Analisi di amminoacidi non derivatizzati in LC/MS per il monitoraggio di colture cellulari in bioreattori

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1 Nota applicativa Analisi di amminoacidi non derivatizzati in LC/MS per il monitoraggio di colture cellulari in bioreattori Autori Jordy Hsiao, Te-Wei Chu, Andrew Kennedy, Adam Bivens e Anne Blackwell Abstract In questa nota applicativa viene presentata una soluzione per l'analisi in LC/MS di amminoacidi in terreni di fermentazione. A causa della natura polare degli amminoacidi, l'analisi in cromatografia liquida in fase inversa è piuttosto difficile, pertanto spesso si impiega la derivatizzazione al fine di migliorare la ritenzione. Al contrario, la cromatografia ad interazione idrofilica (HILIC) permette di ritenere e separare miscele complesse di amminoacidi non derivatizzati, consentendo al tempo stesso di mantenere un flusso di lavoro simile a quello delle analisi in fase inversa. La combinazione della cromatografia HILIC con la spettrometria di massa permette di offrire una soluzione particolarmente semplice ed efficace per l analisi di amminoacidi non derivatizzati.

2 Introduzione Il monitoraggio dell'ampio spettro di composti polari rilevati in bioreattori e fermentatori è una complessa e reale applicazione per la cromatografia ad interazione idrofilica (HILIC). In condizioni di ph elevato e utilizzando la rivelazione LC/MS in modalità negativa è possibile monitorare amminoacidi, nutrienti e prodotti di scarto con un unica analisi. La stabilità a ph elevati della chimica della colonna Agilent AdvanceBio MS Spent Media la rende la scelta ideale per la separazione della miscela. Nonostante la complessità della matrice, la ripetibilità di iniezioni successive è risultata eccellente. Test effettuati su reattore a fibre cave e su reattore con sistema di agitazione hanno permesso di determinare il consumo di glucosio e di amminoacidi e la secrezione di lattato da parte delle cellule della coltura. Condizioni sperimentali Reagenti e prodotti chimici Tutti i reagenti erano di grado HPLC o superiore. L'acetonitrile di grado Ultra LC/MS è stato acquistato da J.T. Baker (Center Valley, PA, USA). L'acqua è stata purificata con un sistema integrale EMD Millipore Milli-Q (Darmstadt, Germania). L'acido formico di grado reagente (FA, codice G5-85) è stato fornito da Agilent Technologies. Gli standard di formiato di ammonio, acetato di ammonio, idrossido di ammonio e di amminoacidi sono stati acquistati da Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Il terreno DMEM è stato acquistato da Thermo Scientific (Waltham, MA, USA). Gli amminoacidi sono stati conservati a -7 C fino al giorno di utilizzo. Apparecchiature e materiali Raccordi Agilent InfinityLab In testa allla colonna: Agilent Quick Connect (codice ) In coda alla colonna: Agilent Quick Turn (codice 57-59) Vial Agilent, chiusura a vite, ambrato, etichetta scrivibile, certificato, ml, /conf. (codice 58-7) Tappo a vite a setto fissato Agilent, setti in PTFE/silicone rosso (codice 59-7) Inserto per vial Agilent, 5 μl, vetro deattivato con supporto polimerico (codice ) Dispensatore e pipette Eppendorf Ultracentrifuga (VWR, Radnor, PA, USA) Vortexer e vortexer multitubo (VWR, Radnor, PA, USA) Bottiglie di solvente in HDPE (VWR, Radnor, PA, USA) Bioreattore con sistema di agitazione (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) Bioreattore a fibre cave (FiberCell Systems, New Market, MD, USA) Strumentazione Pompa binaria Agilent 9 Infinity II (G7A) Autocampionatore Agilent 9 Infinity II (G79B) Termostato multicolonna Agilent 9 Infinity II (G7B) Kit a dispersione ultra-bassa per sistema LC Agilent serie 9 Infinity (57 589) Spettrometro di massa a quadrupolo tempo di volo (Q-TOF) Agilent 55 Sorgente di ionizzazione elettrospray Agilent Jet Stream Software Software Agilent MassHunter Workstation B.8. Preparazione del campione I campioni di coltura cellulare sono stati diluiti in rapporto : con acetonitrile 5% e centrifugati a. x g per minuti. Il surnatante è stato raccolto e iniettato senza alcuna ulteriore preparazione del campione. Fase mobile Una soluzione madre di acetato di ammonio mm è stata preparata in acqua e portata a ph 9 con idrossido di ammonio. La fase mobile A è stata preparata per diluizione della soluzione madre con acqua in rapporto 9:. La fase mobile B è stata preparata per diluizione della soluzione madre con acetonitrile in rapporto 9:. La concentrazione finale di entrambe le fasi mobili era pari a mm in acetato di ammonio. Si è riscontrato che il contatto prolungato della fase mobile con la vetreria introduce specie ioniche che interferiscono e sopprimono il segnale di MS. Le fasi mobili conservate in recipienti di vetro devono essere sostituite con regolarità o trasferite in flaconi in HDPE.

3 Condizioni strumentali Colonna Fase mobile A Fase mobile B Gradiente Velocità del flusso Condizioni HPLC Agilent AdvanceBio MS Spent Media,, 5 mm (codice ) (% di acetato di ammonio mm in acqua a ph 9)/ (9% di acqua) (% di acetato di ammonio mm in acqua a ph 9)/ (9% di acetonitrile) Tempo (min) %B ,5 ml/min Temperatura della colonna C Volume di iniezione µl Tempo di analisi totale 5 minuti Condizioni MS Modalità di ionizzazione ESI negativa Temperatura del gas C Flusso del gas L/min Nebulizzatore psi Temperatura dello sheath gas C Flusso dello sheath gas L/min Voltaggio del capillare. V Voltaggio del nozzle V Voltaggio del fragmentor 5 V Voltaggio dello skimmer 5 V Oct RF Vpp 75 V Parametri di acquisizione Data acquisiti con range dinamico esteso a GHz Intervallo di massa MS 5-. m/z Condizioni dei bioreattori Parametro Tipi di bioreattori Linea cellulare Terreni di coltura Temperatura C Valore Bioreattore con sistema di agitazione Bioreattore a fibre cave Cellule di ovario di criceto cinese (CHO) Terreno di crescita DMEM Tabella. Composizione della matrice di coltura cellulare (terreno di crescita DMEM). Concentrazione Componente (mg/l) Glicina, L-arginina cloridrato 8, L-cistina HCl, L-glutammina 58, L-istidina cloridrato-h O, L-isoleucina 5, L-leucina 5, L-lisina cloridrato, L-metionina, L-fenilalanina, L-serina, L-treonina 95, L-triptofano, L-tirosina sale disodico diidrato, L-valina 9, Cloruro di colina, D-calcio pantotenato, Acido folico, Nicotinammide, Piridossina cloridrato, Riboflavina, Tiamina cloridrato, i-inositolo 7, Cloruro di calcio (CaCl )(anidro), Nitrato ferrico (Fe(NO ) *9H O), Solfato di magnesio (MgSO )(anidro) 97,7 Cloruro di potassio (KCl), Bicarbonato di sodio (NaHCO ).7, Cloruro di sodio (NaCl)., Fosfato di sodio monobasico (NaH PO *H O) 5, D-glucosio (destrosio).5, Rosso fenolo 5, Piruvato di sodio,

4 Risultati Fenilalanina (,7),,,8 Leucina/isoleucina (,87) 7,5 5,,5,,, Triptofano (,8) Metionina (8,),,5,,8,,,,8 Tirosina (8,),,8 5, Valina (,77),8 5, 5, Glicina (7,7) 5,8,, Treonina (8,5) 5,8,,,,5 Glutammina (5,8),, 7, Serina (,5),, 7,,,5 Istidina (5,),,8 7, Arginina (7,) 7,5 5,,5,,5, Lisina (5,98),5,,5 Prima analisi Seconda analisi Terza analisi Figura. Test di riproducibilità. Fenilalanina (,7),,,8 Leucina/isoleucina (,87),,, Triptofano (,8),,8,,,5 Metionina (8,),,,8 Tirosina (8,),,8 5, Valina (,77),8 5, 5, Glicina (7,7) 5,8,, Treonina (8,5) 5,8,, Glutammina (5,8),, 7, Serina (,5) Istidina (5,) Arginina (7,),5,,,,5,5,5,, 7,,,8 7,,,5, Lisina (5,98),5,,5 Controllo (terreno di crescita) Bioreattore a fibre cave (raccolta dopo giorni) Coltura in bioreattore con sistema di agitazione (raccolta dopo settimane) Figura. Analisi di terreni di coltura cellulare che evidenziano il consumo di amminoacidi. Al terreno di crescita nel bioreattore a fibre cave è stato aggiunto un supplemento di glutammina mm; per questa ragione il livello di glutammina è più alto nel bioreattore a fibre cave rispetto al terreno di coltura di controllo e al bioreattore con sistema di agitazione impoverito di nutrienti. α-d-glucosio/β-d-glucosio (79,5) Lattato (89,) Controllo (terreno di crescita) Bioreattore a fibre cave (raccolta dopo giorni) Coltura in bioreattore con sistema di agitazione (raccolta dopo settimane), 5, 5,,,, Figura. Analisi di terreni di coltura cellulare che evidenziano il consumo di glucosio somministrato e la secrezione di lattato.

5 Tabella. Tempi di ritenzione nei terreni di coltura cellulare e ione predominante per ciascun analita. Analita monitorato Tempo di ritenzione (min) Ione precursore (m/z) Fenilalanina,55,7 Lattato,95 89, Leucina,98,87 Triptofano,98,8 Isoleucina,5,87 Metionina,5 8, D-glucosio (alfa),87 79,5 Tirosina,9 8, D-glucosio (beta) 5, 79,5 Valina 5,9,7 Glicina,8 7,7 Treonina,9 8,5 Glutammina,7 5, Serina,7, Istidina,75 5, Arginina,5 7, Lisina, 5,98 Conclusioni L'analisi di amminoacidi in terreni di coltura esauriti è stata analizzata con successo con la tecnica HILIC-MS in modalità di ionizzazione negativa. Le specie isobariche leucina/isoleucina, la cui separazione è in genere complessa, sono risultate separate alla linea di base con una risoluzione pari a,. A causa della loro natura zwitterionica, gli amminoacidi ionizzano facilmente sia in modalità positiva che negativa, ma la modalità negativa a ph elevati permette di monitorare simultaneamente terreni di coltura cellulare, nutrienti e prodotti di scarto cellulare. 5

6 Le informazioni fornite possono variare senza preavviso. Agilent Technologies, Inc. 8 Stampato negli Stati Uniti, 9 gennaio ITE