movimento di molecole e ioni tra i diversi scomparti dei sistemi biologici

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2 movimento di molecole e ioni tra i diversi scomparti dei sistemi biologici

3 membrana cellulare garantisce un ambiente fisicochimico altamente stabile metabolismo riproduzione sviluppo

4 eucarioti sviluppo endomembrane concentrazione substrati separazione processi incompatibili accumulo cataboliti necessità di controllare la composizione dell ambiente interno in funzione di diverse condizioni ambientali

5 IL TRASPORTO DI MEMBRANA E ALLA BASE DI MOLTI PROCESSI BIOLOGICI ESSENZIALI

6 IL TRASPORTO DI MEMBRANA E ALLA BASE DI MOLTI PROCESSI BIOLOGICI ESSENZIALI Concentrazione di nutrienti minerali essenziali Elemento Simbolo chimico Concentrazione peso secco (µg/g) Concentrazione peso fresco Azoto Potassio Calcio Magnesio Fosforo Zolfo N K Ca Mg P S ,4 mm 17,0 mm 8,3 mm 5,5 mm 4,3 mm 2,1 mm Cloro Boro Ferro Manganese Zinco Rame Molibdeno Nichel Cl B Fe Mn Zn Cu Mo Ni ,1 0, µm 123 µm 120 µm 61 µm 20,4 µm 6,2 µm 0,07 µm 0,006 µm

7 IL TRASPORTO DI MEMBRANA E ALLA BASE DI MOLTI PROCESSI BIOLOGICI ESSENZIALI L H è il principale prodotto generato dal metabolismo

8 IL TRASPORTO DI MEMBRANA E ALLA BASE DI MOLTI PROCESSI BIOLOGICI ESSENZIALI Gli zuccheri prodotti dalla fotosintesi vengono distribuiti dai siti di sintesi a quelli di accumulo secondo meccanismi che prevedono il trasporto di membrana

9 IL TRASPORTO DI MEMBRANA E ALLA BASE DI MOLTI PROCESSI BIOLOGICI ESSENZIALI Alcuni processi biochimici sono incompatibili tra loro necessità di evitare cicli futili (ex. sintesi amido e glicolisi)

10 IL TRASPORTO DI MEMBRANA E ALLA BASE DI MOLTI PROCESSI BIOLOGICI ESSENZIALI fotosintesi e respirazione Il trasporto di membrana è al centro di processi che convertono l energia libera in forme biologicamente utili

11 IL TRASPORTO DI MEMBRANA E ALLA BASE DI MOLTI PROCESSI BIOLOGICI ESSENZIALI stimolo ambientale variazione [Ca 2 ] risposta fisiologica

12 µ = * j µ RTln C j j z j FE V j P

13 µ j = µ * j RTln C j z j FE V j P potenziale chimico di j in condizioni standard

14 µ j = µ * j RTln C j z j FE V j P componente della concentrazione

15 µ j = µ * j RTln C j z j FE V j P componente della carica elettrostatica

16 µ j = µ * j RTln C j z j FE V j P componente della pressione idrostatica

17 X µ j = µ * j RTln C j z j FE V j P significativo esclusivamente nei movimenti osmotici dell acqua

18 DIFFUSIONE spostamento delle molecole secondo un gradiente di concentrazione dovuto ad agitazione termica casuale saccarosio µ i s = µ * s RTln C i s µ o s = µ * s RTln C o s

19 µ s = µ i s µ o s = = (µ * s RTln C i s) (µ * s RTln C o s) = = RT(ln C i s ln C o s) = s s = RT ln C i s C o s

20 µ s = RT ln C i s C o s µ s è proporzionale al gradiente di concentrazione All equilibrio µ = 0

21 In generale per una sostanza x: µ 1 = µ * RTln [X] 1 C 1 C 2 µ 2 = µ * RTln [X] 2 µ = µ 2 µ 1 = RTln [X] 2 [X] 1 Se [X] 2 < [X] 1 µ < 0 X diffonde spontaneamente verso C 2 Se [X] 2 > [X] 1 µ > 0 X diffonde spontaneamente verso C 1 All equilibrio [X] 1 = [X] 2 µ = 0

22 PER UNO IONE?

23 ione K µ ki = µ * RT ln C ki zfe i µ ko = µ * RT ln C ko zfe o C K i µ = RT ln i o K zf(e E ) C K o dato che z=1 C K i µ K = RT ln F(E i E o ) C K o

24 relazione tra il potenziale chimico µ e il trasporto di molecole attraverso una membrana

25 cosa succede se una membrana ha una permeabilità maggiore per il K che per il Cl? Il potenziale di membrana che si genera è detto potenziale di diffusione il potenziale di diffusione ritarda l ingresso di K e accelera quello di Cl

26 PRINCIPIO DELL ELETTRONEUTRALITÀ una soluzione contiene sempre un numero uguale di anioni e cationi la presenza di un potenziale di membrana indica una distribuzione disuguale degli ioni attraverso la membrana 100 mv un anione in più su

27 relazione tra il potenziale di membrana e la distribuzione di ioni quando la distribuzione di un soluto attraverso la membrana raggiunge l equilibrio, il flusso passivo (J) è lo stesso in entrambe le direzioni J o i = J i o

28 All equilibrio per uno ione j µ jo = µ j i µ j* RT ln C jo z j FE o = µ j* RT ln C ji z j FE i E i E o = RT z j F ln C j o C j i E = RT z j F ln C j o C j i

29 Per uno ione monovalente E = 59 mv log C j o C j i all equilibrio, la differenza di concentrazione di uno ione tra due scomparti è bilanciata dalla differenza di campo elettrico tra gli scomparti se E = 59 mv catione monovalente catione bivalente anione monovalente E = 59 log C j o C j o = 10 C j i C j i E = 59 log C j o 2 C j o = 100 C j i C j i E = 59 log C j o C j i C j o = 0.1 C j i

30 tutte le cellule possiedono un potenziale di membrana, dovuto alla distribuzione asimmetrica degli ioni tra l interno e l esterno della cellula 240 mv < E > 60 mv

31 Iperpolarizzazione Iperpolarizzazione della membrana Depolarizzazione Depolarizzazione della membrana E = 120 mv E = 180 mv E = 60 mv

32 E = 110 mv la misura della concentrazione dei vari ioni permette di distinguere tra trasporto attivo e passivo

33 diffusione trasporto attivo

34 E calcolato con l equazione di Goldman = 50/ 50/40 mv E E misurato sperimentalmente = 240/ 240/60 mv

35 qual è la componente aggiuntiva? CN aumento ph apoplasto l diminuzione ph citosol l H è lo ione trasportato elettrogenicamente

36 I potenziali di membrana delle cellule vegetali sono il risultato di due componenti Potenziale di diffusione Trasporto elettrogenico

37 TRASPORTO PASSIVO µ < 0 il trasporto avviene spontaneamente senza consumo di energia TRASPORTO ATTIVO µ > 0 il trasporto non avviene spontaneamente ma solo con consumo di energia

38 C j i µ j = RT ln z j F(E i E o ) < 0 C j o Il trasporto avviene secondo GRADIENTE ELETTROCHIMICO Per una molecola non carica (z j =0) il trasporto dipende solo dal GRADIENTE DI CONCENTRAZIONE

39 Confronto dei valori di permeabilità (P) per diverse molecole tra membrane biologiche e artificiali Le membrane biologiche sono più permeabili dei doppi strati lipidici artificiali a ioni, acqua e molecole polari

40 PROTEINE DI TRASPORTO CANALI CARRIER POMPE

41 Trasportano ioni Sono specifici per lo ione trasportato La selettività è data dall ampiezza e da cariche di superficie all interno del poro Sono regolati (voltaggio, ormoni, luce, fosforilazione)

42 due conformazioni: aperti/chiusi Ampiezza del poro e cariche di superficie = selettività

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44 I canali si studiano con la tecnica del PATCH CLAMP

45 PATCH CLAMP

46 PATCH CLAMP Le correnti dirette verso l interno della cellula e quelle dirette verso l esterno sono mediate da classi distinte di canali ionici

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48 I canali per il potassio sono estremamente selettivi Correnti tempodipendenti attraverso canali rettificanti entranti per il K Il Na è molto meno permeabile

49 SENSORE DEL VOLTAGGIO Canale K rettificante entrante di tipo Shaker

50 trasporto passivo (diffusione facilitata diffusione facilitata) trasporto unidirezionale di ioni e soluti

51 Il legame con la molecola da trasportare induce un cambiamento conformazionale e il conseguente rilascio della molecola dal lato opposto della membrana la velocità di trasporto è più lenta rispetto ai canali (V canale = 10 6 V carrier )

52 le cinetiche di attività dei carrier sono descrivibili con l equazione di MichaelisMenten Menten

53 PRINCIPALI IONI E SOLUTI TRASPORTATI DA CARRIER NH 4, NO 3, PO 4 3, SO 4 2, zuccheri, amminoacidi, basi azotate alta selettività per la molecola da trasportare

54 C j i µ j = RT ln z j F(E i E o ) > 0 C j o Il trasporto avviene contro GRADIENTE ELETTROCHIMICO E necessaria energia

55 TRASPORTO ATTIVO PRIMARIO il trasporto è accoppiato a una fonte di energia metabolica idrolisi di ATP reazione di ossidoriduzione POMPE elettrogeniche H ATPasi (piante, funghi) Na /K ATPasi (animali) elettroneutre H /K ATPasi ( mucosa gastrica )

56 principali pompe elettrogeniche H ATPasi di membrana plasmatica H ATPasi vacuolare H pirofosfatasi (vacuolo, golgi) Ca ATPasi (membrana plasmatica)

57 pompe protoniche nelle piante H ATPasi di plasmalemma H ATPasi vacuolare H ATPasi dei mitocondri e dei cloroplasti H pirofosforilasi (vacuolo e golgi)

58 TRASPORTO ATTIVO DI H Gradiente elettrochimico di H FORZA MOTRICE PROTONICA ENERGIA LIBERA

59 il movimento dei protoni secondo il loro gradiente elettrochimico può essere accoppiato al lavoro cellulare µ H = F E 2.3RT log [H ] i [H ] o p = µ H F = E 2.3RT log [H ] i F [H ] o

60 poiché ph = log[h ] log [H ] i [H ] o = (ph i ph o ) = ph p = E 2.3RT F ph p = E 59 ph FORZA PROTON MOTRICE

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62 Processi chemiosmotici

63 TRASPORTO ATTIVO SECONDARIO la forza proton motrice può guidare il trasporto di altre sostanze contro il gradiente elettrochimico SIMPORTO protone e molecola X si muovono nella stessa direzione ANTIPORTO protone e molecola X si muovono in direzioni opposte

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65 Ipotetico modello di funzionamento di un simportatore

66 variazioni del ph e del E in Lemna gibba in seguito all aggiunta di glucosio simporto glucosioh

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70 flussi del Ca 2 nella cellula vegetale

71 FATPasi dei mitocondri e dei cloroplasti. Sfruttano il ph per la sintesi di ATP VATPasi, presente sul tonoplasto. Pompa i protoni all interno del vacuolo, generando la forza motrice per diversi sistemi di trasporto PATPasi, presente sulla membrana plasmatica

72 CF 1 α 3, β 3, γ, δ, ε CF 0 a, b, b, c 12

73 V 1 porzione solubile sito catalitico 3 copie subunità 1 (β FATPasi) 3 copie subunità 2 (α FATPasi) altre 8 subunità V 0 porzione integrale di membrana canale per H copie multiple subunità 3 (16 kda, =2 X 8 kda subunità c) altre 4 subunità)

74 H ATPasi di plasmalemma

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76 RUOLO FISIOLOGICO DELL H ATPasi DI PLASMALEMMA mantenimento del ph del citoplasma

77 RUOLO FISIOLOGICO DELL H ATPasi DI PLASMALEMMA forza guida per sistemi di trasporto di ioni e nutrienti

78 RUOLO FISIOLOGICO DELL H ATPasi DI PLASMALEMMA Apertura e chiusura degli stomi

79 H H H Apertura degli stomi luce blu K Cl H H H K Cl Cl K H H H Iperpolarizzazione della membrana aumento della π apertura canali del K ingresso del Cl diminuzione di Ψ

80 H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O Apertura degli stomi AUMENTO DELLA PRESSIONE DI TURGORE

81 RUOLO FISIOLOGICO DELL H ATPasi DI PLASMALEMMA movimenti pulvinici

82 RUOLO FISIOLOGICO DELL H ATPasi DI PLASMALEMMA Crescita per distensione H H H H H H H H H H H H C IAA H H H H H H H

83 RUOLO FISIOLOGICO DELL H ATPasi DI PLASMALEMMA fototropismo

84 possibili meccanismi che determinano un aumento di attività dell H ATPasi fattori che influenzano l attività dell H ATPasi stress salino auxina luce patogeni

85 il dominio Cterminale è autoinibitorio prove sperimentali mutanti H ATPasi senza la regione Cterminale proteolisi controllata: rimozione regione Cterminale ENZIMA COSTITUTIVAMENTE ATTIVO

86 Le proteine 1433 sono coinvolte nella regolazione dell attività della H ATPasi Proteine 1433 Classe di proteine regolatrici diffuse in tutti gli eucarioti Proteine dimeriche. Ogni monomero ha un PM di circa 30 kda Interagiscono con numerose proteine bersaglio, tramite il riconoscimento di particolari sequenze fosforilate su residui di serina o treonina.

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88 La H ATPasi è attivata dal legame delle proteine 1433 in seguito alla fosforilazione di uno specifico residuo di treonina localizzato all estremità Cterminale dell enzima

89 La fusicoccina, una fitotossina prodotta da un fungo, è in grado di indurre il legame delle proteine 1433 anche in assenza di fosforilazione dell enzima