, che continuò la sua attività per 283 anni, fino al Passando attraverso caotici periodi di lotte politiche interne, la miniera di Besshi sviluppò rapidamente le proprie capacità produttive adottando tecnologie provenienti dall occidente e, soprattutto, diversificando le proprie attività nel settore manifatturiero, del carbone, dei cavi elettrici e delle foreste. Per dare continuità a tutte le iniziative avviate fu necessario creare un sistema bancario autonomo che trovava alimento in un sistema di depositi in cui conservare le varie merci che costituivano la garanzia del sistema stesso. Ben presto questo sistema bancario divenne autonomo, per cui si costruì un impresa finanziaria moderna che si focalizzava su due aree, una prima mineraria e manifatturiera ed una seconda bancaria. Nell evoluzione delle attività della Casa di Sumitomo nel 1913 ci si trovò ad affrontare un problema complesso di smaltimento di residui dell attività di estrazione del rame. Per questo venne aperto un impianto per la produzione di fertilizzanti che si ottenevano dalla lavorazione del solfuri di scarto delle operazioni di fusione. Nel 1915 i primi quantitativi di fertilizzanti lasciavano l impianto di Niihama, nella prefettura di Ehime. Nel 1925 l attività prende il nome di Sumitomo Fertilizer Manufacturing Co. Ltd., che diviene definitivamente Sumitomo Chemical Co. Ltd. nel Nel 1944 viene acquisita la Japan Dyestuff Manufacturing Company, una fabbrica di coloranti, che porta ad una prima diversificazione di attività nei coloranti e nel settore farmaceutico. Altra importante acquisizione nel 1949, con l incorporazione delle attività della Sumitomo Aluminium Smelting Co. Ltd.. Nel 1958 Sumitomo Chemical inizia la produzione di etilene e di altri derivati del petrolio, iniziando così un nuovo settore di business. È invece del 1971 l inaugurazione dei laboratori di ricerca di Takarazuka, che rappresentano il centro più importante per lo sviluppo dei prodotti per la farmaceutica e per l agricoltura. Nel gennaio del 2000 Sumitomo Chemical Company acquisisce la divisione Agricultural Specialties Business dalla Abbott Laboratories, nasce così la divisione Valent BioSciences Corporation (VBC) leader mondiale nella ricerca, sviluppo e commercializzazione di tecnologie compatibili con l ambiente per l agricoltura, selvicoltura e salute pubblica. E così fino ai giorni nostri, con l acquisizione nel gennaio 2011 del 100% della joint venture in Isagro Italia Srl, costituita nel 2002 insieme ad Isagro SpA ed ora Sumitomo Chemical Italia Srl. Oltre 400 anni di storia sono alle spalle di Sumitomo Chemical, durante i quali il successo dell Azienda si è sempre basato sui principi del fondatore. I principi di comportamento di Sumitomo nelle proprie attività sono due: 1 Sumitomo raggiungerà la prosperità costruendo su solide fondamenta dando primaria importanza all integrità ed al comportamento corretto nella gestione dei propri affari; 2 L interesse di Sumitomo deve sempre essere in armonia con gli interessi della società; Sumitomo si deve adattare ai tempi buoni ed a quelli cattivi ma non perseguirà mai affari immorali. Sumitomo deve quindi operare in modo da avere sempre la fiducia dei propri partner e della società civile, astenendosi dai facili guadagni ma operando attivamente attraverso la ricerca seria ed approfondita, grazie a meditate decisioni strategiche. Tutto questo deve essere realizzato in armonia con tutti: la Società, la Nazione e gli altri operatori economici, oltre alle persone che lavorano e vivono con Sumitomo Chemical. Da questi principi deriva la filosofia di Sumitomo: 1 Creare valore attraverso la ricerca innovativa; 2 Migliorare la Società grazie al nostro lavoro; 3 Costruire un ambiente lavorativo stimolante per continuare ad essere una Azienda sulla quale la Società possa contare. Sumitomo Chemical dà quindi primaria importanza all integrità ed alla gestione sana dell impresa, con l idea di sapersi adattare ai momenti buoni ed a quelli cattivi, senza perseguire mai attività illecite, con l obiettivo di restituire sempre allo Stato ed alla Società civile le opportunità ottenute, con l obiettivo di creare mutua prosperità nel rispetto del bene pubblico. Sumitomo Chemical vuole dunque creare valore per la Società nella quale opera attraverso la propria capacità economica e di innovazione, in un ambiente caldo e partecipativo per essere un punto di riferimento per tutti. La visione di Sumitomo Chemical è: Costruiamo un domani migliore grazie all innovazione nella chimica. 9

8 Introduzione Valent BioSciences Corporation, leader mondiale nello sviluppo di prodotti Biorazionali Valent BioSciences Corporation (VBC) è leader mondiale nella ricerca, sviluppo e commercializzazione di tecnologie eco-compatibili e basso imbatto ambientale per l agricoltura, selvicoltura e salute pubblica. Attraverso le biotecnologie, Valent BioSciences sviluppa prodotti biorazionali creando valore aggiunto alfine di offrire soluzioni innovative per i suoi clienti in tutto il mondo. Questi prodotti includono i bioinsetticidi e fitoregolatori (regolatori di crescita delle piante o bioregolatori) di origine naturale o di sintesi chimica che, per le loro caratteristiche, possono essere utilizzati nel rispetto dell ambiente, dell utilizzatore e del consumatore finale. Il successo di VBC è legato alla presenza di stabilimenti di produzione e formulazione specializzati in questo settore nonché alla pluriennale esperienza nella ricerca, sviluppo e posizionamento dei prodotti sul mercato. Proprietà intellettuale 70 brevetti per le diverse unità di business, 240 brevetti rilasciati marchi registrati in 125 Paesi 725 etichette 800 prodotti registrati in 94 Paesi Insetticidi Microbiologici per uso agricolo Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki ceppo ABTS-351 marchio principale DiPel : controllo biologico delle larve di lepidotteri in frutticoltura, viticoltura, orticoltura e coltivazioni erbacee. Bacillus thuringiensis subsp. aizawai ceppo ABTS marchio principale XenTari : controllo biologico delle larve di lepidotteri nottuidi in orticoltura e nelle 10

9 Introduzione coltivazioni erbacee. Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis ceppo NV-175 marchio Novodor : controllo biologico della Dorifora della patata. Myrothecium verrucaria marchio DiTera : controllo biologico di nematodi su banana, vite, colza e tappeti erbosi. Fitoregolatori Acido Gibberellico (GA3) marchi principali ProGibb, Berelex, RyzUp : incremento della resa e della qualità di uva da tavola, agrumi, ciliegio ed orticole. Usato per migliorare la qualità dei frutti su un ampia gamma di colture. Promuove la crescita vegetativa incrementando la produzione. Gibberelline (GA4-7) marchio principale Regulex : riduzione della rugginosità e miglioramento della forma nei frutti di melo. 6-Benziladenina (6-BA) marchio principale MaxCel : diradamento chimico del melo, aumento del diametro dei frutti e stimolo del ritorno a fiore. Gibberelline (GA4-7) / 6-Benziladenina (6-BA) marchio principale Promalin : miglioramento della forma dei frutti, aumento dimensione e riduzione della rugginosità delle mele. Incremento dell allegagione sulle pere. Amminoetossivinilglicina (AVG) marchio ReTain : gestione della maturazione e ottimizzazione della raccolta, incremento qualità e conservazione delle mele. Acido S-Abscissico (S-ABA) marchio principale ProTone : anticipo della colorazione nelle varietà rosse di uva da tavola senza semi. Aumento della tolleranza allo stress nelle piante attraverso il controllo della chiusura degli stomi, in relazione alla disponibilità idrica e all attività fotosintetica. Selvicoltura Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki ceppo ABTS-351 marchio principale Foray : controllo biologico delle larve dei principali lepidotteri defogliatori come Limantria, Processionaria del pino e della quercia. Salute Pubblica Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ceppo AM65-52 marchio principale VectoBac : controllo biologico delle larve di zanzare e Simulidi. Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ceppo SA3A marchio Teknar : controllo biologico delle larve di zanzare. Bacillus sphaericus ceppo ABTS-1743 marchio VectoLex : controllo biologico delle larve di zanzare delle specie Culex, Aedes, Psorophora e Anopheles con azione residuale. Bacillus sphaericus 2362 ceppo ABTS Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ceppo AM65-52 marchio VectoMax : controllo biologico residuale delle larve di numerose specie zanzare in diversi habitat. S-methoprene marchio MetaLarv : controllo delle larve di zanzare per la gestione delle aree in cui si verificano ciclicamente periodi di siccità ed inondazioni. 11

10 Introduzione In Valent BioSciences, la tutela della salute pubblica è un fatto NATURALE Il business e la tecnologia oltrepassano sempre più le frontiere internazionali e viaggiare per il mondo è diventato una consuetudine. Questo significa che la nostra lotta contro gli insetti vettori di malattie è ora più importante che mai. L approccio tradizionale della lotta a questi insetti unicamente tramite metodi chimici non ha solo prodotto danni indesiderati all ambiente, ma ha anche portato a un aumento della resistenza nelle specie bersaglio. In Valent BioSciences crediamo che sia sempre meglio lavorare in armonia con la natura anziché contro di essa. Nelle pagine di questa brochure troverete l offerta più completa del settore con soluzioni biorazionali specifiche per il controllo ecosostenibile degli insetti dannosi. In qualità di leader globale nel settore della salute pubblica, il nostro obiettivo è contribuire alla realizzazione del potenziale umano unendo l arte e la scienza nel controllo sostenibile degli insetti per le attività di bonifica nel mondo. Siamo consapevoli che raggiungere un efficace controllo richiede anni di esperienza. Non esiste una valida risposta per tutte le situazioni, ma quando strumenti sostenibili sono nelle mani di professionisti affidabili è naturale che la campagna di lotta per la salute pubblica risulti efficace. Ci auguriamo che le informazioni presentate in questo lavoro siano di utilità nella lotta agli insetti vettori di malattie. Continuiamo a lavorare per estendere il nostro impegno alla difesa dei principi attivi nel processo di revisione europea dei Biocidi e per trovare nuovi modi per aiutarvi a raggiungere il vostro obiettivo di tutela della salute pubblica e di prosperità nella vostra comunità. Cordiali saluti, Ernest M. Dankwa Senior Global Business Manager PUBLIC HEALTH and FORESTRY BUSINESS UNIT 12

11 Parte generale Il valore dei larvicidi Biorazionali di Valent BioSciences nei programmi di controllo integrato L approccio integrato è la strategia più efficace per il controllo delle zanzare. La sfida nel controllo delle zanzare è un problema continuo. Questo problema esiste non solo in regioni in sviluppo o zone rurali, ma anche dove converge lo sviluppo urbano come le aree agricole irrigate e acquitrinose che costituiscono habitat primari per lo sviluppo delle larve di zanzara. Un programma integrato di lotta alle zanzare si articola in tre tipologie:» Riduzione dei focolai» Lotta larvicida» Lotta adulticida Ciascuna di queste tecniche gioca un ruolo decisivo nel controllo zanzare sia nella riduzione del disturbo arrecato che nel controllo vettoriale di malattie. Riduzione dei focolai La riduzione dei focolai può essere considerata la forma permanente di controllo delle zanzare perché elimina o riduce gli habitat di sviluppo e riproduzione. Molte specie di zanzare si sviluppano in presenza di acqua stagnante, la riduzione dei focolai include quindi la rimozione dei recipienti di raccolta dell acqua come innaffiatoi, bidoni, pneumatici, etc. Per questa strategia, riduzione è il termine più appropriato in quanto è pressoché impossibile eliminare tutte le fonti di acqua stagnante in un determinato territorio. Lotta larvicida Gli interventi larvicidi sono ampiamente considerati il sistema più efficace nel controllo delle zanzare. Questi interventi hanno lo scopo di uccidere le larve di zanzara prima che diventino adulti e possano disperdersi nell ambiente. I programmi anti larvali stanno assumendo una maggiore importanza con un diffuso consenso dovuto alla facilità nel sopprimere le popolazioni di zanzare nelle fasi più vulnerabili del loro ciclo di sviluppo. Rispetto agli adulti, le larve di zanzara sono: Lotta adulticida Le zanzare adulte sono responsabili della trasmissione di malattie. Pertanto, qualsiasi programma di lotta contro le malattie trasmesse da vettori deve prevedere una componente di trattamenti adulticidi. Anche se questi interventi non sono efficaci come le altre forme di controllo, sono da considerarsi l estremo rimedio possibile per la difesa. Il prodotto giusto per ogni habitat e specie Un efficace programma di controllo delle zanzare dipende dall interazione di più variabili che sono la chiave determinante delle potenziali soluzioni in una gamma spesso ristretta di soluzioni in cui ci si trova ad operare.» Specie di zanzara: introduce gli elementi biologici e comportamentali per la soluzione» Habitat: la conoscenza dell ambiente in cui si trova l insetto target è essenziale nell individuare il metodo di controllo più efficace» Metodo di applicazione: in funzione della specie e dell habitat da trattare così come della durata dell applicazione Solamente prendendo in considerazione tutte queste variabili può essere identificata la soluzione migliore. Specie di zanzara SOLUZIONE» Concentrate: raggruppate in piccole aree» Immobili: non volano spostandosi da un luogo ad un altro» Accessibili per il controllo: non rimangono fuori dalle aree trattate Habitat Metodo di applicazione 13

12 Parte generale Specie di zanzara Genere Problemi sanitari Caratteristiche Aedes Specie presenti in acque alluvionali: disturbo, reazioni allergiche, Filariosi, Febbre della Rift Valley Specie presenti presenti in contenitori artificiali e/o naturali: Dengue, Febbre gialla, Chikungunya Le uova sono deposte sul terreno delle aree soggette a periodici allagamenti e possono sopravvivere per lunghi periodi. Quando si verificano inondazioni si schiudono le uova e si sviluppano rapidamente gli adulti causando grandi infestazioni. Le uova sono deposte sulle pareti dei contenitori appena sopra il livello dell acqua e si schiudono a seguito dell innalzamento dello stesso. Anopheles Culex Malaria Febbre del Nilo Occidentale, Febbre della Rift Valley, Filariosi, Encefalite Principale vettore della malaria nelle regioni tropicali e temperate. Generalmente la femmina preferisce nutrirsi pungendo l uomo con maggiore frequenza poco prima dell alba e subito dopo il tramonto. Depone le singole uova dotate di strutture galleggianti sulla superficie dell acqua o ai bordi sul suolo bagnato. Genere più diffuso di zanzara nel mondo. In molte specie le femmine pungono uccelli e mammiferi. Depone le uova in zattere direttamente sulla superficie di acqua dolce o stagnante. Si adatta anche ad habitat con presenza di acqua inquinata. Habitat Ecosistemi Aree di riproduzione Habitat aperti con scarsa presenza di vegetazione Habitat con presenza di vegetazione Siti d acqua permanenti Aree alluvionali Contenitori di raccolta dell acqua artificiali e/o naturali bacini idrici naturali, pianure alluvionali, zone umide, etc. risaie, aree paludose, canali, boschi, etc. paludi, laghetti, stagni, etc. zone soggette a inondazioni per brevi periodi durante l anno. serbatoi di raccolta acqua, secchi, depositi di pneumatici, etc. Metodo di applicazione* Dimensione dell area piccola Habitat aperti con scarsa presenza di vegetazione Formulazioni: liquide e microgranulari Pompa a mano o spalleggiata, atomizzatore spalleggiato Habitat aperti con presenza di vegetazione Formulazioni: granulari Atomizzatore spalleggiato con kit per granuli media Atomizzatore autotrasportato Spandiconcime, lancia a pressione grande Mezzi aerei (controllo GPS) con ugelli configurati per ridurre le gocce di piccole dimensioni (<150 µm) Mezzi aerei (controllo GPS) equipaggiati per la dispersione dei granuli con rotore ad ala fissa o montata * I larvicidi di VBC sono disponibili in diverse formulazioni per soddisfare le esigenze specifiche di ogni applicazione. Questa tabella fornisce le linee guida per applicazioni tipiche, anche se queste possono variare o essere adattate alle legislazioni vigenti nei diversi Paesi. 14

13 Parte generale Larvicidi VBC registrati in Italia VBC possiede la più ampia gamma di larvicidi biorazionali specifici per il controllo delle zanzare. Questi larvicidi microbiologici a base di Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (Bti, ceppi AM65-52 e SA3A) e Bacillus sphaericus (ceppo ABTS-1743) sono ormai diventati parte integrante in molti programmi integrati di controllo delle zanzara in tutto il mondo. Le formulazioni disponibili sono state studiate per essere impiegate negli habitat più appropriati alfine di garantire una mortalità delle larve compresa tra il 95% e il 100%, a seconda della specie e quando applicati secondo le dosi raccomandate in etichetta. Prodotto Principio attivo Target Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ceppo AM UTI/mg Culicidi Simulidi Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ceppo SA3A UTI/mg Culicidi Simulidi Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ceppo AM UTI/mg Culicidi Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ceppo AM UTI/mg Culicidi Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ceppo AM65-52 Bacillus sphaericus ceppo ABTS Bsph UTI/mg Culicidi Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ceppo AM UTI/mg Culicidi Formulazione Caratteristiche Area d impiego Sospensione Acquosa Sospensione Concentrata (AS/SC) Formulazione liquida pronta all uso previa opportuna diluizione Habitat aperti con scarsa presenza di vegetazione Granuli idrodispersibili (WG/WDG) Stabilità nelle condizioni di immagazzinamento, sospensione eccellente facile da miscelare, può essere applicato direttamente in contenitori di raccolta dell acqua Habitat aperti con minima presenza di vegetazione, contenitori di raccolta artificiali e/o naturali Granuli (G/GR/FG) Penetra nella vegetazione Habitat aperti con presenza di vegetazione Tavolette (DT) Facile impiego, pronta all uso Contenitori di raccolta artificiali e/o naturali 15

14 Parte generale Fig. 1 Dr. SenSeong Ng, responsabile del Laboratorio in USA dove vengono testati i prodotti per il controllo qualità Controllo qualità e standardizzazione Un aspetto molto importante e strettamente legato alla produzione degli insetticidi microbiologici è il loro controllo di qualità (Fig.1). Questo fa riferimento da un lato alla purezza del prodotto (quindi all assenza di microrganismi estranei) e dall altro alla sua efficacia. Ogni partita di materiale deve essere verificata relativamente a questi due aspetti, per cui è importante che vengano adottate procedure di valutazione affidabili e ripetibili, alfine di ottenere risultati comparabili nel tempo. Per ogni lotto di produzione, controlli al microscopio e mediante coltivazione su appositi substrati, vengono fatti sia sull inoculo ( coltura stock ) che sul prodotto finale. Per quanto concerne la standardizzazione l unico metodo affidabile è l esecuzione di saggi biologici o biosaggi. Per i preparati microbiologici, a base di Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (Bti) e Bacillus sphaericus (Bsph), non è infatti possibile la standardizzazione con metodi analitici come viene fatto normalmente per i prodotti chimici di sintesi. Biosaggi Per garantire uniformità al prodotto e prestazioni affidabili sul campo, è necessario effettuare test sugli insetti in laboratori specializzati per misurare i livelli di attività o potenza dei prodotti. Questi test sono chiamati saggi biologici o biosaggi. Requisiti I saggi biologici possono essere condotti con diverse finalità (per es. standardizzazione di un preparato, comparazione dell attività di diversi isolati, etc.). Per effettuare biosaggi sugli insetti, vanno osservate numerose condizioni. Di primaria importanza sono gli insetti stessi: è indispensabile disporre di una colonia permanente di insetti, esente da contaminazioni e abbastanza numerosa per prevenire gli effetti negativi dovuti all incrocio fra individui consanguinei. Gli insetti prelevati in natura rispecchiano meglio le condizioni reali di campo, ma sono generalmente più difficoltosi da utilizzare per stagionalità, legata al ciclo biologico dell insetto, e per le differenze esistenti fra le diverse popolazioni; per ovviare a tali problematiche vengono utilizzati insetti allevati in laboratorio. Le colonie da laboratorio sono allevate e cresciute in grandi locali per simulare le condizioni esterne potendo variare temperatura, umidità e luce praticamente senza limiti. Gli insetti vengono nutriti con diete artificiali preparate in condizioni sterili (Fig. 2). Semplici contenitori per alimenti sono usati per i test, permettendo da un lato un evidente risparmio e dall altro di rendere semplice sia l aggiunta di cibo alle larve, sia la loro osservazione per valutarne la mortalità. Per determinare se il test si svolge correttamente nel tempo, e per ottenere dati coerenti, è necessario 16

15 Parte generale Fig. 2 Allevamento delle colonie di adulti in laboratorio avere uno standard di riferimento. Lo standard di riferimento è preso in considerazione ogni giorno nelle bioanalisi, esso dà un indicazione sul cambiamento delle condizioni del test attraverso la fluttuazione della sua CL 50 *. I cambiamenti quotidiani sono il risultato di lievi mutamenti negli insetti del test, nei supporti tecnici, o anche nei parametri stagionali come ad esempio la pressione atmosferica. Comparando la risposta dello standard di riferimento con quelle dei campioni, vengono minimizzati gli effetti dell asimmetria dei dati dovuti a questi fattori. Le bioanalisi di insetti sono più flessibili di molti altri test in quanto tutti i tipi di campione, come prodotti formulati, prodotti intermedi della fermentazione, formulazioni sperimentali e tossine purificate, possono essere inseriti e mescolati con la dieta artificiale degli insetti su cui viene svolto il test. Potenza dei formulati Il biosaggio svolto utilizzando la risposta a diversi dosaggi è il metodo usato per determinare la biopotenza dei prodotti a base di Bti e Bsph. L obbiettivo è quello di determinare il valore della CL 50 nei campioni basandosi sul principio dell analisi logaritmica Probit. I valori di CL 50 sono usati per calcolare la potenza di un determinato lotto di prodotto a base di Bti / Bsph. Fig. 3-4 Campioni di larve su cui vengono svolti i biosaggi per determinare la CL 50 Quando si esegue il biosaggio per determinare i valori di CL 50, il campione di prodotto in questione viene testato con diverse concentrazioni (da 5 a 7). Ogni concentrazione viene testata su un determinato numero di larve; per i biosaggi su Bti e Bsph si impiegano 60 larve di zanzare per concentrazione su ogni singola replica. Ogni replica include contemporaneamente anche un riferimento standard con biopotenza nota e un testimone non trattato. I risultati di ogni ripetizione vengono elaborati attraverso l analisi logaritmica Probit alfine di stimare la CL 50 del campione e dello standard di riferimento (Fig. 3-4). Sulla base dei valori della CL 50 del campione e dello standard di riferimento, per stimare la potenza di un formulato, viene utilizzata la seguente relazione: Potenza del preparato = (UTI/mg) CL 50 Rif. Standard x Potenza Rif. Standard CL 50 Campione La potenza per il Bacillus thuringiensis subsp. israelensis viene espressa in Unità Tossiche Internazionali (UTI/mg o ITU/mg). Aedes aegypti è la specie di riferimento indicata per i biosaggi a base di Bti. La potenza per Bacillus sphaericus (Bsph) viene espressa in Unità Tossiche Internazionali Bacillus sphaericus (Bsph UTI/mg), la specie di riferimento per i bio- * CL50 : rappresenta la concentrazione che determina la morte del 50% degli individui in saggi di tossicità acuta per esposizione ambientale (es. tossicità acquatica o inalatoria). Si deve riferire al tempo di esposizione. 17

16 Parte generale Fig. 5 Larve di Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus utilizzate per stabilire la potenza dei formulati a base di Bti e Bsph rispettivamente saggi a base di Bsph è Culex quinquefasciatus (Fig. 5). La potenza finale di un determinato lotto di prodotto è la potenza media calcolata su un minimo di quattro repliche. Definizione del ceppo nei larvicidi microbiologici Per i requisiti EPA (US EPA dati richiesti per registrazione 40 CFR sez. 158, capitolo V: preparati microbiologici ): Ogni nuovo isolato di un prodotto microbiologico è trattato come un nuovo ceppo e deve essere registrato indipendentemente da qualsiasi ceppo simile già registrato come preparato microbiologico e supportato da dati richiesti nel presente capitolo. Ogni produttore che registra un prodotto microbiologico a base di batteri, per la regolamentazione prevista dall EPA, deve assegnare un numero univoco per quel determinato ceppo. Questa regolamentazione vale anche per i produttori che utilizzano un ceppo di un altra società per la produzione dei propri prodotti. Inoltre, l Organizzazione Mondiale della Sanità (WHO) prevede un rigoroso processo nello schema di valutazione dei larvicidi microbiologici per l approvazione delle specifiche che vengono elencate nel ceppo. Perché i numeri del ceppo sono importanti per i larvicidi microbiologici I prodotti a base di batteri come Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (Bti) e Bacillus sphaericus (Bsph) sono come tutti gli organismi viventi: non ci sono due cellule perfettamente identiche. Se la genetica gioca un ruolo fondamentale, l ambiente in cui cresce un organismo può avere un impatto significativo sui risultati finali. Questo è analogo per gemelli identici una volta divisi alla nascita: molti tratti possono essere simili, ma se cresciuti in ambienti diversi si possono determinare delle differenze individuali. Lo stesso vale per le stesse specie di batteri che vengono prodotte da due diversi produttori. Il numero univoco del ceppo che identifica il produttore di prodotti microbiologici a base di batteri è un collegamento fondamentale per le aspettative di qualità e le prestazioni del prodotto in campo. Numerosi test dimostrano che ceppi identici, prodotti in diverse condizioni di fermentazione, possono variare nel risultato finale. Anche se viene utilizzato lo stesso ceppo, le differenze o variazioni nell uso delle materie prime utilizzate, il recupero di biomassa nel processo di fermentazione e nei processi formulativi hanno un grande impatto, non solo sulla qualità del prodotto finale, ma anche sulle prestazioni biologiche (Devisetty,1993). Il metodo di recupero della biomassa può essere diverso a seconda del produttore (es. precipitazione, centrifugazione, ultrafiltrazione) e può infine influenzare fattori critici come la dimensione delle particelle, che guida il comportamento nella colonna d acqua e aumentare le probabilità che la tossina venga ingerita dall insetto (Devisetty, 1993; Clark et al. 2006, Clark et al. 2007). Inoltre, siccome si tratta di un processo di fermentazione, controlli di qualità al di sotto degli standard possono causare una crescita indesiderata dei contaminanti che potrebbero generare rischi per la sicurezza degli utilizzatori finali e dell ambiente. Il controllo di qualità (QC) del processo di fermentazione è un requisito fondamentale per garantire la coerenza e la sicurezza. Le misure QC possono non venir adottate da tutti i produttori di microrganismi batterici; risulta quindi fondamentale differenziare i prodotti in base al numero di ceppo che risulta essere unico per produttore rispetto a ceppi ubiquitari identificativi (es. utilizzo del sierotipo H14 come identificatore per i prodotti a base di Bti ). L uso di identificatori ubiquitari non garantisce l identità del prodotto in termini di prestazioni o di sicurezza ambientale. Il ceppo Bsph 2362 è stato adottato da Abbott Laboratories nel 1982 (a quel tempo casa madre di Valent BioSciences Corporation), producendo il primo stock liofilizzato di cellule sporulate. Nel corso degli anni 80, questo ceppo è stato conservato ed è attualmente utilizzato come inoculo, per le fermentazioni su scala industriale, di Bsph da parte di Valent BioSciences Corporation (VBC). Nel 1986, al ceppo originario 2362, è stato attribuito, dalla Abbott Laboratories, il numero esclusivo ABTS Nel 1991 Abbott ha ricevuto, dall Environmental Protection Agency (EPA), la registrazione del Bsph negli Stati Uniti. Il pacchetto di registrazione presentato all EPA per il 18

17 Parte generale ceppo ABTS-1743 fu riconosciuto dall Organizzazione Mondiale della Sanità (WHO) come ceppo Tuttavia, in quel momento, l EPA ha registrato il prodotto tecnico come ceppo In quanto tale, da oltre 20 anni, negli Stati Uniti il ceppo Bsph 2362 è stato associato a Valent BioSciences Corporation nei prodotti VectoLex (Bacillus sphaericus 2362, ceppo ABTS-1743) e VectoMax (Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, ceppo AM Bacillus sphaericus 2362, ceppo ABTS-1743) marchi riconosciuti, in letteratura associata in tutto il mondo, a VBC. Nel 2010, l EPA ha deciso che il ceppo 2362 è un identificatore designato come ubiquitario facente parte dell Organizzazione Mondiale della Sanità (WHO) e, in quanto tale, nessuna azienda può vantare l uso esclusivo di questo ceppo negli Stati Uniti. VBC è stata quindi incaricata di modificarne l iscrizione, con l aggiunta del numero di ceppo ABTS-1743, al nome del principio attivo Bsph: questo è lo stesso numero di ceppo isolato che è stato presentato, nel 1980, alla US EPA come parte del fascicolo di registrazione originale per Bsph. US EPA ha inoltre imposto che tutti i titolari di registrazioni di prodotti a base di Bsph debbano modificare le stesse per fornire una denominazione unica per il proprio ceppo che viene prodotto e contenente, come specifico principio attivo, il Bsph. 19

18 Parte generale Bacillus thuringiensis (Berliner) subsp. israelensis (de Barjac) Classificazione scientifica Dominio Prokariota Regno Bacteria A B Phylum Classe Ordine Famiglia Genere Specie Sottospecie Firmicutes Bacilli Bacillales Bacillaceae Bacillus thuringiensis israelensis C c s Generalità Bacillus thuringiensis (Bt) è noto già dal lontano inizio secolo, scoperto da Ishiwata in Giappone nel 1901, in allevamenti del Baco da seta (Bombyx mori) e nuovamente isolato, nel 1911 da Berliner, su larve di Tignola della farina (Ephestia kühniella). Bt è un batterio aerobio sporulante, Gram +, presente in natura dove è facilmente riscontrabile principalmente sulle foglie e nel terreno. Esistono migliaia di ceppi di Bt, ma solo alcuni di questi sono stati identificati e usati per la produzione di insetticidi microbiologici. Innocuo per mammiferi, uccelli, organismi acquatici non bersaglio e insetti utili, Bt è letale per centinaia di specie di insetti dannosi. Una selettività d azione così straordinariamente a misura delle esigenze dell uomo è un dono della natura difficilmente spiegabile. Le cellule vegetative hanno la lunghezza di 3-5 µm, le colonie si presentano di color biancastro-giallo e di forma irregolare. Per la maggior parte degli isolati non è nota alcuna attività insetticida anche se va tenuto presente che la valutazione di norma è condotta nei confronti di un numero limitato di specie ritenute importanti, per cui non è da escludere la possibilità che tali isolati risultino patogeni per specie minori. Una delle sue caratteristiche principali è quella di produrre, durante la fase di sporulazione, assieme alla spora uno o più corpi parasporali di natura proteica, comunemente detti cristalli, situati all interno dello sporangio (Fig. 1). Al termine della sporulazione avviene la lisi dello sporangio per cui cristallo e spora vengono rilasciati nel substrato di crescita. La spora è una forma di resistenza del batterio che, in condizioni idonee, germina dando origine a cellule vegetative, mentre il cristallo costituisce la principale componente insetticida complessivamente nota come c Fig. 1 Foto del Bacillus thuringiensis subsp. israelensis al microscopio fotonico (A), a scansione (B) ed elettronico (C). A) cellule vegetative in fase di sporulazione; la moltiplicazione avviene per divisione cellulare producendo una lunga catena di batteri che contengono le spore (s) e i cristalli (c). B) Cristalli purificati C) Batterio in fase di sporulazione e produzione dell inclusione cristallina. Dopo l autolisi della cellula, le spore (s) e il cristallo (c) si liberano nel substrato. L attività larvicida del Bti proviene dalle proteine che formano le diverse parti del cristallo (visibili per le diverse tonalità di grigio). δ-endotossina. Le proteine che costituiscono il cristallo si trovano anche nell endosporium e/o sulla parete della spora, che possono pertanto possedere un azione insetticida rilevante. Si distinguono tossine Cry che sono riferite al cristallo e tossine Cyt che sono quelle tossine Cry che possiedono attività citolitica ed emolitica in vitro. Alla sigla Cry o Cyt si aggiunge un codice numerico che identifica la proteina specifica (Thiery e Frachon, 1997). Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (Bti) venne isolato nel 1976, nell ambito di una campagna di ricerca di nuovi agenti di controllo biologico delle zanzare condotta da Margalit (Fig. 2) e Thaori in Israele (Goldberg e Margalit, 1977; Margalit e Dean, 1985; Margalit, 1989). Durante l estate 1976 Yoel Margalit della Ben-Gurion University perlustrava il deserto del Negev, e nei pressi del Kibbutz Zeelim, rinvenne una pozza d acqua salmastra nella quale era in corso un epizoozia: sulla superficie si notava infatti un fitto strato di larve di Culex pipiens morte o morenti. s 20

19 Parte generale Caratteristiche biologiche Il batterio produce le proteine tossiche durante la fase di sporogenesi, localizzandole in corpi parasporali di natura cristallina. A differenza dei ceppi attivi contro i Lepidotteri, che formano corpi cristalliformi, Bti forma una, due o tre inclusioni sferoidali di forma irregolare. È essenziale che la produzione industriale di Bti sia condotta in condizioni perfettamente controllate in modo da evitare la formazione di metaboliti che possano presentare tossicità ambientale (ad es. β-esotossina) e/o l inquinamento da parte di altri batteri potenzialmente pericolosi (WHO, 2007). Entrambi i componenti, cellule e spore, sono necessari per la piena esplicazione dell attività di Bti, ma il loro numero non è un valido indicatore dell attività larvicida. WHO (2007) specifica la metodica per la valutazione dell efficacia dei vari preparati a base di Bti. Questa prevede la conduzione di biosaggi in laboratorio utilizzando larve di IV stadio di Aedes aegypti (ceppo Bora Bora), ed i risultati devono essere espressi come Unità Tossiche Internazionali UTI/mg prodotto, relativamente ad un Bti standard di riferimento. A seguito della dismissione della sezione che si occupava del mantenimento degli standard presso l Istituto Pasteur di Parigi, attualmente l unico standard a livello internazionale è disponibile presso Valent Bio- Sciences Corporation ceppo AM65-52, lotto w5, con una potenza di UTI/mg. Fig. 2 Il Prof. Yoel Margalit, scopritore del Bti Da un campione di queste larve prelevato e trasportato in laboratorio furono isolate diverse colonie di batteri. Una di queste, siglata ONR60A e coltivata su substrato, mostrò un attività larvicida particolarmente elevata nei confronti di varie specie di zanzara. In seguito la coltura fu inviata all Istituto Pasteur di Parigi, in quanto laboratorio di riferimento O.M.S., dove Huguette de Barjac identificò e descrisse Bti (de Barjac, 1978). La prima registrazione di Bti per l utilizzo di campo risale al 1980 negli Stati Uniti (Davidson e Sweeney, 1983). Meccanismo d azione Il batterio agisce esclusivamente per ingestione. Il meccanismo d azione è legato all effetto delle tossine (o protossine) prodotte dal batterio che, quando ingerite da un organismo sensibile, entrano nel lume intestinale alcalino, vengono solubilizzate rapidamente, poi in presenza di proteinasi specifiche vengono attivate, quindi si legano ai recettori presenti sull epitelio intestinale provocando in breve tempo gravi disfunzioni osmotiche nelle membrane lipidiche, disgregazione cellulare con formazione di pori nell arco di 1-2 ore, perdita di funzionalità intestinale e morte dell individuo in un tempo variabile, ma in genere entro le 24 ore (Schwartz e Laprade, 2000; Boonserm et al., 2005). Le spore possono germinare nella larva e dare vita alla forma vegetativa. Si ritiene che siano 4 i principali polipeptidi responsabili dell attività tossica: CryIVA CryIVB Cry11Aa Cyt1Aa (125-8 kda) (134-5 kda) (70 kda) (28 kda) Mentre altre proteine sembrano esercitare un azione tossica più debole (ad es. Cry10Aa, Cyt2Ba). I geni corrispondenti risultano tutti localizzati su un plasmide di 72 MDa. Le tossine del tipo Cry per attivarsi si devono legare a recettori glicoproteici specifici presenti sui microvilli intestinali; quelle del tipo Cyt sembrano invece esercitare azione tossica direttamente legandosi alle membrane lipidiche. Si è visto che la tossicità si verifica anche quando si testano ceppi clonati alfine di produrre meno o una sola delle quattro tossine. Tuttavia l elevata tossicità di Bti è il risultato delle interazioni sinergiche che si instaurano tra le quattro proteine. Tentativi compiuti congiuntamente in diversi laboratori (soprattutto University of California-Riverside; University of Cambridge-England; Istituto Pasteur- Parigi) tendenti ad incrementare la tossicità eliminando i geni responsabili della produzione di una o più 21

20 Parte generale proteine tra le meno tossiche in modo che le risorse energetiche del batterio fossero devolute interamente alla produzione delle proteine più tossiche, non hanno dato esiti positivi (Federici et al., 2003). Mentre è stato possibile selezionare in laboratorio ceppi di zanzare resistenti a una o più tossine prodotte da Bti (Georghiou e Wirth, 1997; Paris et al., 2010), risulta molto difficile, se non impossibile, selezionare ceppi resistenti al complesso tossico di Bti nel suo insieme (Crickmore et al., 1995; Wirth et al., 1997; Wirth et al., 2004; Paris et al., 2010). In particolare CytA sembra svolgere un ruolo fondamentale nel prevenire o dilazionare i rischi di resistenza che si potrebbe invece instaurare a carico delle proteine del tipo Cry (Wu et al., 1994; Perez et al., 2005). Si consideri ad esempio che in alcune aree dell Emilia-Romagna dove l impiego di Bti è iniziato nel 1985 le popolazioni di Cx. pipiens sono state sottoposte a oltre 400 trattamenti senza osservare nessuna perdita di sensibilità (comunicazione personale R. Bellini). È altresì interessante sottolineare che ceppi di zanzara che risultano resistenti a Bsph non mostrano alcun livello di resistenza incrociata a Bti (Rodcharoen e Mulla, 1996; Wirth et al., 2000; Yuan et al., 2003). Specie bersaglio Bti è attivo contro larve di zanzara appartenenti ai generi Anopheles, Aedes, Culex, Culiseta, Mansonia, Psorophora e Uranotaenia. La sensibilità risulta variare largamente tra i generi e tra specie all interno dello stesso genere. Sotto il profilo applicativo è importante sottolineare che le larve di Anopheles mostrano generalmente livelli di sensibilità inferiori rispetto ad Aedes e Culex. Più che a fattori di natura fisiologica, la causa è in larga parte da attribuirsi alla loro preferenza a nutrirsi in superficie, proprio sotto la pellicola superficiale, dove il prodotto permane per poco tempo (Lacey e Singer, 1980; Romi e Majori, 1986; Merritt et al., 1992) ed anche alla minore intensità di filtrazione dell acqua degli Anophelini rispetto ai Culicini (Aly et al., 1988). Bti è anche attivo nei confronti di altri Ditteri Nematoceri, come Simulidi, Chironomidi, Sciaridi e Psicodidi. Efficacia in condizioni di campo Bti richiede accuratezza tecnico-operativa per esplicare al meglio le sue performances in condizioni di campo. La sua persistenza d azione è comunemente ritenuta scarsa, questo non tanto per la degradazione biologica (le spore ed i cristalli possono persistere per molti mesi in natura) quanto per la sedimentazione che avviene una volta somministrato in acqua, con tempi che dipendono dal grado di adsorbimento chimico-fisico al particolato sospeso (Ramoska et al., 1982). Per questo motivo Bti risulta in genere meno persistente in acque molto ricche di alghe e di sostanze organiche. Specie non bersaglio Bti è considerato altamente sicuro per la salute pubblica ed è stato approvato da WHO per l utilizzo nella lotta a zanzare e Simulidi in tutti gli ambienti acquatici, comprese le acque potabili (WHO, 2009). Sotto il profilo tossicologico Bti è stato testato approfonditamente ormai da molti anni su animali di laboratorio (mammiferi, uccelli, anfibi, pesci) valutando allergenicità, infettività e tossicità delle preparazioni che contenevano cellule in fase vegetativa e spore, somministrate per le diverse vie di assunzione (orale, inalazione, cutanea). Gli esami condotti hanno sempre confermato che Bti non è nocivo per i vertebrati, riportando solo irritazione oculare e dermale a seguito di esposizione diretta nell uomo. L assenza di esotossine e altri prodotti metabolici fa sì che il rischio mutagenico si possa escludere a priori (WHO, 2007). 22