LA SITUAZIONE DELLA RESISTENZA: ESPERIENZE IN

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1 TIGNOLETTA DELLA VITE LA SITUAZIONE DELLA RESISTENZA: ESPERIENZE IN LABORATORIO E IN PIENO CAMPO Cassanelli S. - Dip. Sci. della Vita - Univ. di Modena e Reggio Emilia Pradolesi G., Casali G.,Garcia L., Pagni M.R. - Terremerse Civolani S. - Dip. Sci. della Vita e Biotec.- Univ. Ferrara; Centro di Saggio Innovaricerca Butturini A. - Servizio Fitosanitario Regione Emilia-Romagna Incontro tecnico VITE - Problemi fitosanitari e strategie di difesa 27 Febbraio Sala Zanelli Fiera di Faenza

2 LA RESISTENZA DELLA TIGNOLETTA AGLI INSETTICIDI È UN RISCHIO REALE E noto che molte specie di insetti hanno sviluppato nel tempo la capacità di tollerare dosi di sostanze attive che normalmente causerebbero la morte della maggior parte degli individui In diversi vigneti della provincia di Ravenna, a partire dalla metà degli anni 2000, sono stati segnalati evidenti cali di efficacia di alcuni prodotti utilizzati per la difesa della tignoletta

3 IL RISCHIO DI RESISTENZA può riguardare.. prodotti utilizzati da tempo nella difesa dei vigneti - uso ripetuto negli anni e su generazioni consecutive dell insetto, di sostanze attive appartenenti al medesimo gruppo chimico (stesso meccanismo di azione) prodotti di recente introduzione anche con nuove modalità di azione - uso ripetuto e su generazioni consecutive - la selezione di insetti resistenti può essere accelerata nelle popolazioni che presentano un alterata attività di detossificazione delle sostanze tossiche ereditata da un precedente processo di selezione.

4 Prova di campo Villa Prati (Ra) anno 2010 (II Gen) 45 41, N medio acini colpiti /grappolo ,1 25, ,3 9,9 5 3,9 3,3 3,8 0 2,5 Testimone Flufenoxuron Indoxacarb Chlorpiriphos Methoxyfenozide Rynaxypyr Bacillus th. Spinosad Emamectina benzoato

5 PIANO DI MONITORAGGIO DELLA RESISTENZA P.S.R MISURA 214 Azione 1.3. Biosaggi > Come Verifica risponde della risposta la popolazione in laboratorio indagata a ai diversi dosaggi di sostanza delle singole attiva s. a a. > confronto Scostamento con la dalla risposta risposta di una di una popolazione di riferimento sensibile Test biochimici > Quali Indagine sono su i meccanismi eventuali meccanismi enzimatici coinvolti enzimatici nella coinvolti detossificazione nella detossificazione > Come Verifica cambia di eventuali l attività cambiamenti enzimatica dello nel tempo stato della a seguito resistenza delle nel linee tempo di difesa adottate (regressione della resistenza?) + sensibili in presenza di resistenza Prove di campo > Verifica Resistenza della pratica resistenza in campo pratica alle in dosi di campo etichettalle dosi di etichetta

6 LA SITUAZIONE DELLA RESISTENZA: ESPERIENZE IN LABORATORIO Biosaggi e test biochimici

7 PIANO DI MONITORAGGIO DELLA RESISTENZA P.S.R MISURA 214 Azione 1.3. POPOLAZIONI E SOSTANZE ATTIVE TESTATE IN LABORATORIO DAL 2011 AL 2014 FE 1 RA 2 RA 3 RA 4 * Filo di Argenta Bizzuno Conselice Bagnacavallo indoxacarb X X X X X X X X metoxifenozide X X X X X X X X spinosad X X emamectina X X X X X X X X X chloratraniliprole X X X X X X X X X * Attività finanziata da Fondazione Cassa di Risparmio di Reggio Emilia - Pietro MANDORI

8 TEST DI LABORATORIO Biosaggi - La metodologia La suscettibilità delle larve neonate è stata valutata su dieta artificiale trattata incorporandone il principio attivo a diversi dosaggi stabilite dai ricercatori dieta viene distribuita in pozzetti entomologici e deposizione di singole larve neonate testimone non trattato in cui la dieta è reidratata solo con acqua distillata. dopo 4 giorni o 17 giorni di incubazione di incubazione a 22 C valutata la mortalità delle larve a diversi formulati Protocollo Charmillot et al. [Revue suisse Vitic. Arboric.Hortic.Vol. 36 (3): , 2004] Sostanza attiva Formulato DL 90 Metoxifenozide Prodigy SC 0,15 ppm Indoxacarb Steward 30 WG 0,4 ppm Spinosad Laser SC 1,5 ppm Metodo N 017 approvato da IRAC (per L1) Sostanza attiva Formulato D.L 50 DL 70 DL 90 Chlorantraniliprol e Coragen 20 SC 0,100 ppm 0,170 ppm 0,450 ppm Emamectinabenzoato Affirm 0,002 ppm 0,007 ppm 0,015 ppm

9 TEST DI LABORATORIO Test biochimici - La metodologia Si valuta sulle singole larve la capacità di detossificare le sostanze insetticide, sulla base del livello di attività dei principali gruppi di enzimi coinvolti. Tanto più il livello di attività è grande, tanto più le larve riescono a sopravvivere se vengono a contatto con l insetticida testato. Bouvier et al. (2002) e Rodríguez et al validato per L.botrana da Dip. di Scienze della Vita Università di Modena e Reggio Emilia Monossigenasi (MFO) Carbossilesterasi (EST) Glutatione-S-transferasi (GST)

10 TEST DI LABORATORIO Biosaggi - I risultati RA 4 (Bagnacavallo) mortalità Henderson-Tilton (%) mortalità Henderson- Tilton (%) RA 2 (Bizzuno) 0 indoxacarb metoxifenozide rynaxypyr mortalità riscontrata mortalità attesa indoxacarb metoxifenozide emamectina mortalità riscontrata mortalità attesa

11 RA 3 (Conselice) e FE 1(Filo d Argenta) LE STRATEGIE DI DIFESA RA 3 FE 1 methyl parathion tebufenozide flufenoxuron metoxyfenozide indoxacarb in Difesa Integrata Avanzata RA 3 FE 1 spinosad Bacillus th. Thiametoxam (Scafoideo) Fuori dai programmi di P.I/ interventi anche in I generazione emamectina Rynaxypyr Bacillus th. Clorpirifos (scafoideo)

12 TEST DI LABORATORIO Biosaggi - I risultati Azienda RA mortalità Henderson-Tilton (%) indoxacarb metoxifenozide spinosad rynaxypyr emamectina mortalità riscontrata mortalità attesa

13 TEST DI LABORATORIO Biosaggi - I risultati Azienda FE mortalità Henderson-Tilton (%) indoxacarb metoxifenozide rynaxypyr emamectina mortalità riscontrata mortalità attesa

14 TEST DI LABORATORIO Attività enzimatica delle larve raccolte in campo nel 2014 Rapporto attività en nzimatica pop campo/pop.se ensibile 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 MFO GST EST E alterata in seguito alla selezione operata nel tempo dall impiego dei prodotti MFO GST FE 1 RA 3 EST

15 TEST DI LABORATORIO Attivita enzimatica delle larve sopravvissute dopo trattamento in laboratorio dopo sostanze selezione con azienda MFO GST EST Indoxacarb FE 1 RA 3 Metoxifenozide FE 1 RA 3 Rynaxypyr FE 1 RA 3 Emamectina * FE 1 RA 3 Le larve sopravvissute al trattamento in laboratorio mostrano un incremento dell attivita enzimatica * Indice di sofferenza metabolica dovuta all intossicazione

16 LA SITUAZIONE DELLA RESISTENZA: ESPERIENZE IN PIENO CAMPO PROVE DI EFFICACIA

17 PIANO DI MONITORAGGIO DELLA RESISTENZA (PSR AZ.IONE) POPOLAZIONI E SOSTANZE ATTIVE TESTATE IN PROVE DI CAMPO FE 1 RA 3 RA 4 Filo di Argenta Conselice Bagnacavallo indoxacarb X X X metoxifenozide X X X clorpirifos ethyl X X emamectina X X X chloratraniliprole X X

18 MATERIALI E METODI azienda FE 1 e RA 3 IMPOSTAZIONE COLTURA Località:FE1Filo D Argenta (FE) RA3 Conselice(RA) Coltura: Vite da vino, cv. Merlot (Filo) e Trebbiano Romagnolo (Conselice) Forma d allevamento: GDC (Filo), Casarsa (Conselice e Bagnacavallo) IMPOSTAZIONE PROVA Disegno sperimentale: blocchi randomizzati con 4 rip. Parcelle: 4 piante (Filo), 5 piante (Conselice) 20 RILIEVI Dopo circa 3-4 settimane Numero di grappoli e di acini per grappolo danneggiati dalle larve di L. botrana TRATTAMENTI Equipaggiamento: irroratrice spalleggiata Volume:1000 l/ha (Filo) 800 l/ha (Conselice) Timing: A - inizio ovideposizione B prime uova a testa nera DATI METEO Raccolta dati durante l intero periodo di prova (stazioni regionali o private)

19 MATERIALI E METODI Az. FE 1 e RA 3 Non trattato PR RODOTTI A CO ONFRONTO STEWARD indoxacarb 30% GLADIATOR metossifenozide 240 g/l CORAGEN clorantraniliprole 200 g/l AFFIRM emamectina-benzoate 0,95% WG 150 g/ha SC 400 ml/ha SC 180 ml/ha WG 1500 g/ha A = inizio ovideposizione A = inizio ovideposizione A = inizio ovideposizione B = testa nera DURSBAN 75 WG clorpirifos-etile 75% WG 700 g/ha B = testa nera

20 PROVA FE1 FILO D ARGENTA 2014

21 MATERIALI E METODI CONDIZIONI CLIMATICHE (Argenta) Trattamenti U T Prime uova deposte Testa nera 18 GIUGNO Pre-chiusura grappolo 23 GIUGNO Pre-chiusura grappolo

22 MATERIALI E METODI MODELLO LOBESIA-MRV (FILO) Trattamenti U Prime uova deposte T Testa nera 18 GIUGNO Pre-chiusura grappolo 23 GIUGNO Pre-chiusura grappolo

23 RISULTATI TIGNOLETTA FE1 INCIDENZA GRAPPOLI 15 LUGLIO No. Acini danneggiati Le medie seguite dalla stessa lettera non differiscono significativamente (P=.05, Duncan s New MRT)

24 RISULTATI TIGNOLETTA FE1 15 EFFICACIA SUL NUMERO DI ACINI LUGLIO MAX 42% metossifenozide MIN 2% clorpirifos

25 PROVA RA3 CONSELICE 2014

26 MATERIALI E METODI CONDIZIONI CLIMATICHE (Lavezzola) Trattamenti U T Prime uova deposte Testa nera 13 GIUGNO Acini a grano di pepe 17 GIUGNO Pre-chiusura grappolo

27 MATERIALI E METODI MONITORAGGIO VOLO II GENERAZIONE T U Trattamenti U T Prime uova deposte Testa nera 13 GIUGNO Acini a grano di pepe 17 GIUGNO Pre-chiusura grappolo

28 MATERIALI E METODI MODELLO LOBESIA-MRV (MASSA LOMBARDA) Trattamenti U T Prime uova deposte Testa nera 13 GIUGNO Acini a grano di pepe 17 GIUGNO Pre-chiusura grappolo

29 RISULTATI TIGNOLETTA RA3 INCIDENZA GRAPPOLI 17 LUGLIO No. Acini danneggiati Le medie seguite dalla stessa lettera non differiscono significativamente (P=.05, Duncan s New MRT)

30 RISULTATI TIGNOLETTA RA3 17 EFFICACIA SUL NUMERO DI ACINI LUGLIO MAX 78% metossifenozide MIN 0% clorpirifos

31 PROVA RA4 BAGNACAVALLO 2011

32 MATERIALI E METODI az. RA 4 IMPOSTAZIONE COLTURA Località:RA4 Bagnacavallo (RA) Coltura: Vite da vino, cv. Trebbiano Romagnolo Forma d allevamento: Casarsa IMPOSTAZIONE PROVA Disegno sperimentale: blocchi randomizzati con 4 rip. Parcelle: 3 piante TRATTAMENTI Equipaggiamento: irroratrice spalleggiata Volume:1041 l/ha Timing: A - inizio ovideposizione B inizio schiusura

33 MATERIALI E METODI Non trattato PR RODOTTI A CO ONFRONTO metossifenozide 240 g/l SC 416 ml/ha indoxacarb 30% WG 156 g/ha indoxacarb 30% WG 156 g/ha emamectina-benzoate 0,95% WG 1568 g/ha A = inizio ovideposizione A = inizio ovideposizione B = inizio schiusura B = inizio schiusura

34 MATERIALI E METODI MONITORAGGIO VOLO II GENERAZIONE U S Trattamenti U S Prime uova deposte Inizio schiusura 16 GIUGNO 25 GIUGNO

35 MATERIALI E METODI MODELLO LOBESIA-MRV (BAGNACAVALLO) U S Trattamenti U S Prime uova deposte Inizio schiusura 16 GIUGNO 25 GIUGNO

36 RISULTATI TIGNOLETTA RA 4 INCIDENZA GRAPPOLI 25 LUGLIO No. Acini danneggiati Le medie seguite dalla stessa lettera non differiscono significativamente (P=.05, LSD)

37 RISULTATI TIGNOLETTA RA4 25 EFFICACIA SUL NUMERO DI ACINI LUGLIO MAX 93,6% Emamectina B MIN 20,9% Indoxacarb B

38 La situazione della resistenza in sintesi nelle aziende studiate buona attività ridotta attività insufficiente attività Sostanza attiva Tipologia di prove RA RA RA FE Indoxacarb campo biosaggio Metoxifenozide campo biosaggio Rynaxypyr campo biosaggio Emamectina campo biosaggio Clorpirifos etile campo biosaggio

39 In conclusione : i casi studio indicano che.. Sia in laboratorio che nella pratica di campo le aziende resistenti a indoxacarb e metoxifenozide venivano ben controllate dalle nuove sostanze attive (rynaxypyr ed emamectina) al momento della loro introduzione (2011) Nelle aziende FE1 e RA3 analizzate anche dopo il 2011, i dati dei biosaggi hanno rivelato un progressivo calo di efficacia di rynaxypyr ed in misura minore di emamectina in condizioni di laboratorio. I dati di campo del 2014 mostrano: scarsa efficacia di rynaxypyr ed emamectina in FE1 (azienda tradizionale) soddisfacente ma non ottimale efficacia di rynaxypyr ed emamectina in RA 3 (azienda in DIA)

40 In conclusione : i casi studio indicano che.. In ambedue le aziende il clorpirifos è totalmente inefficace (fosforganici da tempo esclusi nelle linee tecniche di difesa integrata per tignoletta) Ipotesi relativa al calo di efficacia di rynaxypyr: - parte degli individui selezionati da indoxacarb e metoxifenozide (tebufenozide) possedeva livelli di GST in grado di metabolizzare il rynaxypyr già prima della sua introduzione. - l applicazione di tale prodotto (anche altri? ) potrebbe averne fatto aumentare la loro consistenza.

41 Il rischio di insorgenza di resistenza va gestito adeguatamente abbandono delle sostanze per cui e accertata la resistenza confusione sessuale Bacillus thuringiensis alternanza delle sostanze attive adeguati piani di monitoraggio della resistenza studio dei meccanismi di resistenza e sviluppo di test diagnostici applicabili anche su larga scala

42 Grazie dell attenzione

43 I casi studio indicano che.. methyl parathion tebufenozide flufenoxuron metoxyfenozide indoxacarb RA 3 FE 1 selezione MFO ++ EST+ GST+ spinosad Bacillus th. Thiametoxam (Scafoideo) emamectina Rynaxypyr Bacillus th. Clorpirifos (scafoideo) RA 3 FE 1 MFO ++ EST+ GST+ MFO ++ EST+ GST+++ selezione

44 TEST DI LABORATORIO Biosaggi - La metodologia METOXIFENOZIDE, INDOCAXARB, SPINOSAD Protocollo Charmillot et al. [Revue suisse Vitic. Arboric.Hortic.Vol. 36 (3): , 2004] stabilite dagli Autori curve dose risposta delle larve neonate L1 a diversi formulati incorporazione della DL 90 nella dieta artificiale Stonefly Heliothis testimone non trattato in cui la dieta è reidratata solo con acqua distillata. dieta viene distribuita in pozzetti entomologici e deposizione di singole larve neonate incubazione in cella climatizzata a 22,2 C, 60 ± 10% RH e 16:8 L/D. Rilievo mortalità dopo 17 giorni di incubazione Sostanza attiva Formulato DL 90 Metoxifenozide Prodigy SC 0,15 ppm Indoxacarb Steward 30 WG 0,4 ppm Spinosad Laser SC 1,5 ppm

45 TEST DI LABORATORIO Biosaggi - La metodologia CHLORANTRANILIPROLE, EMAMECTINA BENZOATO Metodo N 017 approvato da IRAC (per L1) incorporazione di diverse dosi crescenti del principio attivo dopo diluizione in acqua all interno del substrato alimentare delle larve (Stonefly Heliothis Diet). testimone non trattato con dieta reidratata con acqua distillata. dieta distribuita in pozzetti entomologici e deposizione di singole larve neonate incubazione in cella climatizzata a 22,2 C, 60 ± 10% RH e 16:8 L/D. rilievo mortalità dopo 96 ore di incubazione Risultati elaborati con l analisi Probit (POLO) CURVA DOSE RISPOSTA per Coragen e Affirm nella popolazione PG1 (suscettibile di riferimento) n larve PARAMETRI ANALISI PROBIT testate Pendenza DL 50 (IC 95% ) DL 90 (IC 95% ) χ 2 g 384 2,557±0,458 n larve testate Pendenza 405 1,637±0,168 0,088 (0,022-0,140) 0,279 (0,173-1,465) PARAMETRI ANALISI PROBIT DL50 DL90 χ2 (IC95%) (IC95%) 0,005 (0,002-0,010) 0,031 (0,015-0,200) 22,374 0,476 g 115,190 0,263 Sostanza attiva Formulato D.L 50 DL 70 DL 90 Chlorantraniliprole Coragen 20 SC 0,100 ppm 0,170 ppm 0,450 ppm Emamectinabenzoato Affirm 0,002 ppm 0,007 ppm 0,015 ppm

46 TEST DI LABORATORIO Test biochimici - La metodologia Protocollo utilizzato: Bouvier et al. (2002) e Rodríguez et al validato per L.botrana da Dip. di Scienze della Vita Università di Modena e Reggio Emilia Obiettivo: valutare l attività enzimatica media della popolazione sensibile di riferimento, delle popolazioni direttamente raccolte dal campo e degli individui di tali popolazioni sopravvissute al trattamento nel biosaggio Monossigenasi (MFO) Carbossilesterasi (EST) Glutatione-S-transferasi (GST)