Metodi di rilevamento di trichinella spp. dalle carni previsti dal Reg. CE 2075:2005 e Regolamento di esecuzione 1375/2015

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1 Metodi di rilevamento di trichinella spp. dalle carni previsti dal Reg. CE 2075:2005 e Regolamento di esecuzione 1375/2015

2 Spiralis Trichinella - Scoperta in Inghilterra da J. Paget R. Owen descrive Trichina spiralis 1859 R. Virchow descrive il ciclo 1860 F. Zenker dimostrò la patogenicità di trichina spiralis nell uomo Nel 1895, Railliet cambiò il nome del genere da Trichina in Trichinella I nematodi del genere Trichinella hanno una distribuzione cosmopolita. Misurano da 0,6 a 1 mm di lunghezza e da 30 a 38 μm di larghezza, a seconda della specie Se vive hanno un tipico movimento di arrotolamento/srotolamento Se morte assumono una forma completamente avvolta o parzialmente distesa Il parassita è trasmesso all'uomo mediante ingestione di carni infette, crude o poco cotte.

3 Specie incapsulate Infettano solo i mammiferi incluso l uomo T. spiralis T. nativa, Trichinella T6 T. britovi, Trichinella T8 T. murrelli Trichinella T9 T. nelsoni T. patagoniensis Specie non incapsulate Infettano i mammiferi incluso l uomo T. pseudospiralis T. papuae T. zimbabwensis Infettano inoltre gli uccelli (T. pseudospiralis) ed i rettili ( T. papuae, T. zimbabwensis)

4 Diagnosi delle infestazioni da Trichinella negli animali Diagnosi clinica, non possibile per assenza di segni clinici Diagnosi parassitologica sensibile ed affidabile Diagnosi sierologica, rischio periodo finestra

5 ITER LEGISLATIVO REGOLAMENTO (CE) N. 2075/2005 DELLA COMMISSIONE del 5 dicembre 2005 che definisce norme specifiche applicabili ai controlli ufficiali relativi alla presenza di Trichine nelle carni REGOLAMENTO (CE) n. 1665/2006 DELLA COMMISSIONE del 6 novembre 2006 recante modifica del regolamento (CE) n. 2075/2005 che definisce norme specifiche applicabili ai controlli ufficiali relativi alla presenza di Trichine nelle carni REGOLAMENTO (CE) N. 1245/2007 DELLA COMMISSIONE del 24 ottobre 2007 recante modifica dell allegato I del regolamento (CE) n. 2075/2005 per quanto riguarda l uso di pepsina liquida per rilevare Trichinella spp. nelle carni REGOLAMENTO DI ESECUZIONE (UE) N. 1109/2011 DELLA COMMISSIONE del 3 novembre 2011 che modifica l'allegato I del regolamento (CE) n. 2075/2005 per quanto riguarda i metodi equivalenti per l'individuazione della presenza di Trichine REGOLAMENTO (UE) N. 216/2014 DELLA COMMISSIONE del 7 marzo 2014 recante modifica del regolamento (CE) n. 2075/2005 che definisce norme specifiche applicabili ai controlli ufficiali relativi alla presenza di Trichine nelle carni REGOLAMENTO DI ESECUZIONE (UE) N. 1114/2014 DELLA COMMISSIONE del 21 ottobre 2014 recante modifica del regolamento (CE) n. 2075/2005 che definisce norme specifiche applicabili ai controlli ufficiali relativi alla presenza di Trichine nelle carni REGOLAMENTO DI ESECUZIONE (UE) 2015/1375 DELLA COMMISSIONE del 10 agosto 2015 che definisce norme specifiche applicabili ai controlli ufficiali relativi alla presenza di Trichine nelle carni

6 La fase di campionamento è esclusa dalla prova in quanto ai sensi del reg. 854/2004 il veterinario ufficiale è responsabile: dell effettuazione del prelievo del materiale da sottoporre ad analisi assicura che sia adottata una procedura per l identificazione, la manipolazione e l invio dei campioni della rintracciabilità dei singoli campioni e loro correlazione con la carcassa.

7 Requisiti del laboratorio di prova Regime di Accreditamento

8 CAMPIONAMENTO

9 Categoria produttiva Sito di prelievo Esame 1 istanza Esame 2 istanza Esame di conferma Suino da ingrasso pilastri diaframma 1 gr 20 gr 20 gr massetere, lingua, muscoli addominali, diaframma prossimo alle costole o sterno 2 gr 20 gr 20 gr Scrofe e verri pilastri diaframma 2 gr 20 gr 20 gr Cinghiali equini massetere, lingua, muscoli addominali, diaframma prossimo alle costole o sterno lingua, diaframma, arto anteriore lingua, massetere, diaframma nel punto di intersezione tra la parte muscolare e tendinea Altri animali Siti di elezione 10 gr 10 gr 50 gr 10 gr 50 gr

10 Categoria Sito di prelievo Esame 1 istanza conferma Orsi Diaframma, massetere, lingua 10 gr 50 gr Trichechi Lingua 10 gr 50 gr Coccodrilli Uccelli Massetere, muscoli pterigoidei, muscoli intercostali Muscoli del capo (es. massetere e muscoli del collo) 10 gr 10 gr Tempo di digestione non superiore a 60 minuti

11 Requisiti di conformità del campione 1. Il campione deve essere di peso idoneo 2. Il campione deve essere privo di grasso e tessuto connettivo 3. Se si utilizza la lingua, occorre asportare lo strato superficiale che non è digeribile ed impedisce una corretta lettura del sedimento

12 Diagnosi dell infezione da Trichinella nel suino METODI DIAGNOSTICI UFFICIALI Agitatore magnetico (metodo di riferimento); METODI EQUIVALENTI Stomacher, con sedimentazione o filtrazione; Trichomatic 35 ; Test di agglutinazione al lattice.

13 trichinoscopio Non più utilizzabile da gennaio 2010 Non permette di analizzare un elevato numero di animali Difficoltà nel rilevare le specie di Trichinella non incapsulate Falsi negativi causati da errata dimensione del campione (elevato spessore del tessuto da esaminare)

14 METODO DI RIFERIMENTO

15 Attrezzature e Reagenti Forbici e Pinzette per il prelievo dei campioni Scatole Petri per contenere i campioni

16 Miscelatore dotato di lama sminuzzatrice affilata Qualora i campioni superino i 3 g, occorre usare un tritacarne con fori tra 2 e 4 mm ovvero delle forbici. In caso di carni congelate o lingua (dopo rimozione dello strato superficiale che non può essere digerito), occorre utilizzare un tritacarne e aumentare notevolmente le dimensioni del campione

17 Bilancia di precisione tarata almeno allo 0,1 gr. Acqua di rubinetto

18 Imbuto con diametro interno non inferiore ai 12 cm, per sostenere il setaccio Cilindro in vetro con capacità di ml

19 Becher in vetro con capacità di 3 litri. Ancoretta magnetica in teflon, all incirca 5 cm

20 Agitatore magnetico con piastra di riscaldamento dotata di termostato

21 Setaccio, dimensione della maglia 180 micron Piastra Petri con fondo reticolato

22 Vassoio suddiviso in riquadri, ciascuno in grado di contenere campioni di carne

23 Metodo dell Agitatore magnetico Accorgimenti L uso di materiale in plastica può pregiudicare la prova per via dell adesività delle larve quindi preferire il vetro Verificare lo stato di usura delle lame del tritacarne; Integrità delle maglie del setaccio e loro pulizia; Taratura di termometro e bilancia per il corretto range di utilizzo; Conservare la pepsina (reagente critico) in un contenitore ermeticamente chiuso in ambiente fresco (4 15 C) ed asciutto. Utilizzare lotti prodotti negli ultimi 6 mesi L attività enzimatica si riduce con il tempo (scadenza 2 anni).

24 INGREDIENTI PER LA DIGESTIONE o PEPSINA 1:10000 NF (US National Formulary) corrispondente a 1: BP (British Pharmacopoeia) corrispondente a FIP (Fédération internationale de pharmacie), oppure pepsina liquida stabilizzata con 660 EP (European Pharmacopoeia) unità/ml minimo. o ACIDO CLORIDRICO AL 25% o ACQUA DI FONTE RISCALDATA TRA C

25 Procedura Versare 16 ml di HCl al 25%

26 Pesare La Pepsina

27 Preparazione del liquido di digestione Preparare 2 litri di acqua preriscaldata ad una temperatura tra C Introdurre una barra di agitazione Coprire con un foglio di alluminio il becher Può lavorare aggregati di carne fino a 100 gr

28 Versare 16 ml di HCL al 25% Aggiungere 10 gr di Pepsina

29 Trasferire l aggregato di Carne

30 Avviare la digestione

31 CRITICITA 1) La temperatura iniziale dell acqua e della soluzione digestiva vanno costantemente monitorate N.B.: sotto i 37 C l attività della pepsina si riduce mentre sopra i 48 C la pepsina viene disattivata (digestione incompleta); 2) Un tempo di digestione eccessivo (>60 ) può danneggiare le larve con conseguente diminuzione del peso specifico (diverso tempo di sedimentazione) ed aumento dell adesività ai contenitori;

32 Sedimentazione Imbuti di sedimentazione Trasferimento del liquido di digestione

33 Accorgimenti Le larve possono rimanere adese alle pareti del bicchiere del tritacarne, o del becher che vanno quindi sciacquati con cura; La torbidità del sedimento può rendere difficile la lettura;

34 Avviare la Sedimentazione per altri 30 min circa Scarti nel setaccio: inferiore al 5% del peso del campione iniziale Un eccesso di sedimento nel setaccio può trattenere le larve;

35 Raccolta di 40 ml del liquido; Il campione di 40 ml viene lasciato sedimentare per 10 minuti.

36 Vengono aspirati accuratamente 30 ml del surnatante, e lasciati 10 ml del sedimento Versare 10 ml di sedimento nella piastra reticolata

37 Il cilindro viene risciacquato con non più di 10 ml di acqua, che vanno aggiunti alla piastra per il conteggio delle larve

38 Osservazione allo stereomicroscopio Trichinella nel liquido di digestione

39 Visione nella Piastra Ingrandimento da 15 a 20 volte Ingrandimento da 60 a 100 volte.

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45 IMPORTANTE 1) La pepsina va sempre aggiunta alla soluzione di acqua ed acido cloridrico, mai direttamente all acido cloridrico altrimenti verrà degradata; 2) Il liquido di digestione rimasto nell imbuto separatore deve essere conservato fino al completamento della lettura dei risultati; 3) La lettura del sedimento deve essere effettuata immediatamente, nel caso il sedimento non venga esaminato entro 30 occorre procedere con la chiarificazione (aggiunta di 30 ml di acqua di rubinetto e si ripete la procedura); 4) Un massimo di 15 g possono essere aggiunti al pool di campioni da 100 g, più di 15 g vanno analizzati come campione separato; 5) In caso di positività, le larve devono essere prelevate con una pipetta e conservate in una provetta da 1,5-2 ml con alcool etilico al 90% per l identificazione della specie; 6) i liquidi di digestione devono essere decontaminati riscaldandoli ad una temperatura minima di 60 C.

46 Punti critici della digestione artificiale L osservazione della larva al di fuori della la cellula muscolare può a volte portare ad errori di interpretazione con false positività a cause di larve di nematodi, peli o residui di fibre muscolari. Il personale deve essere in grado di distinguere le larve dalle fibre muscolari La pepsina deve essere conservata al buio, in luogo fresco, protetta dall umidità e deve essere stata prodotta da non oltre sei mesi il sedimento della digestione non deve contenere frammenti di tessuto indigeriti tutto il procedimento deve essere effettuato nell ambito di un sistema di assicurazione di qualità

47 Metodi c.d. equivalenti

48 Stomacher Sistema di omogeneizzazione meccanica del campione Permette di analizzare un campione di 100 g

49 METODI EQUIVALENTI A. Metodo di digestione artificiale di campioni aggregati/tecniche di sedimentazione 1. Attrezzature e reagenti a) Coltello o forbici per il prelievo di campioni. b) Vassoi suddivisi in 50 riquadri, ciascuno dei quali in grado di contenere campioni di carne del peso di circa 2 g, ovvero altri strumenti che diano garanzie equivalenti per quanto riguarda la tracciabilità dei campioni. c) Tritacarne o mixer elettrico. d) Stomacher lab-blender 3 500, thermo model. e) Sacchetti di plastica adatti allo Stomacher lab-blender. f) Provette di decantazione di forma conica, con capacità di 2 litri, preferibilmente dotate di tappi in Teflon. g) Supporti, anelli e morsetti. h) Setacci, dimensione della maglia 180 micron, diametro esterno 11 cm, maglia in acciaio inossidabile o in ottone. i) Imbuti, con diametro interno non inferiore a 12 cm, per sostenere i setacci. j) Provette graduate da 100 ml. k) Termometro di precisione graduato a 0,5 C, per misurare temperature da 1 a 100 C. l) Vibratore, ad esempio rasoio elettrico senza testa. m) Relè elettrico, acceso e spento a intervalli di 1 minuto. n) Stereomicroscopio con sorgente luminosa di intensità regolabile, proveniente dal basso. o) o) Vaschetta per il conteggio delle larve e scatole petri del diametro di 9 cm, p) p) Acido cloridrico al 17,5 %. q) q) Pepsina, concentrazione: 1: NF (US National Formulary) corrispondente a 1: BP (British Pharmacopoeia) corrispondente a FIP (Fédération internationale de pharmacie), oppure pepsina liquida stabilizzata con 660 EP (European Pharmacopoeia) unità/ml minimo. r) recipienti da 10 litri da usare per la decontaminazione. r) s) Bilancia di precisione con taratura a 0,1 g.

50 2. Prelievo di campioni e quantitativi per la digestione Secondo quanto indicato al capitolo I Procedura I. Triturazione II. La procedura può essere applicata a aggregati completi(100 g di campioni per volta) o aggregati inferiori a 100 g. a) Aggregati completi (100 campioni per volta): i) Lo Stomacher lab-blender viene dotato di un doppio sacchetto di plastica e la temperatura regolata tra 40 e 41 C. ii) Si versa un litro e mezzo d'acqua preriscaldata tra 40 e 41 C nel sacchetto interno. iii) Si aggiungono all'acqua 25 ml di acido cloridrico al 17,5 %. iv) Si aggiungono 100 campioni del peso di 1 g circa ciascuno (tra 25 e 30 C) v) Si aggiungono infine 6 g di pepsina o 18 ml di pepsina liquida. vi) Avviare lo Stomacher per 25 minuti. vii) Il sacchetto viene rimosso dallo Stomacher e il succo di digestione viene filtrato attraverso il setaccio e versato in un becher da 3 litri. viii) Il sacchetto di plastica viene risciacquato con circa 100 ml d'acqua utilizzata quindi per risciacquare il setaccio e infine aggiunta al contenuto del becher. ix) Ad un aggregato completo di 100 campioni si può aggiungere un massimo di 15 campioni individuali

51 b) Aggregati di dimensioni inferiori (meno di 100 campioni): i) Si dota lo Stomacher lab-blender di un doppio sacchetto di plastica e la temperatura viene regolata tra 40 e 41 C. ii) Si prepara un succo di digestione mescolando circa un litro e mezzo d'acqua e 25 ml di acido cloridrico al 17,5 %. Si aggiungono 6 g di pepsina alla miscela ad una temperatura tra 40 e 41 C.. iii) Si misura un volume del succo di digestione pari a 15 ml per grammo di campione (ad esempio, per 30 campioni, il volume necessario è pari a ml = 450 ml) versandolo quindi nel sacchetto di plastica interno assieme ai campioni di carne del peso di circa 1 g iv) Si versa acqua ad una temperatura di 41 C circa nel sacchetto esterno, sino ad ottenere un volume totale dei due sacchetti pari a un litro e mezzo. Avviare lo Stomacher per 25 minuti. v) Il sacchetto viene rimosso dallo Stomacher e il succo di digestione viene filtrato attraverso il setaccio e versato in un becher da 3 litri. vi) Il sacchetto di plastica viene risciacquato con circa 100 ml d'acqua (ad una temperatura tra 25 e 30 C), usata quindi per risciacquare il setaccio e infine aggiunta al liquido filtrato contenuto nel becher.

52 III. Isolamento delle larve mediante sedimentazione - Si aggiungono al succo di digestione tra 300 e 400 g di ghiaccio (in scaglie o tritato) per ottenere un volume di circa 2 litri. - Il succo di digestione viene quindi mescolato fino allo scioglimento del ghiaccio. - Si trasferisce il succo di digestione raffreddato in un imbuto di sedimentazione da 2 litri, dotato di un vibratore fissato con un morsetto supplementare. - La sedimentazione procede per 30 minuti, nel corso dei quali il recipiente viene fatto vibrare in modo intermittente. - Dopo 30 minuti, 60 ml del campione del sedimento sono introdotti rapidamente in un cilindro graduato da 100 ml (l'imbuto viene risciacquato con una soluzione detergente dopo l'utilizzazione). - Il campione di 60 ml viene lasciato riposare per almeno 10 minuti, dopo di che si aspira il liquido surnatante fino a lasciare nella provetta un volume di 15 ml che verrà esaminato per individuare la presenza di larve.

53 I succhi di digestione devono essere esaminati non appena pronti. L'esame non deve essere in alcun caso rinviato al giorno successivo. Se i succhi di digestione non sono trasparenti o non vengono esaminati entro i 30 minuti successivi alla preparazione, si deve procedere ad una chiarificazione secondo la seguente procedura: il campione finale di 60 ml viene versato in un cilindro graduato e lasciato riposare per 10 minuti; 45 ml di liquido surnatante vengono quindi aspirati e i rimanenti 15 ml portati a 45 ml con l'aggiunta di acqua di rubinetto; dopo un ulteriore periodo di riposo di 10 minuti, si aspirano 30 ml di liquido surnatante e i rimanenti 15 ml sono versati in una scatola petri o in una vaschetta per il conteggio delle larve per essere esaminati; il cilindro graduato viene risciacquato con 10 ml di acqua di rubinetto e il liquido viene aggiunto al campione nelle scatole petri o nella vaschetta per il conteggio delle larve per essere esaminato.

54 STRUMENTI E MATERIALE NECESSARI Sacchetti in plastica per stomacher; Apparato vibrante (es. rasoio elettrico); Relè elettrico; Nel caso di isolamento delle larve mediante filtraggio: Imbuto Gelman da 1 litro con supporto per filtro; Dischi filtranti in acciaio da 35 μm; Beuta da aspirazione; Pompa aspirante; Sacchetti in plastica sigillabili; Rennilasi.

55 PROCEDURA 1) Dotare lo stomacher di un doppio sacchetto e regolare la T a C; 2) Versare nel sacchetto interno 1,5 l di acqua preriscaldata a C, 25 ml di acido cloridrico al 17,5 %, il pool di campioni da 100 g, e 6 g di pepsina; 3) Mescolare il contenuto del sacchetto per 25 minuti; 4) Filtrare il succo di digestione attraverso il setaccio in un becher da 3 litri; 5) Aggiungere ghiaccio fino ad ottenere un volume di 2 litri; 6) Trasferire il liquido digestivo in un imbuto separatore da 2 litri; 7) Lasciare sedimentare per 30 ; 8) Durante la sedimentazione il recipiente viene fatto vibrare ad intervalli di 1 ; 9) Prelevare 60 ml di liquido e lasciare sedimentare per 10 in un cilindro graduato; 10)Aspirare il surnatante fino a 15 ml, trasferire il rimanente in una Petri per la ricerca delle larve.

56 TRICOMATIC 35 Apparecchio di digestione completamente automatico Permette un analisi veloce del campione (circa 20 ) Per la digestione automatica dei campioni fino a 35 grammi A: camera di digestione B: camera dei liquidi

57 Recipiente per la raccolta di liquidi residui Collocare il miscelatore con il dispositivo di filtraggio, collegare il tubo di scarico e introdurlo nell'apposito recipiente

58 Attrezzature Pinzetta, piastra e Forbici Pinzetta con punte piatte Bilancia elettronica Mixer elettrico

59 Membrane di policarbonato di diametro di 50 mm e pori da 14 Micron Porta membrana

60 Reagenti per la digestione 400 ml di acqua di fonte 30 ml di HCL AL 8,5% ± O,5% 7gr di Pepsina 1:10000 NF o 21 ml di pepsina liquida

61 Pulizia del muscolo Sminuzzamento

62 Campioni Fino ad un massimo di 35 gr

63 Tritare i campioni

64 Omogeneizzato di carne pronto per la lavorazione automatica

65 Smontare il supporto del filtro, inserire la membrana, montarlo e chiudere la valvola del Trichomatic

66 Camera A di digestione Introdurre l omogeneizzato di carne Versare 7gr di Pepsina

67 Camera B dei liquidi Versare 400 ml di acqua 30 ml di HCL 9%

68 Avviare il ciclo automatico Un periodo di digestione breve (5 minuti) va scelto per i suini in età normale per la macellazione, mentre per altri campioni si sceglie un periodo più lungo (8 minuti).

69 Terminato il ciclo di digestione prelevare filtro

70 Visione al microscopio della membrana

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72 Pulizia del Trichomatic Detergente basico Idrossido di NA al 10%

73 Pulizia delle attrezzature

74 Raccomandazioni Il filtro a membrana può essere riutilizzato fino ad un massimo di cinque volte. Il filtro deve essere rigirato dopo ciascuna utilizzazione e controllato prima dell uso; Nel caso di risultati positivi, procedere con la pulizia automatica con acqua bollente Decontaminare il supporto del filtro e qualsiasi altra attrezzatura; In caso di digestione incompleta si pone un nuovo filtro sul supporto, si riempie con acqua il recipiente del miscelatore e si procede al programma di pulizia automatica. Alla fine entrambi i filtri devono essere esaminati al microscopio. Essendo un sistema totalmente automatizzato è fondamentale una corretta manutenzione dello strumento per verificare il mantenimento della temperatura, la tenuta delle guarnizioni, etc.);

75 Test di agglutinazione al lattice Permette di rilevare la presenza di larve di Trichinella spp. nel campione di tessuto mediante una reazione specifica antigene-anticorpo; Può essere utilizzato sull emosiero e sul campione di succo di carne

76 Kit trichin L 1= pepsina (300 g) + dosatore 2= diluente per il campione 3= pinzette 4= filtri in nyon da 20 μm 5= controllo negativo 6= controllo positivo 7= biglie di lattice 8= bacchettine monouso 9= carte di agglutinazione Rif. G.: Marucci: Ricerca di trichinella nelle carni : metodi diagnostici e punti critici- IZSLT Roma 18/03/2014

77 Nel campione positivo sono evidenti aggregati di biglie di colore blu acceso Foto da Rif. G.: Marucci: Ricerca di trichinella nelle carni : metodi diagnostici e punti critici- IZSLT Roma 18/03/2014

78 Test di digestione artificiale per la ricerca in vitro di larve di Trichinella spp nei campioni di carne, Kit PrioCHECK Trichinella AAD. Considerato equivalente esclusivamente per le analisi sulle carni di suini domestici. Dotarsi di imbuti separatori e provette di vetro da 80 ml

79 Diagnosi sierologica IFA, ELISA, immunoblot rischio periodo finestra a volte siero conversione dopo 2 mesi. A volte presenza di larve nelle masse muscolari senza produzione anticorpale : falsi negativi Se reazione positiva vanno fatte ulteriori verifiche perchè trichinella cross reagisce con diversi altri agenti anche non di natura parassitaria

80 ZZZzzzzzz.. Grazie per l attenzione