Dott. Lanza Lorella. Ospedale S. Corona Anatomia Patologica

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1 La CITOFLUORIMETRIA NELLE MIELODISPLASIE Dott. Lanza Lorella Ospedale S. Corona Anatomia Patologica

2 MDS sono un gruppo di disordini caratterizzati da un processo emopoietico alterato ed inefficace che coinvolge una o più linee cellulari e che si manifesta con la comparsa di difetti sia quantitativi che qualitativi di una o più serie emopoietiche. Clinicamente è caratterizzata da citopenia periferica dovuta alla incapacità della cellula staminale di differenziarsi; è irreversibile con tendenza all evoluzione leucemica. Incidenza : 20 / /anno anziani aa Disordine clonale: Anormalità citogenetiche e aberrazioni del cariotipo (perdita di materiale genetico, e meno frequentemente traslocazioni) sono presenti nel 50% delle MDS La diagnosi ad oggi si basa interamente ed esclusivamente su valutazione morfologica

3 TUTTAVIA Immunofenotipo è stato proposto negli ultimi anni come strumento per migliorare la valutazione della displasia nel M.O. RAZIONALE Immunofenotipo è un metodo accurato per la valutazione qualitativa e quantitativa delle cellule ematopoietiche (WHO e classificazione delle neoplasie ematologiche sia croniche che acute) Molti studi hanno dimostrato che le MDS hanno anormalità di espressione di molti antigeni cellulari. M. Stetler-Stevenson Blood 2001 D.A. Wells Blood 2003 L. Malcovati Leukemia 2005

4 Linee Guida per l armonizzazione dell applicazione della CFM nella diagnosi integrata delle MDS International/European LeukemiaNet (ELN) Working group for FlowCytometry in MDS (IMDSFlow) 2014

5 Approccio di tipo qualitativo - comparativo: raffronto con un regolare pattern di espressioni antigeniche alfine di identificare una deviazione rispetto al normale. alterazione dei parametri fisici SSC (side scatter) ed FSC ( forward scatter)

6 alterazioni delle curve maturative con CD11b/CD16 Prof. G Basso Prof. G Basso

7 alterazioni delle curve maturative con CD11b/CD66b Prof. G Basso Prof. G Basso

8 In CFM : alterazioni delle curve maturative con CD11b/CD64 Prof. G Basso

9 Aberrazioni antigeniche Espressione di CD56 sui granulociti e/o sui monociti Perdita di CD10 sui neutrofili maturi

10 Ma soprattutto Anormalità immunofenotipichedel compartimento dei blasti CD34+ La proporzione delle CD34+ ( soprattutto comparto mieloide) è significativamente aumentata nelle MDS

11 Nel 40-70% delle MDS c è una riduzione dei progenitori B CD34+ Gli ematogoni sono spesso assenti (precursori B CD45dim/CD19+/CD10+/CD34-)

12 I blasti possono inoltre avere asincronie maturative : co-espressione di antigeni immaturi e maturi (es CD117 e CD11b o CD15)

13 I blasti possono inoltre avere Aberranti co-espressioni con antigeni linfoidi (CD2, CD5, CD7, CD56) Ridotta espressione di CD45 MFI = Mean Fluorescence Intensity

14 Flow Cytometry Scoring Sistem (FCSS) «scores of 2 or greater were significantly correlated with a diagnosis of MDS. Wells. Blood 2003; 102:

15 Approccio qualitativo è scarsamente riproducibile e richiede operatori esperti. Identificare riproducibili (score) parametri quantitativi Van de Loosdrecht, Haematologica 2009 K Ogata, HAEMATOLOGIA 2009 TM Wester, ELN working group, Leukemia 2012 Della Porta, Haematologica 2012 A Porwit, Leukemia 2014 F Lacombe, Leukemia 2016

16 E stato dimostrato che 4 parametri: La % dei mieloblasti CD34+ La % dei progenitorib CD34+ La valutazione dell SSC dei granulociti Il livello di espressione del CD45 sui mieloblasti hanno bassa variabilita inter-operatore e quindi possono essere utilizzati in molti laboratori e differenziare correttamente pz con MDS vs pz con citopenia non clonale In particolare la valutazione del CD45 e dell SSC sono definite come ratio con i rispettivi valori analizzati sui linfociti nello stesso campione (CD45 ly/cd45 My e SSC gran/ssc ly) K Ogata, Haematologica 2009 MG Della Porta, Haematologica 2012

17 OGATA SCORE (Diagnostic score)

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20 Parametri CFM Range riferimento CRT score Risultato Risultato Score % mielobl CD34+ < % prog. B CD34+ > CD45 ratio Linf/Mielobl SSC ratio Granuloc/Linf >4 e < >

21 Parametri CFM Range riferimento CRT score Risultato Risultato Score % mielobl CD34+ < % prog. B CD34+ > CD45 ratio Linf/Mielobl SSC ratio Granuloc/Linf >4 e < >

22 Valutazione della displasia eritroide

23 CD36 Valutazione della displasia eritroide CD105 CD34 CD117 CD71 CD235 CD45 Proeritroblasti: CD45dim/CD117+/CD105+/CD36+/CD71+/CD235a+ Er. Basofili: CD45dim-/CD117-/CD105+/CD36++/CD71+/CD235a+ /CD105+/CD36++/CD71+/CD235a+ Er. Policromatofili: CD45-/CD117-/CD105-/CD36+/CD71+/CD235a+ /CD36+/CD71+/CD235a+ Er. Ortocromatici: CD45-/CD117-/CD105-/CD36+ /CD36+-/CD71+/CD235a+/CD71+/CD235a+

24 Aberrazioni citofluorimetriche associate a diseritopoiesi Aumentato numero di cellule eritroidi nucleate Alterazioni della curva maturativa ( aumento o diminuizione precursori CD117+ e/o CD105+) Anomalo pattern di espressione CD71 vs CD235a Ridotta espressione CD71 Ridotta espressione CD36 Iperespressione CD105

25 CV CD71 (incrementato nelle MDS) 3 pt CV CD36 (incrementato nelle MDS) 4 pt MFI CD71 (diminuito nelle MDS) 2 pt % progenitori eritroidi CD117+ (aumentati o diminuiti) 2 pt Cut off >= 5 pt

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27 Sensibilità 80%; Specificità 95% INTEGRATED MDS-FC SCORE

28 VALORE PROGNOSTICO DELLA FMC NELLE MDS - 1 Punteggi elevati dello score FCSS sono associati a una diagnosi avversa e a maggiori probabilità di recidiva dopo trapianto allogenico. Studi hanno dimostrato che i pazienti con numerose anomalie fenotipiche hanno una prognosi relativamente peggiore anche se classificati come MDS a basso rischio da IPSS e IPSS-R I pazienti con SSC diminuito hanno prognosi relativamente peggiori. L aumentata espressione di CD117 nei progenitori mieloidi è associata a una prognosi peggiore perchè consente la sopravvivenza del clone maligno. I pazienti con ridotta espressione di CD13 nei monociti maturi mostrano invece una prognosi migliore Wells DA. et al. Myeloid and monocytic dyspoiesis as determined by flow cytometric scor-ing in myelodysplastic syndrome correlates with the IPSS and with outcome after hematopoietic stem cell transplantation. Blood (2003) 102(1): doi: /blood Alhan C, et al. The myelodysplastic syndromes flow cytometric score: a three- parameter prognostic flow cytometric scoring system. Leukemia (2016) 30(3):

29 VALORE PROGNOSTICO DELLA FMC NELLE MDS - 2 Un alto numero di anomalie FCM nella MDS è stato associato ad - anomalie citogenetiche, - dipendenza da trasfusioni, - malattia progressiva - rischio di trasformazione in AML. Le variazioni FCM correlate all'mds possono essere rilevate anche nel sangue periferico quindi la FCM può fornire informazioni preziose anche in un campione morfologicamente non significativo Wells DA. et al. Myeloid and monocytic dyspoiesis as determined by flow cytometric scor-ing in myelodysplastic syndrome correlates with the IPSS and with outcome after hematopoietic stem cell transplantation. Blood (2003) 102(1): doi: /blood Alhan C, et al. The myelodysplastic syndromes flow cytometric score: a three- parameter prognostic flow cytometric scoring system. Leukemia (2016) 30(3):

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31 Grazie per l attenzione!