PROVE PRELIMINARI PER LO SVILUPPO DI UN SENSORE NIR PER L ANALISI DEI PARAMETRI COSTITUTIVI NEL LATTE DI ASINA. G.C. Di Renzo, G. Altieri, F.
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1 Convegno di Medio Termine dell Associazione Italiana di Ingegneria Agraria Belgirate, settembre 2011 memoria n. PROVE PRELIMINARI PER LO SVILUPPO DI UN SENSORE NIR PER L ANALISI DEI PARAMETRI COSTITUTIVI NEL LATTE DI ASINA G.C. Di Renzo, G. Altieri, F. Genovese Dipartimento Tecnico Economico per la Gestione del Territorio Agricolo Forestale, Università degli Studi della Basilicata - Potenza SOMMARIO Il presente lavoro riguarda la messa a punto di un metodo di analisi basato sulla spettroscopia NIR al fine di sviluppare un sensore per il controllo di qualità del latte di asina ed adatto anche alle piccole realtà produttive. La ricerca è stata effettuata presso il lab. di macchine ed impianti del Dip. DITEC dell Univ. degli Studi della Basilicata ed in via preliminare ha riguardato esclusivamente la messa a punto di un modello per la determinazione delle proteine totali nella matrice alimentare. Dopo una prima fase di acquisizione degli spettri, i dati sono stati pretrattati ed infine sottoposti ad analisi statistica con cinque metodi differenti: a) Multiple Linear Regression (MLR); Partial Least Squares (PLS); Stepwise Regression (STPW); Tree Bagger (BTREE); Adaptive Neuro-Fuzzy Training of Sugeno Tipe Fis (ANFIS). Dai risultati si evince che la STPW (StepWise Regression) fornisce i migliori risultati soprattutto in fase di validazione. Gli errori percentuali, con un intervallo di confidenza del 95%, si attestano in calibrazione in un range di 3,3-4,8%, e in validazione in un range di 3,9-5,8%. La definizione del modello predittivo per la determinazione delle proteine nel latte d asina pone le basi per lo sviluppo di un sensore NIR a basso costo da impiegare direttamente nelle piccole e medie aziende zootecniche per il monitoraggio di questo e di altri parametri chimico-fisici. Parole chiave: latte di asina, sensore NIR, proteine. 1 INTRODUZIONE Il latte d asina, grazie alla straordinaria somiglianza con il latte materno, è attualmente l unico alimento che dà maggiori garanzie e maggiore sicurezza per nutrire bambini affetti da allergie alimentari nei primi mesi di vita che spesso non rispondono ad altre terapie (Salimei et al., 2004). La disponibilità di tale alimento è variabile nel corso dell anno, in ogni caso le quantità giornaliere prodotte sono minime se confrontate con quelle vaccine, a causa di sostanziali differenze di carattere fisiologico e morfologico dell apparato secretore (Polidori et al., 2008). In considerazione dell elevato numero di componenti degli alimenti complessi e del gran numero di alterazioni possibili, è al giorno d oggi auspicabile lo sviluppo di metodi
2 G.C. Di Renzo, G. Altieri, F. Genovese sensibili, rapidi e altamente specifici per una varietà di alimenti. Lo sviluppo di sensori basati, ad esempio, sulla spettroscopia NIR, garantisce il controllo qualità completo della materia prima (Ziolko T. et al., 2002) già a livello aziendale, anche nel caso di realtà medio - piccole. Le determinazioni basate su spettroscopia NIR, ampiamente conosciute ed utilizzate per il latte vaccino (Tsenkova et al., 2000) e per molti altri prodotti alimentari solidi e liquidi (Woodcock et al., 2008), potrebbero essere estese anche al latte di asina prodotto per il quale sono attualmente scarsi i riferimenti bibliografici disponibili (Zheng et al., 2007). Lo scopo del presente lavoro è la messa a punto di un metodo di analisi basato sulla spettroscopia NIR al fine di sviluppare un sensore per il controllo di qualità che risulti rapido, accurato, sensibile ed economico, da mettere al servizio delle piccole realtà produttive, quali le aziende produttrici di latte d asina. 2 MATERIALI E METODI Le prove sono state effettuate presso il lab. di macchine ed impianti del Dip. DITEC dell Univ. degli Studi della Basilicata. La fase sperimentale si è basata sulla effettuazione di analisi chimiche per la determinazione del contenuto in proteine nel latte di asina, secondo il metodo ufficiale (Kjeldhal) e di letture spettrofotometriche nel vicino infrarosso. Per l esecuzione delle letture NIR è stato impiegato uno spettrofotometro AvaSpec NIR256 (Avantes Inc.) a fibre ottiche basato sul design Czerny-Turner con un detector InGaAs Array con 256 pixel. AvaSpec-NIR256 include un convertitore analogico/digitale 16 bit ed un interfaccia USB2.0 ad alta velocità; gli spettri ottenuti sono stati acquisiti mediante il software AvaSoft-Basic. I dati raccolti, relativi a 61 campioni di latte d asina forniti da un azienda lucana e da due aziende pugliesi sono stati successivamente trattati statisticamente al fine di elaborare un modello di correlazione. L analisi dei dati, la creazione del modello predittivo e la sua validazione sono state realizzate mediante il software MATLAB. 2.1 Trattamento ed analisi dei campioni I campioni di latte di asina, prelevati presso le aziende e trasportati in regime di temperatura controllata in laboratorio, sono stati congelati prima del loro utilizzo e scongelati prima dell utilizzo. Dopodiché il campione, prelevato con una pipetta Pasteur, è stato versato nell apposita cuvetta dello spettrofotometro NIR e sono stati acquisiti gli spettri nel campo nm. È stata utilizzata acqua come riferimento per il bianco. 2.2 Elaborazione statistica dei dati Al fine di interpretare correttamente gli spettri acquisiti è stato condotto un pretrattamento dei dati spettrali mediante derivazione e normalizzazione. Al tal fine, in assenza di regole certe che permettessero di scegliere tra l uno o l altro metodo di pretrattamento si è proceduto per tentativi, selezionando il metodo in base alla capacità di fornire un modello con l'attendibilità previsionale migliore.
3 Prove preliminari per lo sviluppo di un sensore NIR per l analisi dei parametri costitutivi nel latte di asina Figura 1. Spettri acquisiti durante le letture spettrofotometriche nel vicino infrarosso del latte d asina. I dati pretrattati sono stati sottoposti ad analisi statistica con cinque metodi differenti: Multiple Linear Regression (MLR); Partial Least Squares (PLS); Stepwise Regression (STPW); Tree Bagger (BTREE); Adaptive Neuro-Fuzzy Training of Sugeno Type Fis (ANFIS). 3 RISULTATI E DISCUSSIONE Il primo passo nella creazione di un modello previsionale che consenta la determinazione delle proteine totali nel latte d asina è stato quello di valutare il livello di correlazione, mediante il coefficiente di correlazione (R 2 ), tra le variabili dipendenti (y) e i raggruppamenti delle variabili indipendenti precedentemente creati (λ). Sia il valore di R 2 medio che il valore di quello massimo non risultano essere eccessivamente elevati per cui si è passati a valutare i coefficienti di correlazione su dati sottoposti a diverse tipologie di trattamento per valutare quale fosse più idoneo per l ottenimento di un modello robusto. Sui dati è stato innanzitutto effettuato il calcolo della derivata, da ciò abbiamo ottenuto i risultati in Tabella 1. Un successivo trattamento dei dati ha previsto la sola normalizzazione (cfr. Tabella 2). I dati normalizzati presentano coefficienti di correlazione inferiori ai dati derivati, inoltre, anche rispetto ai dati non trattati il coefficiente di correlazione medio risulta essere notevolmente più basso mentre quello massimo presenta una leggera crescita.
4 G.C. Di Renzo, G. Altieri, F. Genovese Inoltre è stato valutato l andamento dei coefficienti di correlazione su dati sia normalizzati che derivati (Tabella 3). Dai dati si evince che il trattamento che conduce a risultati migliori è la derivata dei dati. Per l analisi delle proteine si è preferito lavorare con la curva dei massimi R 2 ottenuti dalla correlazione sulle n variabili indipendenti piuttosto che con la media degli R 2 ottenuti dalla correlazione sulle n variabili indipendenti; in questo modo il numero delle variabili è stato ridotto a 26. Successivamente si è proceduto all applicazione delle diverse metodologie statistiche, con i seguenti risultati, riportati in Tabella 4. Figura 2. Andamento del coefficiente di correlazione in funzione del numero delle variabili indipendenti non normalizzate e non derivate. Indice R 2 Medio Max Tabella 1. R 2 medio e massimo con numero di variabili indipendenti corrispondenti: dati normalizzati. Indice R 2 Medio Max Tabella 2. R 2 medio e massimo con numero di variabili indipendenti corrispondenti: dati derivati.
5 Prove preliminari per lo sviluppo di un sensore NIR per l analisi dei parametri costitutivi nel latte di asina Indice R 2 Medio Max Tabella 3. R 2 medio e massimo con numero di variabili indipendenti corrispondenti: dati derivati e normalizzati. Overall samples number=161 Calibration Validation Outliers RMSEV/RMSEC RMSE R 2 RMSE R 2 MLR 0,334 0,994 0,464 0, PLS 0,376 0,992 0,512 0, STPW 0,315 0,995 0,377 0, BTREES 0,150 0,999 0,414 0, ANFIS 0,527 0,987 0,707 0, Tabella 4. Risultati ottenuti dal confronto dei cinque metodi statistici per la messa a punto di un modello di predizione per le proteine totali nel latte di asina. Dai dati riportati si evince che il modello migliore in fase di calibrazione è il BTREES, questo però presenta dei problemi in fase di validazione con un valore di RMSEV pari a 0,414. Inoltre, per quanto riguarda il rapporto RMSEV/RMSEC, indice della bontà del modello (quanto più questo rapporto si avvicina a 1 tanto migliore è il modello) si osserva una pessima prestazione del BTREES. Di contro, l STPW presenta un RMSEC più elevato del BTREES ma più basso di tutti gli altri modelli, mentre l RMSEV è in assoluto il più basso di tutti così come il rapporto RMSEV/RMSEC. Infine la performance peggiore è da imputare al modello ANFIS. L MLR non ha dato risultati eccessivamente negativi mentre la PLS ha mostrato un comportamento accettabile in calibrazione, tale comportamento peggiora in validazione. In termini di errore percentuale l STPW (StepWise Regression) presenta, con un intervallo di confidenza del 95%, un errore in calibrazione nell intervallo 3,3-4,8%, e in validazione del 3,9-5,8%, mentre per il modello MLR l errore percentuale nella fase di calibrazione rimane sul 3,5-5,1% ed in validazione nell intervallo 4,8-7,1%. Per quanto concerne il modello PLS, questo presenta un comportamento simile al modello MLR, con un peggioramento in fase di validazione (errore percentuale di 5,4-7,9%). 4 CONCLUSIONI Nel presente lavoro si giunge alla definizione di un modello predittivo per la determinazione delle proteine mediante spettroscopia NIR nel latte d asina, al fine di sviluppare un sensore NIR a basso costo da impiegare direttamente nelle piccole e medie aziende zootecniche per il monitoraggio dei principali parametri chimico-fisici. Il primo passo per la creazione del modello è stato l acquisizione degli spettri, successivamente è stato necessario pretrattare i dati riducendo il numero delle variabili e lavorando con intervalli di frequenza in cui la correlazione tra variabili dipendenti e
6 G.C. Di Renzo, G. Altieri, F. Genovese variabili indipendenti è massima. Infine, i dati pretrattati sono stati sottoposti ad analisi statistica utilizzando cinque metodi. Dai risultati si evince che la STPW (StepWise Regression) fornisce i migliori risultati soprattutto in fase di validazione. Gli errori percentuali, con un intervallo di confidenza del 95%, si attestano in calibrazione in un range di 3,3-4,8%, e in validazione in un range di 3,9-5,8%. Per il modello MLR l errore percentuale nella fase di calibrazione si attesta a valori che vanno da 3,5 a 5,1% raggiungendo in validazione valori di 4,8-7,1% pertanto esso dà dei buoni risultati nonostante errori percentuali più alti della STPW. Per quanto concerne il modello PLS, questo presenta un comportamento simile al modello MLR, con un peggioramento in fase di validazione (errore percentuale di 5,4-7,9%). Il modello BTREES, invece, dà ottimi risultati in calibrazione e risultati accettabili in validazione, ma il rapporto tra RMSEV/RMSEC lo penalizza per il parametro in esame. Infine l impiego del modello ANFIS è sconsigliato per la determinazione delle proteine. In futuro la ricerca prevede l analisi di ulteriori campioni di latte di asina, anche provenienti da allevamenti diversi, allo scopo di rendere più robusto il modello di predizione. Inoltre si rende necessario anche un ampliamento dei parametri chimici considerati, estendendoli ad esempio al contenuto in grasso e lattosio ed al lisozima. BIBLIOGRAFIA Polidori P., Beghelli D., Mariani L., Vincenzetti S. Donkey milk production: state of the art, Ital. J. Anim. Sci., 2008, 8(2), Tsenkova R., Atanassova S., Itoh K., Ozaki Y. e Toyoda K. Near infrared spectroscopy for biomonitoring: cow milk composition measurement in a spectral region from 1100 to 2400 nanometers, J. Anim. Sci,. 2000, 78, Salimei E., Fantuz F., Coppola R., Chiofalo B., Polidori P., Varisco G. Composition and charateristics of ass s milk, Animal Research, 2004, 53: Zheng L.M., Zhang L.D., Guo H.Y., Pang K., Zhang W.J., Ren F.Z. Optimizing spectral region in using near-infrared spectroscopy for donkey milk analysis, Journal of Near Infrared Spectroscopy, 2007, 18(2), Ziolko T., Ferri M., Pucciarelli A., Pace C. La spettroscopia NIR per la valutazione dei parametri nutrizionali del latte. Pubblicazione Buchi Italia s.r.l., Woodcock T., Downey G., O Donnell C. P. Review: Better quality food and beverages: the role of near infrared spectroscopy, Journal of Near Infrared Spectroscopy, 2008, 16(1), 1-29.
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