Enz. Ag + Ag + Ab cw. costante) Ag Ab cw : Complesso Antigene-anticorpo Enz

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1 - FT4 Determinazione immunoenzimatica diretta dell FT4 nel siero o plasma umano per analisi di routine IVD LOT Vedere etichetta esterna Σ = 96 test REF DKO038 DTINAZIONE D USO Metodo competitivo immunoenzimatico colorimetrico per la determinazione quantitativa della concentrazione dell FT4 nel siero o plasma umano. Il kit FT4 è destinato al solo uo di laboratorio. 1. SIGNIFICATO CLINICO L'ormone tiroideo, tirossina (T4), è prodotto dalla ghiandola tiroide. Un componente importante nella sintesi è lo iodio. Il principale ormone tiroideo presente nel sangue è la tirossina (T4). La tirossina è convertita in T3 attivo (tre - quattro volte più potente di T4) all'interno delle cellule dalle deiodinasi (5'- iodinasi). La Tiroxine-binding globulin (T) è la proteina carrier per l'ormone tiroideo circolante. Soltanto una frazione molto piccola dell ormone T4 è libera (FT4)- 0,03%. Quando l'ormone tiroideo è legato, non è attivo, il rapporto FT3/FT4 è molto importante. Per questo motivo, la misura del T4 totale nel sangue può essere impreciso. La concentrazione degli ormoni tiroidei liberi nel sangue è regolata da un meccanismo feedback negativo, che coinvolge il TSH. Il legame di T4 da parte di TBG svolge un ruolo chiave in questo meccanismo ed i cambiamenti più significativi della capacità di legare il T4 sono il risultato di alterazioni in TBG. Le variazioni nei livelli circolanti di TBG provocheranno un aumento o una diminuzione proporzionale nella concentrazione di T4 totale. Tuttavia, la misura del FT4 nel siero, non è vincolata dai cambiamenti nei livelli della proteina T4 e quindi correla bene con la funzione tiroidea. I fattori responsabili delle discrepanze fra i livelli di T4 totale nel siero e la funzionalità tiroidea, sono la concentrazione di TBG, gli ormoni estrogenici (gravidanza, anticoncezionali orali ed estrogeni) e i farmaci che si legano al TBG impedendone il relativo legame con T4. Gli ormoni tiroidei agiscono sull organismo in modo da aumentare il metabolismo basale, interessano la sintesi proteica ed aumentano la sensibilità del corpo alle catecolammine (quali l adrenalina). Gli ormoni tiroidei sono essenziali per lo sviluppo e il differenziamento delle cellule del corpo umano. Questi ormoni inoltre regolano il metabolismo delle proteine, dei grassi e dei carboidrati, sono coinvolte nella regolazione del uso dei residui energici da parte delle cellule. Stimoli fisiologici e patologici influenzano la sintesi dell'ormone tiroideo. La tirotoxicosi o ipertiroidismo, è la sindrome clinica causata da un eccesso di T3 circolante. Sia il T3 che il T4 sono usati nella terapia per l ipotiroidismo. 2. PRINCIPIO L METODO I reagenti essenziali richiesti per un saggio immunoenzimatico in fase solida includono un anticorpo immobilizzato, un enzima coniugato all antigene e un antigene nativo. Dopo aver aggiunto all anticorpo immobilizzato l enzima coniugato all antigene e il siero contenente l antigene nativo libero, si ha una reazione competitiva tra l antigene nativo libero e l antigene coniugato all enzima per un limitato numero di siti leganti immobilizzati L interazione è illustrata dalla equazione seguente: Enz. Ag + Ag + Ab cw K a AgAb cw + Enz. Ag Ab cw K -a Ab cw : Anticorpo monospecifico immobilizzato (quantità costante) Ag: Antigene nativo (quantità variabile) Enz.Ag.:Coniugato Enzima-Antigene (quantità costante) Ag Ab cw : Complesso Antigene-anticorpo Enz Ag Ab cw : Complesso Enzima-Antigene Anticorpo- Coniugato K a : Costante di associazione K -a : costante d dissociazione K= k a /k -a : Costante di equilibrio Una volta raggiunto l equilibrio, il coniugato legato alla fase solida è separato alla frazione di coniugato libero per decantazione o aspirazione. L attività del coniugato legato alla fase solida è inversamente proporzionale alla concentrazione dell antigene libero (FT4). Utilizzando differenti sieri di riferimento con una concentrazione nota di antigene, si può costruire una curva di dose-risposta da cui è possibile ricavare la concentrazione non nota di un campione.

2 3. REATTIVI, MATERIALI E STRUMENTAZIONE 3.1. Reattivi e materiali forniti nel kit 1. FT4 Standard (6 flaconi, 1 ml ciascuno) STD A REF DCE002/ STD B REF DCE002/ STD C REF DCE002/ STD D REF DCE002/ STD E REF DCE002/ STD F REF DCE002/ Conjugate (1 flacone, 12 ml) FT4 coniugato con Perossidasi di rafano (HRP) REF DCE002/ Coated Microplate (1 micropiastra breakable) Anti FT4 adsorbito su micropiastra REFDCE002/ TMB Substrate (1 flacone, 15 ml) H 2 O 2 -TMB (0,26 g/l) (evitare il contatto con la pelle) REFDCE Stop Solution (1 flacone, 15 ml) Acido Solforico 0,15 mol/l (evitare il contatto con la pelle) REFDCE X Conc. Wash Solution (1 flacone, 20 ml) NaCl 45 g/l; Tween g/l REFDCE Reattivi necessari non forniti nel kit Acqua distillata Materiale e strumentazione ausiliare Dispensatori automatici. Lettore per micropiastre (450 nm) Note Conservare tutti i reattivi a 2 8 C, al riparo dalla luce. Aprire la busta del Reattivo 3 (Coated Microplate) solo dopo averla riportata a temperatura ambiente e chiuderla subito dopo il prelievo delle strip da utilizzare. 4. PRECAUZIONI I reagenti aperti, conservati a 2 8 C sono stabili per 60 giorni. Non usare reagenti dopo la data di scadenza. Evitare l esposizione del reattivo TMB/H 2 O 2 alla luce solare diretta, metalli o ossidanti. Tutti I prodotti che contengono siero umano sono risultati non reattivi per l antigene di superficie dell Epatite B e anticorpi anti HIV 1 & 2 e HCV secondo i requisiti FDA. Dal momento che non si cono0sce un test che offra la sicurezza assoluta relativamente all assenza di agenti infettanti, tutti i prodotti di derivazione umana dovrebbero essere maneggiati come potenzialmente pericolosi e in grado di trasmettere agenti infettanti. La concentrazione della Tiroxina totale nel siero dipende da molteplici fattori: dalla funzionalità della ghiandola tiroidea e dalla sua regolazione, tiroxina binding globulin (TBG), e dal legame della tiroxina alla TBG. Tuttavia, la concentrazione della tiroxina totale non è sufficiente da sola a monitorare lo stato clinico. I valori della tiroxina totale nel siero possono aumentare in gravidanza o per somministrazione di contraccettivi orali. La tabella dei farmaci interferenti e le condizioni nella quali i valori di tiroxina totale sono influenzati, sono stati compilati dal Journal of the American Association of Clinical Chemists. Non usare per lo screening dei neonati 5. PROCEDIMENTO 5.1. Preparazione degli Standard (S A,S B,S C,S D,S E,S F ) Gli standard sono Human Serum Reference (STANDARD) di FT4 con concentrazioni approssimative di: S A S B S C S D S E S F ng/dl 0 0,3 0,95 2,1 3,6 7,0 Conservare a 2 8 C. I livelli esatti sono riportati nelle etichette per ogni specifico lotto Preparazione della Wash Solution Prima dell uso, diluire il contenuto di ogni fiala di soluzione di lavaggio tamponata concentrata (50x) con acqua distillata fino al volume di 1000 ml. Per preparare volumi minori rispettare il rapporto di diluizione di 1:50. La soluzione di lavaggio diluita è stabile a 2 8 C per almeno 30 giorni Preparazione del campione Raccogliere il campione mediante una siringa da 10 ml in tubi al silicone contenenti EDTA o eparina. Osservare le usuali precauzioni nella raccolta dei campioni. Separare i globuli rossi per centrifugazione e usare il siero o il plasma per la determinazione del Free T4. I campioni possono essere refrigerati at 2 8 C (per un periodo massimo di 48 ore). Se il campione non può essere testato entro le 48 ore, conservarlo a 20 C fino a 30 giorni. Se testato in duplicato sono necessari 0,10 ml di campione. La cross-reattività dell anticorpo anti Tiroxina verso sostanze selezionate è stata valutata aggiungendo sostanze interferenti ad una matrice sierica a varie concentrazioni. La cross-reattività è stata calcolata come rapporto tra le dosi della sostanza interferente e la dose di Tiroxina necessaria a spiazzare la stessa quantità di tracciante Procedimento Prima di procedere con la determinazione, portare tutti i reagenti, sieri di riferimento e controlli a temperatura ambiente C.

3 Reagente Standard Campione Bianco Standard SA-SF 50 µl Campione 50 µl Coniugato 100 µl 100 µl Agitare gentilmente la micropiastra per secondi e coprirla. Incubare 1h a temperatura ambiente C. Eliminare il contenuto della microplate per decantazione o aspirazione. Se è allontanato per decantazione, asciugare la micropiastra con carta assorbente. Aggiungere 300µL di wash solution decantare o aspirare. Ripetere 2 volte per un totale di 3 lavaggi. Può essere usato un plate washer sia manuale che automatico. Seguire le istruzioni del produttore per un uso appropriato. Se viene usata una bottiglia a spruzzo, riempire ogni pozzetto evitando bolle d aria. Decantare la soluzione di lavaggio e ripetere ancora 2 volte. TMB Substrate 100 µl 100 µl 100 µl Incubare a temperatura ambiente C per 15 minuti al riparo dalla luce. Stop Solution 100 µl 100 µl 100 µl Mescolare gentilmente per secondi. Leggere le assorbanze di ogni pozzetto a 450 nm contro il bianco (oppure usando una lunghezza d onda di riferimento a nm per minimizzare le imperfezioni dei pozzetti) con un microplate reader. I risultati devono essere letti entro trenta (30) minuti dall aggiunta della Stop Solution. 6. CONTROLLO QUALA Ogni laboratorio dovrebbe testare controlli con livelli di ipotiroide, eutiroide e ipertiroide per monitorare la performance del kit. Questi controlli devono essere trattati come sconosciuti e i valori determinati in ogni seduta. I fogli di controllo qualità dovrebbero essere mantenuti per seguire le performance dei reagenti forniti. Dovrebbero inoltre essere utilizzati pertinenti metodi statistici per verificare il trend. Ogni laboratorio dovrebbe scegliere i limiti di accettabilità delle performance del kit. Altri parametri da monitorare includono le intercette 80, 50 e 20 % della curva standard per la riproducibilità inter-assay. Inoltre, l assorbanza massima dovrebbe rispecchiare i valori delle sedute precedenti. Deviazioni significative dalle performance stabilite possono indicare un inosservato cambio di condizioni sperimentali o degradazione dei reagenti del kit. Usare reagenti freschi per determinare le ragioni delle variazioni. 7. LIMAZIONI LLA PROCEDURA 7.1. Prestazioni dell analisi Standards e controlli sierici possono accumulare torbidità con il tempo. Questo evento non altera l accuratezza o le performance del test. Utilizzare i componenti fino a esaurimento o fino alla data di scadenza riportata sull etichetta. Non usare campioni microbiologicamente contaminati, così come campioni altamente lipemici o emolizzati. E importante che il tempo di reazione di ogni pozzetto sia lo stesso per la riproducibilità dei risultati. Il tempo di dispensazione dei pozzetti non deve essere superiore a (10) minuti. Se si protrae per oltre 10 minuti si raccomanda di seguire l ordine di dispensazione. Se si utilizza più di una micropiastra, ripetre la curva Standard in ogni piastra. L addizione del TMB Substrate dà inizio a una reazione cinetica, la quale termina con l aggiunta della Stop Solution. Pertanto l addizione del TMB Substrato e della Stop Solution deve avvenire nella stessa sequenza per eliminare differenti tempi di reazione. I lettori di micropiastre misurano le OD verticalmente. Non toccare il fondo dei pozzetti. La non completa aspirazione della soluzione di lavaggio dai pozzetti può dar luogo a cattivi replicati e a falsi risultati Interpretazione dei risultati Se per calcolare i risultati è stato usato il computer, è imperativo che i valori dei calibratori cadano entro il 10% delle concentrazioni assegnate. 8. RISULTATI 8.1. Note Assorbanza (STD A) = OD >1, Curva Standard Tracciare il grafico delle assorbanze di ciascuno standard (S A S F ) in funzione delle concentrazioni. Non calcolare le assorbanze medie dei duplicati prima di aver tracciato gli standard sul grafico Tracciare la miglior curva passante per i punti standard (es: Four Parameter Logistic) Calcolo dei risultati Interpolare, dal grafico, i valori di assorbanza relativi a ciascun campione e leggerne la corrispondente concentrazione in ng/dl. 9. VALORI DI RIFERIMENTO Uno studio di popolazione adulta eutiroide è stato utilizzato per determinare i valori attesi per il FT4 EIA K. Media (ng/dl) SD Range (ng/dl) Adulti 1,4 0,6 0,8 2,0 Gravidanza 1,5 0,7 0,8 2,2 10. PARAMETRI CARATTERISTICI Precisione Intra-Assay La variabilità all interno dello stesso kit è stata determinata replicando (20x) la misura di tre differenti sieri di controllo. La variabilità intra-assay è 10,98%.

4 Inter-Assay La variabilità tra kit differenti è stata determinata replicando (10x) la misura di tre differenti sieri con kit appartenenti a lotti diversi. La variabilità inter-assay è 10,81% Sensibilità La concentrazione minima di FT4 misurabile è 0,05 ng/dl con un limite di confidenza del 95% Specificità La cross-reattività dell anti-tiroxina verso determinate sostanze è stata determinata aggiungendo le soluzioni interferenti a una matrice di siero a varie concentrazioni. La cross-reattività è stata calcolata analizzando il rapporto tra la concentrazione di sostanze interferenti e la concentrazione di Tiroxina necessaria per spiazzare la stessa quantità di coniugato: Sostanza Cross-reattività Concentrazione l -Thyroxine 1, d -Thyroxine 0, µg/dl l-triiodo-thyronine 0, µg/dl d-triiodo-thyronine 0, µg/dl Monoiodo-Tyrosine N/D 100 µg/ml Diiodo-Tyrosine N/D 100 µg/ml Triiodothyroacetic Acid N/D 100 µg/ml Tetraiodothyroacetic Acid 0, µg/ml Correlazione contro riferimento RIA Il kit FT4 (Diametra) è stato comparato con un kit disponibile in commercio. Sono stati testati 197 campioni di siero. La curva di regressione è: (FT4 RIA) = 0,952*(FT4 Diametra) + 0,103 r 2 = 0, DISPOSIZIONI PER LO SMALTIMENTO I reagenti devono essere smaltiti in accordo con le leggi locali. BIBLIOGRAFIA Barker, S.B, JBC 173, 175, (1948) Chopra, I.J, et al J. Clinical EndocrinoL, 33, 865 (1971) Young, D.S, et al Clinical Chemistry 21, 3660 (1975) Sterling, L, Cleveland CRC Press, P (1975) Ed 02/2011 DCM038-7 DiaMetra S.r.l. Headquarter: Via Garibaldi, SEGRATE (MI) Tel Fax Manufactory: Via Giustozzi, 35/35a Z.I Paciana FOLIGNO (PG) ALY. Tel Fax info@diametra.com

5 FT4 for routine analysis Direct immunoenzymatic determination of FT4 in human serum or plasma. IVD LOT See external label Σ = 96 tests REF DKO038 INTEND USE Immunoenzymatic colorimetric method for quantitative determination of FT4 (Free Thyroxine) concentration in human serum or plasma. FT4 kit is intended for laboratory use only. 1. CLINICAL SIGNIFICANCE The thyroid hormone, thyroxine (T4) is produced by the thyroid gland. An important component in the synthesis is iodine. The major form of thyroid hormone in the blood is thyroxine (T4). Thyroxine is converted to the active T3 (three to four times more potent than T4) within cells by deiodinases (5'- iodinase). Thyroxine-binding globulin (T) is the major carrier protein for circulating thyroid hormone. Only a very small fraction of the circulating hormone is free (unbound) - T4 0.03%. When thyroid hormone is bound, it is not active, so the amount of FT3/FT4 is what is important. For this reason, measuring total thyroxine in the blood can be misleading. The concentration of free thyroid hormones in the blood is regulated by a negative feedback mechanism involving TSH. The binding of T4 by TBG plays a key role in this feedback mechanism and the most significant changes that occur in T4 binding capacity are the result of alterations in TBG. Changes in the circulating levels of TBG will result in a proportional increase or decrease in the concentration of total T4. However, measurement of serum FT4 is unaffected by changes in T4 protein binding levels and therefore correlates well with the functional thyroid state in most individuals. Factors responsible for discrepancies between serum total T4 levels and true thyroid states include TBG concentration, estrogenic hormones (pregnancy, oral contraceptives and estrogen) and drugs that bind to TBG preventing its binding to FT4 The thyronines act on the body to increase the basal metabolic rate, affect protein synthesis and increase the body's sensitivity to catecholamines (such as adrenaline) by permissiveness. The thyroid hormones are essential to proper development and differentiation of all cells of the human body. These hormones also regulate protein, fat, and carbohydrate metabolism, affecting how human cells use energetic compounds. Numerous physiological and pathological stimuli influence thyroid hormone synthesis. Thyrotoxicosis or hyperthyroidism is the clinical syndrome caused by an excess of circulating free thyroxine, free triiodothyronine, or both. Both T 3 and T 4 are used to treat thyroid hormone deficiency (hypothyroidism). 2. PRINCIPLE The essential reagents required for a solid phase enzyme immunoassay include immobilized antibody, enzyme-antigen conjugate and native antigen. Upon mixing immobilized antibody, enzyme-antigen conjugate and a serum containing the native free antigen, a competition reaction results between the native free antigen and the enzyme-antigen conjugate for a limited number of unsolubilized binding sites. The interaction is illustrated by the following equation: Enz. Ag + Ag + Ab cw K a AgAb cw + Enz. Ag Ab cw K -a Ab cw : Monospecific immobilised antibody (constant quantity) Ag: Native Antigen (variable quantity) Enz.Ag.:Enzyme-Antigen conjugate (constant quantity) Ag Ab cw : Antigen-Antibody complex Enz Ag Ab cw : Enzyme-antigen conjugate-antibody complex K a : Rate constant of association K -a : Rate constant of disassociation K= k a /k -a : Equilibrium constant After equilibrium is attained, the antibody-bound fraction is separated from unbound antigen by decantation or aspiration. The enzyme activity in the antibody-bound fraction is inversely proportional to the native free antigen concentration. By utilizing several different serum references of known antigen concentration, a dose response curve can be generated from which the antigen concentration of an unknown can be ascertained.

6 3. REAGENTS, MATERIALS AND INSTRUMENTATION 3.1. Reagents and materials supplied in the kit 1. FT4 Standards (6 vials, 1 ml each) STD A REF DCE002/ STD B REF DCE002/ STD C REF DCE002/ STD D REF DCE002/ STD E REF DCE002/ STD F REF DCE002/ Conjugate (1 vial, 12 ml) FT4 conjugated with Horseradish peroxidase (HRP) REF DCE002/ Coated Microplate (1 microplate breakable) Anti FT4 IgG adsorbed on microplate REF DCE002/ TMB Substrate (1 vial, 15 ml) H 2 O 2 -TMB 0.26 g/l (avoid any skin contact) REF DCE Stop Solution (1 vial, 15 ml) Sulphuric acid 0.15 mol/l (avoid any skin contact) REF DCE X Conc. Wash Solution (1 vial, 20 ml) NaCl 45 g/l; Tween g/l REF DCE Reagents necessary not supplied Distilled water 3.3. Auxiliary materials and instrumentation Automatic dispenser Microplates reader (450 nm) Note Store all reagents between 2 8 C in the dark. Open the bag of reagent 3 (Coated Microplate) only when it is at room temperature and close immediately after use. 4. PRECAUTIONS Store all kit components at 2 8 C, do not use after expiration date. Reagents are sable for 60 days at 2 8 C Avoid the exposure of reagent TMB/H 2 O 2 to directed sunlight, metals or oxidants. All products that contain human serum have been found to be non reactive for Hepatitis B surface Antigen, HIV 1 & 2 and HCV Antibodies by FDA required tests. Since no known test can offer complete assurance that infectious agents are absent, all human serum products should be handled as potentially hazardous and capable of transmitting diseases. Good laboratory procedures for handling blood products can be found in the Center for Diease Control / National Institute of Health Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboatories 2 nd edition, 1988, HHS Publication n. (CDC) Total serum thyroxine concentration is dependent upon a multiplicity of factors: thyroid gland function and its regulation, thyroxine binding globulin (TBG) concentration, and the binding of thyroxine to TBG (3, 4). Thus, total thyroxine concentration alone is not sufficient to assess clinical status. Total serum thyroxine values may be elevated under conditions such as pregnancy or administration of oral contraceptives. A T3 uptake test may be performed to estimate the relative TBG concentration in order to determine if the elevated T4 is caused by TBG variation. A table of interfering drugs and conditions, which affect total thyroxine values, has been compiled by the Journal of the American Association of Clinical Chemists. Not intended for newborn screening. 5. PROCEDURE 5.1. Preparation of the Standards (S A,S B,S C,S D,S E,S F ) The serum are Human Serum Reference (STANDARD) for free thyroxine at approximate* concentrations of: S A S B S C S D S E S F ng/dl Store at 2-8 C. A preservative has been added. Exact levels are given on the labels on a lot specific basis Preparation of Wash Solution Dilute the contents of each vial of the buffered wash solution concentrate (50x) with distilled water to a final volume of 1000 ml prior to use. For smaller volumes respect the 1:50 dilution ratio. The diluted wash solution is stable for 30 days at 2 8 C Preparation of the Sample Collect sample(s) by venipuncture in ten (10) ml silicone evacuated tube(s) or evacuated tube(s) containing EDTA or heparin. The usual precautions in the collection of venipuncture samples should be observed. Separate the red blood cells by centrifugation use serum or plasma for the total T4 procedure. Specimen(s) may be refrigerated at 2-8 C for a maximum period of 48 hours. If the specimen(s) cannot be assayed within 48 hours, the sample(s) may be stored at temperatures of -20 C for up to 30 days. When assayed in duplicate, ml of the specimen is required. The cross-reactivity of the thyroxine antibody to selected substances was evaluated by adding the interfering substance to a serum matrix at various concentrations. The crossreactivity was calculated by deriving a ratio between doses of interfering substance to dose of thyroxine needed to displace the same amount of tracer Procedure Before proceeding with the assay, bring all reagents, serum references and controls to room temperature C.

7 Reagent Standard Sample Blank Standard SA-SF 50 µl Sample 50 µl Conjugate 100 µl 100 µl Swirl the microplate gently for seconds to mix and cover. Incubate 60 minutes at room temperature C. Discard the contents of the microplate by decantation or aspiration. If decanting, blot the plate dry with absorbent paper. Add 300µl of wash buffer, decant (tap and blot) or aspirate. Repeat 2 additional times for a total of 3 washes. An automatic or manual plate washer can be used. Follow the manufacturer s instruction for proper usage. If a squeeze bottle is employed, fill each well by depressing the container (avoiding air bubbles) to dispense the wash. Decant the wash and repeat 2 additional times. TMB substrate 100 µl 100 µl 100 µl Incubate at room temperature C for 15 minutes. Stop solution 100 µl 100 µl 100 µl Mix gently for seconds. Measure the absorbance at 450 nm against Blank (or using a reference wavelength of nm to minimize well imperfections) in a microplate reader. The results should be read within 30 minutes of adding the stop solution. 6. QUALY CONTROL Each laboratory should assay controls at levels in the hypothyroid, euthyroid and hyperthyroid range for monitoring assay performance. These controls should be treated as unknowns and values determined in every test procedure performed. Quality control charts should be maintained to follow the performance of the supplied reagents. Pertinent statistical methods should be employed to ascertain trends. The individual laboratory should set acceptable assay performance limits. Other parameters that should be monitored include he 80, 50 and 20% intercepts of the standard curve for run-to-run reproducibility. In addition, maximum absorbance should be consistent with past experience. Significant deviation from established performance can indicate unnoticed change in experimental conditions or degradation of kit reagents. Fresh reagents should be used to determine the reason for the variations. 7. LIMATIONS OF PROCEDURE 7.1. Assay Performance Serum references and controls may exhibit cloudiness with time. This occurrence does not affect the accuracy or performance of the test. Use until exhausted or until expiration date on the label. It is important that the time of reaction in each well is held constant for reproducible results. Pipetting of samples should not extend beyond ten (10) minutes to avoid assay drift. If it lasts more than ten minutes, follow the same order of dispensation. If more than one (1) plate is used, it is recommended to repeat the dose response curve. Addition of the TMB Substrate solution initiates a kinetic reaction, which is terminated by the addition of the Stop Solution. Therefore, the TMB Substrate solution and the Stop Solution should be added in the same sequence to eliminate any time deviation during reaction. Plate readers measure vertically. Do not touch the bottom of the wells. Failure to remove adhering solution adequately in the aspiration or decantation wash step(s) may result in poor replication and spurious results Interpretation of results If computer controlled data reduction is used to calculate the results of the test, it is imperative that the predicted values for the calibrators fall within 10% of the assigned concentrations. 8. RULTS 8.1. Note Maximum Absorbance (A calibrator) = O.D > Mean Absorbance Calculate the mean of the absorbance (Em) for each point of the standard curve and of each sample Standard Curve Plot the mean value of absorbance of the standards (Em) against concentration. Draw the best-fit curve through the plotted points. (es: Four Parameter Logistic) Calculation of Results Interpolate the values of the samples on the standard curve to obtain the corresponding values of the concentrations expressed in ng/dl. 9. REFERENCE VALU A study of euthyroid adult population was undertaken to determine expected values for the FT4 EIA Test System. The mean values, standard deviations and expected ranges are: Mean (ng/dl) SD Range (ng/dl) Adult 1,4 0,6 0,8 2,0 Pregnancy 1,5 0,7 0,8 2,2 10. PERFORMANCE AND CHARACTERISTICS Precision Intra Assay Variation Within run variation was determined by replicate measurements (20x) of three different control sera in one assay. The within assay variability is 10.98% Inter Assay Variation Between run variations was determined by replicate measurements (10x) of three different control sera in

8 different lots of kit. The between assay variability is 10.81% Sensitivity The lowest detectable concentration of FT4 that can be distinguished from the zero standard is 0.05 ng/dl at the 95 % confidence limit Specificity The cross reaction of the antibody are shown in the table: Substance Cross-reactivity Concentration l -Thyroxine 1, d -Thyroxine 0, µg/dl l-triiodo-thyronine 0, µg/dl d-triiodo-thyronine 0, µg/dl Monoiodo-Tyrosine N/D 100 µg/ml Diiodo-Tyrosine N/D 100 µg/ml Triiodothyroacetic Acid N/D 100 µg/ml Tetraiodothyroacetic Acid 0, µg/ml Correlation with RIA reference method The FT4 Microplate was compared with a coated tube radioimmunoassay method. The total number of specimens was 197. The linear regression curve was calculated: (FT4 RIA) = 0.952*(FT4 Diametra) r 2 = WASTE MANAGEMENT Reagents must be disposed off in accordance with local regulations. BIBLIOGRAPHY Barker, S.B, JBC 173, 175, (1948) Chopra, I.J, et al J. Clinical EndocrinoL, 33, 865 (1971) Young, D.S, et al Clinical Chemistry 21, 3660 (1975) Sterling, L, Cleveland CRC Press, P (1975) Ed 02/2011 DCM038-7 DiaMetra S.r.l. Headquarter: Via Garibaldi, SEGRATE (MI) Italy Tel Fax Manufactory: Via Giustozzi, 35/35a Z.I Paciana FOLIGNO (PG) Italy Tel Fax info@diametra.com

9 DIA.METRA SRL Mod. PIS PACKAGING INFORMATION SHEET Spiegazione dei simboli Explanation of symbols Explication des symboles Significado de los simbolos Verwendete Symbole Explicaçao dos simbolos In vitro Diagnostikum Producto sanitario para diagnóstico In vitro Dispositif medical de diagnostic in vitro In vitro Diagnostic Medical Device Dispositivo medico-diagnostico in vitro Dispositivos medicos de diagnostico in vitro Hergestellt von Elaborado por Fabriqué par Manufacturer Produttore Produzido por REF Bestellnummer Nûmero de catálogo Réferéncès du catalogue Catalogue number Numero di Catalogo Número do catálogo yyyy-mm Herstellungs datum Fecha de fabricacion Date de fabrication Date of manufacture Data di produzione Data de produção yyyy-mm-dd Verwendbar bis Establa hasta (usar antes de último día del mes) Utiliser avant (dernier jour du mois indiqué) Use by (last day of the month) Utilizzare prima del (ultimo giorno del mese) Utilizar (antes ultimo dia do mês) Biogefährdung Riesco biológico Risque biologique Biological risk Rischio biologico Risco biológico Gebrauchsanweisung beachten Consultar las instrucciones Consulter le mode d emploi Consult instructions for use Consultare le istruzioni per l uso Consultar instruções para uso Chargenbezeichnung Codigo de lote Numero de lot Batch code Codice del lotto Codigo do lote Σ = xx Ausreichend für n Tests Contenido suficiente para n tests Contenu suffisant pour n tests Contains sufficient for n tests Contenuto sufficiente per n saggi Contém o suficiente para n testes Cont. Inhalt Contenido del estuche Contenu du coffret Contents of kit Contenuto del kit Conteúdo do kit Min Max Temperaturbereich Límitaciôn de temperatura Limites de température de conservation Temperature limitation Limiti di temperatura Temperaturas limites de conservação

10 DIA.METRA SRL Mod. PIS PACKAGING INFORMATION SHEET SUGGERIMENTI PER LA RISOLUZIONE I PROBLEMI/TROUBLHOOTING ERRORE CAUSE POSSIBILI/ SUGGERIMENTI Nessuna reazione colorimetrica del saggio - mancata dispensazione del coniugato - contaminazione del coniugato e/o del Substrato - errori nell esecuzione del saggio (es. Dispensazione accidentale dei reagenti in sequenza errata o provenienti da flaconi sbagliati, etc.) Reazione troppo blanda (OD troppo basse) - coniugato non idoneo (es. non proveniente dal kit originale) - tempo di incubazione troppo breve, temperatura di incubazione troppa bassa Reazione troppo intensa (OD troppo alte) - coniugato non idoneo (es. non proveniente dal kit originale) - tempo di incubazione troppo lungo, temperatura di incubazione troppa alta - qualità scadente dell acqua usata per la soluzione di lavaggio (basso grado di deionizzazione) - lavaggi insufficienti (coniugato non completamente rimosso) Valori inspiegabilmente fuori scala - contaminazione di pipette, puntali o contenitori- lavaggi insufficienti (coniugato non completamente rimosso) CV% intra-assay elevato - reagenti e/o strip non portate a temperature ambiente prima dell uso - il lavatore per micropiastre non lava correttamente (suggerimento: pulire la testa del lavatore) CV% inter-assay elevato - condizioni di incubazione non costanti (tempo o temperatura) - controlli e campioni non dispensati allo stesso tempo (con gli stessi intervalli) (controllare la sequenza di dispensazione) - variabilità intrinseca degli operatori ERROR POSSIBLE CAUS / SUGGTIONS No colorimetric reaction - no conjugate pipetted reaction after addition - contamination of conjugates and/or of substrate - errors in performing the assay procedure (e.g. accidental pipetting of reagents in a wrong sequence or from the wrong vial, etc.) Too low reaction (too low ODs) - incorrect conjugate (e.g. not from original kit) - incubation time too short, incubation temperature too low Too high reaction (too high ODs) - incorrect conjugate (e.g. not from original kit) - incubation time too long, incubation temperature too high - water quality for wash buffer insufficient (low grade of deionization) - insufficient washing (conjugates not properly removed) Unexplainable outliers - contamination of pipettes, tips or containers insufficient washing (conjugates not properly removed) too high within run - reagents and/or strips not pre-warmed to CV% Room Temperature prior to use - plate washer is not washing correctly (suggestion: clean washer head) too high between-run - incubation conditions not constant (time, CV % temperature) - controls and samples not dispensed at the same time (with the same intervals) (check pipetting order) - person-related variation