LA MEDICINA DI PRECISIONE E LA STANDARDIZZAZIONE DEGLI STRUMENTI DIAGNOSTICI: NGS E OLTRE LE SINDROMI MIELOPROLIFERATIVE. Emanuela Ottaviani

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1 LA MEDICINA DI PRECISIONE E LA STANDARDIZZAZIONE DEGLI STRUMENTI DIAGNOSTICI: NGS E OLTRE LE SINDROMI MIELOPROLIFERATIVE Emanuela Ottaviani

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3 2017 ELN risk stratification by genetics Risk category * Favorable Intermediate t(8;21)(q22;q22.1); RUNX1-RUNX1T1 Genetic abnormality inv(16)(p13.1q22) or t(16;16)(p13.1;q22); CBFB-MYH11 Mutated NPM1 without FLT3-ITD or with FLT3-ITD low Biallelic mutated CEBPA Mutated NPM1 and FLT3-ITD high Wild-type NPM1 without FLT3-ITD or with FLT3-ITD low (without adverse-risk genetic lesions) t(9;11)(p21.3;q23.3); MLLT3-KMT2A Cytogenetic abnormalities not classified as favorable or adverse t(6;9)(p23;q34.1); DEK-NUP214 t(v;11q23.3); KMT2A rearranged t(9;22)(q34.1;q11.2); BCR-ABL1 inv(3)(q21.3q26.2) or t(3;3)(q21.3;q26.2); GATA2,MECOM(EVI1) Adverse 5 or del(5q); 7; 17/abn(17p) Complex karyotype, monosomal karyotype Wild-type NPM1 and FLT3-ITD high Mutated RUNX1 Mutated ASXL1 Mutated TP53 #

4 Minimal/measurable residual disease in AML: a consensus document from the European LeukemiaNet MRD Working Party Blood : Measurable residual disease (MRD; previously termed minimal residual disease) is an independent, postdiagnosis, prognostic indicator in acute myeloid leukemia (AML) that is important for risk stratification and treatment planning, in conjunction with other well-established clinical, cytogenetic, and molecular data assessed at diagnosis. MRD can be evaluated using a variety of multiparameter flow cytometry and molecular protocols, but, to date, these approaches have not been qualitatively or quantitatively standardized, making their use in clinical practice challenging. The objective of this work was to identify key clinical and scientific issues in the measurement and application of MRD in AML, to achieve consensus on these issues, and to provide guidelines for the current and future use of MRD in clinical practice. The work was accomplished over 2 years, during 4 meetings by a specially designated MRD Working Party of the European LeukemiaNet. The group included 24 faculty with expertise in AML hematopathology, molecular diagnostics, clinical trials, and clinical medicine, from 19 institutions in Europe and the United States. Metodiche di riferimento Markers utilizzabili Quali campioni e quando eseguire l analisi Interpretazione dei risultati

5 Laboratori GIMEMA -LabNet AML Centri e responsabili Bari G. Specchia, F. Albano Bergamo A. Rambaldi, O. Spinelli Bologna M. Cavo Milano R. Cairoli, S. Veronese Napoli F. Pane, B. Izzo, S. Errichiello Nuoro M. Monne Orbassano G. Saglio, D. Cilloni, E. Gottardi Palermo A. Santoro Perugia B. Falini, C. Mecucci Roma F. Lo Coco, M.T. Voso 1. Pannello di esami genetici e molecolari di base 2. Studio della malattia minima residua (MRD) 3. Studio delle mutazioni somatiche con ruolo diagnostico e/o prognostico nelle AML.

6 FLT3-ITD allelic ratio Si calcola come ratio dell area sotto le curve del mutato e del wt (FLT3- ITD/FLTwt) Ratio: fattore prognostico (</> 0.5) Mesinchi et al. Blood 2017

7 NPM1!!!!!

8 NGS per lo screening mutazionale di FLT3 Scopo: comprendere l evoluzione del clone ITD/TKD in pazienti cariotipo normale Patienti: Analisi retrospettiva di 22 campioni alla diagnosi e follow up di 5 pazienti con cariotipo normale Analisi retrospettiva di campioni pre e post trattamento di 10 patienti arruolati nel protocollo clinico di fase II con AC220 Metodo: Tecnologia NGS Roche 454. Limite di detectabilità: 0,1-1% 454 GS Junior Roche Zuffa et al. Oncotarget 2015

9 FLT3: evoluzione clonale Low detection limit of SS: 20% (1884): 27bp 188 Zuffa et al. Oncotarget 2015

10 Zuffa et al. Oncotarget 2015 FLT3: evoluzione clonale e trattamento con AC220

11 NGS nel monitoraggio di FLT3 1. Unica analisi per caratterizzare la inserzione: il sito di inserzione, la lunghezza, la sequenza e la quantificazione 2. Alta sensibilità: si evidenziano piccoli cloni precocemente 3. Monitoraggio durante trattamento (pre e post) con possibilità di evidenziare piccoli cloni emergenti (resistenza)

12 NGS: il futuro della diagnostica molecolare Sophia Genetics, Myeloid Solution Panel ThermoFisher, AmpliSeq Myeloid Panel

13 1 PANNELLO PER: AML MDS MPN CML CMML E JMML Myeloid Solution Panel ABL1 ASXL1 BRAF CALR CBL CEBPa CSF3R DNMT3A ETV6 EZH2 FLT3 HRAS IDH1 IDH2 JAK2 KIT KRAS MPL NPM1 NRAS PTPN11 RUNX1 SETBP1 SF3B1 SRSF2 TET2 TP53 U2AF1 WT1 ZRSR2 30 geni: 10 full, 20 regioni hotspots Coverage minimo 1000X (98%)

14 Vantaggi pannello Myeloid solution di Sophia Genetics Pannello diagnostico capture utilizzabile sia su piattaforma Illumina (MiSeq) che Thermo Fisher (Ion Torrent S5) facile interpretazione dei risultati (disponibilità di un software per analisi dei dati, DDM software, piattaforma universale, con confronto fra utenti) Programma di validazione con rilascio di Analytical Performance Report (sensibilità, specificità, riproducibilità, accuratezza, ripetibilità) Possibilità di avere campioni di riferimento che permettono di verificare e validare il flusso di lavoro del laboratorio

15 Myeloid Solution by SG: visualizzazione dei risultati

16 #RUN SEQUENCER #SAMPLES/RUN RUN_0 Illumina_MiSeq 24 RUN_1 OT2_S5 12 RUN_2 OT2_S5 12 RUN_3 CHEFSYSTEM_S5 8 Scopo: Coverage: Varianti: uniformità regioni low coverage falsi positivi e falsi negativi riproducibilità

17 Myeloid Solution Panel: pazienti sequenziati Patient Diagnosis Sequencer Patient Diagnosis Sequencer MDS AML II a TE */** CMML AML */ ** TE AML II a TE AML AML * MF AML MF ** MDS */ ** AML MDS CMML S AML S MDS S AML S AML AML S AML AML AML S SG001*/HD701* CONTROL *S5 replicate; **Miseq Replicate

18 Analisi del Coverage: MiSeq vs S5

19 Myeloid Solution by SG: regioni low coverage

20 Myeloid Solution by SG: varianti identificate Not detected variants: Miseq : 1 99bp ITD Ion Torrent S5: 1 99bp ITD 2 INDELs localizzate in regione low coverage di CEBPA

21 Myeloid Solution by SG: 39 campioni alla diagnosi di cui 27 LAM 4 RUNS (ILLUMINA OR S5) Analisi: Sophia DDM platform Risultati ottenuti filtrando per: coverage 500x, snp > 1% nella popolazione europea, regioni introniche, regioni UTR/intergeniche e varianti sinonime

22 Myeloid Solution by SG: risultati

23 Myeloid Solution by SG: LAM VF% n VNTs (mean) ,1 20 3,64

24 Caso 1 RUNX1 E316* 29% TP53 L130R 92% 49,XY,+1,del(5)(q13q33),+der(5)del(5)(q13 q33),+11[18]/47,xy,del(5)(q13q33),+der(5) del(5)(q13q33)[1]/46,xy,del(5)(q13q33)[1] TRISOMIA CROMOSOMA 1: MPL NRAS CSF3R CROMOSOMA 11: WT1 CBL HRAS AMPLIFICAZIONE NPM1

25 Caso 2 set-17 nov-17 mar-18 DNMT3A R882H 46% 46% 33% NPM1 TIPO A 49% 45% 32% NRAS G12D 2% 8% 4% NRAS G12C 6% 30% 28% FLT3 ITD (INS 0,26) 22% 0% 0% 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 sorafenib mar-18 nov-17 set-17 0 DNMT3A R882H NPM1 TIPO A NRAS G12D NRAS G12C FLT3 ITD (INS 0,26)

26 A 4 anni la rate di relapse è: 73% se entrambe pos 52% se NGS pos 50% se cito pos 26,7% se entrambe neg

27 Frequency of somatic mutations detected in the pretreatment (Pre) and complete remission (CR) samples. 70%; spesso con frequenza>2,5%) M Jongen-Lavrencic et al. N Engl J Med 2018;378: Kiyomi Morita et al,jco % mutazioni no-dta in pazienti in RC: rate ricaduta (55% vs 32%) RFS (37% vs58%) e OS (42% vs 66%)

28 Take Home Message Caratterizzazione molecolare mediante NGS alla diagnosi e ricaduta Diversi pannelli in commercio compatibili con le diverse strumentazioni Analisi bioinformatica indispensabile Possibilità di identificare anche piccoli cloni La clearance delle mutazioni somatiche valutata precocemente è un utile strumento per stratificare i pazienti per rischio. La persistenza di mutazioni somatiche in RC rappresenta un fattore prognostico indipendente, MA geni diversi hanno un valore prognostico diverso necessario definire un cut off ottimale il significato della MRD dipende dal trattamento, dal time point di analisi ma anche piattaforme utilizzate, algoritmi di analisi utilizzati

29 Clinici Antonio Curti Maria Chiara Abbenante Giovanni Marconi Stefania Paolini Cristina Papayannidis Sara Parisi Chiara Sartor Lab. Biologia Molecolare (Diagnostica) Lorenza Baldini Maria Teresa Bochicchio Maddalena Raffini Valentina Robustelli Claudia Venturi Bioinformatico Eugenio Fonzi Lab. Citogenetica Nicoletta Testoni Carmen Baldazzi