Biotecnologie. 2. Produzione di lievito da cucina: i lieviti costituiscono la biomassa;

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1 Biotecnologie Con il termine Biotecnologie si intende qualsiasi processo produttivo che preveda l impiego di cellule viventi o di loro componenti. Le cellule rappresentano l unità morfo-funzionale degli esseri viventi: tutti gli esseri viventi (monocellulari o pluricellulari) sono infatti costituiti da cellule. Ogni nuova cellula può derivare solo da una cellula preesistente. Nell ambito dell ingegneria biochimica le cellule sono considerate dei microreattori, in cui i nutrienti (ossia le specie chimiche scambiabili presenti nella fase abiotica= fase esterna ai microorganismi) vengono immessi, rappresentando i reagenti delle trasformazioni chimiche che avvengono all interno della cellula; in seguito alle trasformazioni metaboliche si formano nella fase biotica (costituita dai microorganismi) sostante più semplici, successivamente convertite in: Prodotti metabolici: specie chimiche prodotte e scambiabili attraverso la membrana cellulare; Componenti della biomassa: specie chimiche prodotte non scambiabili attraverso la membrana cellulare. I processi industriali basati sull impiego di microorganismi possono avere diversi obiettivi: Generazione di biomassa o di un suo specifico componente; Generazione di prodotti metabolici (metaboliti primari o secondari); Rimozione di nutrienti (processi di bonifica ambientale). Esempi di processi industriali basati sull impiego di microorganismi sono: 1. Fermentazione alcolica: l obiettivo di tale processo è la produzione di etanolo che è un prodotto metabolico; 2. Produzione di lievito da cucina: i lieviti costituiscono la biomassa; 1

2 3. Bonifica di reflui urbani. Sono di seguito elencati differenti processi fermentativi utilizzati dall uomo nel corso della storia per scopo industriale: Per microorganismi si intendono organismi viventi monocellulari o pluricellulari, invisibili ad occhio nudo. La cellula rappresenta l unità morfofunzionale degli organismi viventi. È la più piccola struttura ad essere classificabile come vivente, essendo chiusa ed autosufficiente, in grado di assumere nutrienti, di convertirli in prodotti metabolici o energia, di svolgere funzioni specializzate e di riprodursi. Tali cellule sono caratterizzate da tempi di sdoppiamento in fase liquida di circa 20 secondi. A causa della proliferazione il liquido nel quale avviene la riproduzione cellulare diventa torbido. Temperatura, ph e presenza di ossigeno sono i parametri che devono essere tenuti sotto controllo quando sono effettuati esperimenti in reattore miscelato. La proliferazione è favorita da piastre di Petri: i microorganismi sono inizialmente isolati, in seguito si forma una colonia di microorganismi identici (ogni colonia ha una morfologia caratteristica). Come vedremo è possibile anche una crescita dei microorganismi su base solida, ma quest ultima risulta meno efficiente. 2

3 Le cellule si dividono in eucariote e procariote. In tabella 1 sono riportate le caratteristiche per le quali i due tipi di cellula differiscono. Tabella 1. Classificazione cellule Cellula procariota Cellule eucariote (Lieviti) Le cellule sono avvolte da membrane cellulari flessibili, costituite prevalentemente da fosfolipidi, che determinano la selezione delle specie chimiche in ingresso ed in uscita. All esterno delle membrane si trovano le pareti cellulari, la cui funzione principale è quella di conferire rigidità e resistenza meccanica alla struttura. I costituenti principali delle cellule sono: Nucleo: contiene il materiale genetico ed è la sede di diversi processi legati alla riproduzione cellulare (replicazione e trascrizione del DNA). Citoplasma: è la porzione di cellula che circonda il nucleo ed è delimitata esternamente dalle membrane cellulari. È la sede di importanti trasformazioni come la glicolisi e la biosintesi di acidi grassi. Mitocondri: sede di importanti reazioni biochimiche come il ciclo TCA, la fosforilazione ossidativa, l ossidazione di acidi grassi e la degradazione di amminoacidi. 3

4 Reticolo endoplasmatico: sede di reazioni metaboliche, quali sintesi di lipidi e modificazione delle proteine cellulari. Vacuoli: raccolgono nutrienti di riserva o rifiuti da espellere all esterno della cellula. Vescicole: racchiudono componenti cellulari assunti dall ambiente esterno. Apparato di Golgi: indirizza, attraverso modifiche chimiche, specifici componenti cellulari verso la loro destinazione (altri organi, membrana plasmatica o ambiente esterno). Gli organismi viventi sono classificati sulla base delle cellule costituenti in procarioti ed eucarioti: ciascun dominio è costituito da sottoclassi dette regni ( a sua volta divisi in phylum, classi, ordini, famiglia, genere e specie). Sono di seguito riportati esempi di organismi viventi. La scienza che si occupa della descrizione completa delle specie individuando anche la morfologia microscopica e ad occhio nudo è la tassonomia. 4

5 Metabolismo Per metabolismo si intende il complesso di reazioni chimiche che hanno luogo in ogni organismo vivente. Attraverso le reazioni metaboliche, l energia chimica dei nutrienti (zuccheri, grassi e proteine) viene immagazzinata e successivamente impiegata per lo svolgimento delle funzioni indispensabili alla sopravvivenza della cellula, quali sintesi di componenti cellulari, mantenimento e movimento. Le reazioni metaboliche sono classificate in reazioni cataboliche (Catabolismo) e reazioni anaboliche (Anabolismo). Catabolismo È il complesso di reazioni attraverso le quali molecole complesse vengono decomposte in molecole più semplici. Carboidrati, grassi, proteine molecole piccole+ CO2+ H2O+ energia La maggior parte delle reazioni cataboliche è esoergonica ed avviene spontaneamente: l energia rilasciata per effetto delle reazioni cataboliche viene in parte immagazzinata ed in parte utilizzata per consentire lo svolgimento delle reazioni anaboliche, che sono endoergoniche. Anabolismo Si tratta del complesso di reazioni attraverso le quali, partendo da molecole semplici, vengono sintetizzati nuovi componenti cellulari e svolte funzioni necessarie per la sopravvivenza della cellula. Molecole piccole+ energia molecole complesse 5

6 L energia prodotta dalle reazioni cataboliche è recuperata trasformando ADP (contenente 2 legami fosfodiestere) in ATP (molecola contenente 3 legami fosfodiestere). ADP+ PO3+ energia molecole piccole+ CO2+ H2O+ energia ADP+ PO3+ energia ATP L energia immagazzinata sotto forma di ATP può essere spesa per far avvenire le reazioni anaboliche che sono endoergoniche e quindi termodinamicamente sfavorite. La scissione di una molecola di ATP con separazione di un gruppo fosfato determina la rottura di un legame ad alta energia e rappresenta una reazione esoergonica. L ATP può essere considerato come un serbatoio temporaneo nel quale viene immagazzinata l energia prodotta dalle reazioni cataboliche, successivamente spesa per far avvenire le reazioni anaboliche. ATP ADP+ PO3+ energia ΔG0=-7.3 kcal/mol * Molecole piccole+ energia molecole complesse Una reazione termodinamicamente sfavorita (ΔG0 >0) può aver luogo se è accoppiata ad una reazione termodinamicamente favorita se esiste un intermedio comune di reazione. Consideriamo il seguente esempio: 6

7 L accoppiamento delle due reazioni avviene attraverso la formazione di un intermedio comune: il glutammato reagisce prima con l ATP e poi con l ammoniaca. 7

8 Crescita microbica Una coltura di microorganismi è un metodo per la moltiplicazione di microorganismi in determinate condizioni operative. La coltura può avvenire in: Terreno liquido: i microorganismi sono sospesi in un terreno liquido contenente i nutrienti. Il liquido è miscelato per cui i microorganismi si distribuiscono omogeneamente nel terreno. Terreno solido: i microorganismi sono cresciuti sulla superficie di un terreno solido o al suo interno. Non essendo il terreno miscelato, i microorganismi rimangono vicini e non sono quindi in grado di spostarsi. Ciascun microorganismo può originare una colonia contenente milioni di nuovi organismi, visibile ad occhio nudo. Per sopravvivere e riprodursi i microorganismi hanno bisogno di assumere nutrienti dall ambiente esterno. La composizione chimica delle cellule ci da una indicazione su quali siano le principali esigenze nutrizionali. Gli elementi prevalenti sono C, O, N, H, P, S, che sono presenti nei principali componenti della biomassa (carboidrati, proteine, lipidi e acidi nucleici). Consideriamo per esempio la composizione elementare di una cellula di E.Coli (vedi figura). I nutrienti possono essere classificati in micronutrienti e macronutrienti. I macronutrienti sono gli elementi di cui i microorganismi hanno bisogno in quantità significative. Sono anche i maggiori componenti della biomassa. 8

9 I micronutrienti sono gli elementi necessari in quantitativi ridotti, in genere acquisiti come impurità di altri composti): esempi sono manganese, zinco, cobalto, molibdeno, nickel e rame. Alcuni microorganismi richiedono molecole organiche, come componenti cellulari e loro precursori, che l organismo è incapace di sintetizzare autonomamente e che devono essere somministrati dall ambiente esterno: essi costituiscono i fattori di crescita. I terreni di coltura possono essere sintetici (composizione nota dal punto di vista qualitativo e quantitativo) oppure complessi (composizione chimica non nota). Sono riportati di seguito esempi per entrambe le categorie. Oltre ai terreni liquidi possono essere utilizzati terreni solidi: essi consentono una crescita microbica più senta rispetto ai terreni liquidi e sono adatti per operazioni accessorie come stoccaggio, conta e selezione. Per ottenere un terreno solido si prepara prima di tutto un terreno liquido con la composizione desiderata, cui si aggiunge in seguito AGAR (1-2%). Si tratta di un polisaccaride estratto dalle alghe che gelifica a temperature inferiori ai 40 C; non è tossico né metabolizzabile dai microorganismi. In definitiva il terreno liquido è scaldato fino a temperature superiori a 40 C, si aggiunge agar ed in seguito si ha passaggio sol gel per l abbassamento della temperatura. Alcuni terreni sono selettivi, ossia arricchiti con particolari composti per favorire la crescita di specifici microorganismi allo scopo di isolare alcune specie. Un esempio è dato da terreno+antibiotici che impedisce la crescita ai batteri che non resistono agli antibiotici usati. I terreni differenziali, invece, permettono di differenziare alcune specie batteriche da altre mettendo in evidenza particolari caratteristiche metaboliche. Un esempio è terreno+sangue che evidenzia la presenza di microorganismi emolitici. Altri impieghi dei terreni solidi sono: isolamento colture pure (striscio su piastra) osservazione morfologia delle colonie (caratteristica di ogni specie) conta batterica (conta vitale) Isolamento dei microorganismi Si immerge un ansa nel campione, e si insemina su una piastra di terreno solido attraverso una serie di strisci Il primo striscio depositerà sul terreno solido un numero relativamente grande di microorganismi. Gli strisci successivi determineranno il rilascio di un numero inferiore di microorganismi, consentendo l isolamento di singole colonie. Queste operazioni sono eseguite in una cappa a flusso laminare, ossia in un ambiente fatto per conservare la sterilità dell ambiente. Il campo 9

10 di moto laminare non favorisce la miscelazione, per cui aria fuoriesce e quella presente all esterno non può entrare. Utilizzando l ansa si preleva una singola colonia e poi si depositano in una piastra diversa strisciando. Lo striscio è ripetuto più volte in più direzioni: in questo modo all aumentare del numero di strisci si ottengono colonie sempre più distinguibili morfologicamente. Classificazione dei microorganismi secondo le esigenze colturali. Fattori che influenzano la crescita microbica. I microorganismi possono essere classificati sulla base dell influenza di differenti fattori, quali temperatura, ph, concentrazione di soluti e fabbisogno di ossigeno. Temperatura Gli organismi sono distinti in psicrofili, mesofili, termofili ed ipertermofili in base alla temperatura di crescita; la maggior parte dei microorganismi noti è mesofila. ph I microorganismi sono distinti in alcalifili e acidofili a seconda che vivano in ambienti basici o acidi. 10