Citofluorimetria per lo studio delle MDS. Roberto Caporale

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2 Citofluorimetria per lo studio delle MDS Roberto Caporale

3 Sindromi Mielodisplastiche Le Sindromi Mielodisplastiche (MDS) sono un gruppo di disordini clonali caratterizzati da una cellularità midollare normale o aumentata accompagnata da fenomeni di displasia a carico di una o più filiere emopoietiche. l ematopoiesi inefficace causa vari tipi di citopenie periferiche, di cui la più frequente è l anemia. Il disordine della produzione cellulare è anche associato ad anomalie morfologiche sia nel midollo osseo che nel sangue

4 MDS DIAGNOSIS WHO classification MORPHOLOGY Standard for assessment of DYSPLASIA CYTOGENETICS Clonality marker FLOW CYTOMETRY as integration technique

5 ALCUNI CASI DI MDS SONO DIFFICILI DA DIAGNOSTICARE DIFFICILE INTERPRETAZIONE MORFOLOGICA PER INSUFFICIENTE CELLULARITA DELL ASPIRATO MIDOLLARE (ipocellularità, fibrosi midollare) ALCUNE INFEZIONI VIRALI POSSONO PRESENTARE CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE DI MDS DISERITROPOIESI E DISGRANULOPOIESI POSSONO ESSERE OSSERVATE IN INDIVIDUI ANZIANI SANI VARIABILITA INDIVIDUALE NELLA VALUTAZIONE MORFOLOGICA

6 Diagnostic approach to MDS Malcovati L, et al., ELN guidelines. Blood 2013;122:

7 Immunofenotipizzazione cellulare Insieme di metodi diretti al riconoscimento, alla quantificazione ed alla localizzazione di strutture cellulari per mezzo di reagenti immunologici (anticorpi monoclonali). L'analisi dell'immunofenotipo permette la classificazione delle cellule in termini differenziazione (linea di appartenenza) maturazione applicata all'analisi di cellule patologiche ne consente la definizione, in termini di linea, di stadio differenziativo edi clonalità.

8 Regole per una corretta analisi citometrica in onco ematologia Quesito diagnostico (dialogo con i clinici) Caratteristiche del campione da analizzare Scelta di adeguate combinazioni di anticorpi monoclonali Strategie di gating per il riconoscimento delle popolazioni cellulari da analizzare Integrazione con i laboratori di anatomia patologica, citogenetica e biologia molecolare Formulazione di una risposta adeguata e, quando possibile, conclusiva

9 Metodo di studio in citometria Valutazione delle normali componenti cellulari del sangue midollare Valutazione dello stadio maturativo di tali componenti Dimostrazione della presenza nel campione di cellule anormali Eventuale dimostrazione della loro clonalità Evidenziazione di fenotipi peculiari allo scopo di identificare una determinata entità nosografica e/o utili per lasciare una traccia in corso di follow up (MRD)

10 Linea mieloide Linea monocitaria Linea eritroide Linea linfoide Linea mieloide Linea monocitaria Linea eritroide Linea linfoide

11 Espressione del CD45 Sangue midollare Maturazione neutrofila eosinofili Progenitori mieloidi eritroblasti basofili monociti linfociti Progenitori Linfoidi B

12 MATURAZIONE MIELOIDE: granulocitopoiesi

13 MATURAZIONE MIELOIDE: profilo antigenico

14 MATURAZIONE MIELOIDE: profilo antigenico

15 MATURAZIONE MIELOIDE: granulocitopoiesi

16 MATURAZIONE MIELOIDE: Side Scatter (SSC) Gra/Ly SSC ratio = 9.6 NORMALE Gra/Ly SSC ratio = 5.2 MDS

17 MATURAZIONE MIELOIDE: CD66b/CD11b

18 MATURAZIONE MIELOIDE: CD66b/CD11b BM normale + mature Sindrome mielodisplastica immature blasti blocco maturativo

19 Maturazione mieloide in BM normale CD11b CD11b CD16 CD10 CD13 CD16 CD64 CD15

20 Maturazione mieloide in BM con MDS CD16 CD16 CD11b CD11b CD13 CD13 CD16 CD16 R4 CD64 CD64 CD11b CD11b CD10 CD10 CD15 CD15

21 MATURAZIONE MIELOIDE monocitopoiesi stem cell Blasto mieloide promonoc ita Monocita CD34 CD13 CD33 CD36 CD64 CD11b CD14

22 MATURAZIONE MIELOIDE monocitopoiesi

23 Differenziazione monocitaria BM normale

24 Progenitori emopoietici CD34+

25 Progenitori emopoietici CD34+ Cambiamenti nella % CD34+ e delle sottopopolazini committed % of BM CD34+ HPC NBM RA RCMD RAEB-1 RAEB-2 MD/MPD IMMATURE B-CELL PRECURSORS NEUTROPHIL PRECURSORS Alberto Orfao

26 Progenitori emopoietici CD34+ Cambiamenti nella % CD34+ e delle sottopopolazini committed 0.9% 5.5% normale MDS

27 Progenitori emopoietici CD34+ Cambiamenti nella % CD34+ e delle sottopopolazini committed normale MDS

28 Differenziazione linfoide B CD34 TdT CD79a CD19 CD10 CD20 CD22 cµ SmIg stem cell Cellula pre-pre B nucleare citoplasmatico Cellula pre B citoplasmatico Cellula B

29 Differenziazione linfoide B Combinazione MoAb FITC PE PerCP-Cy5.5 PE-Cy7 APC APC-H7 CD20 CD10 CD34 CD38 CD19 CD45 CD34+ ematogoni meno maturi Più maturi ematogoni Linfociti maturi

30 Differenziazione linfoide B Combinazione MoAb FITC PE PerCP-Cy5.5 PE-Cy7 APC APC-H7 CD20 CD10 CD34 CD38 CD19 CD45 precursori Linfociti maturi

31 Differenziazione linfoide B Combinazione MoAb FITC PE PerCP-Cy5.5 PE-Cy7 APC APC-H7 CD20 CD10 CD34 CD38 CD19 CD45 5%

32 Differenziazione eritroide stem cell Proeritro blasto Eritroblasto basofilo Eritroblasto Policromat. Eritroblasto Ortocrom. eritrocita CD34 CD71 CD105 CD36 CD45 GPA CD235a

33 Differenziazione eritroide Combinazione MoAb FITC PE PerCP-Cy5.5 APC APC-H7 CD36 CD105 CD45 CD71 CD14 eritroblasti monociti eritroblasti

34 Differenziazione eritroide Combinazione MoAb FITC PE PerCP-Cy5.5 APC APC-H7 CD36 CD105 CD45 CD71 CD14

35 Standardization of flow cytometry in MDS: ELNet recommendations TM Westers et al. Leukemia (2012) 26,

36 Standardization of flow cytometry in MDS: ELNet recommendations Westers TM et al., Leukemia (2012) 26,

37 Standardization of flow cytometry in MDS: ELNet recommendations: immature myeoid and monocytic progenitors

38 Standardization of flow cytometry in MDS: ELNet recommendations: Maturing neutrophils normal MDS

39 Standardization of flow cytometry in MDS: ELNet recommendations: Monocytes normal MDS

40 Standardization of flow cytometry in MDS: ELNet recommendations: Progenitor B cells normal MDS

41 Standardization of flow cytometry in MDS: ELNet recommendations: Erythroid compartment normal MDS Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 88B: (2015)

42 Revised International Prognostic Scoring System (IPSS) for Myelodysplastic Syndromes Peter L. Greenberg et al; BLOOD, 20 SEPTEMBER 2012 VOLUME 120

43 Flow Cytometric Scoring System (FCSS) Blood. 2003;102: Blood. 2008;111:

44 Evaluation of bone marrow dysplasia by flow cytometric analysis with acceptable inter operator variability: ANITA prospective multicentric study cortesia Matteo G. Della Porta

45 Overall survival and time to disease progression by IPSS R and FCSS Canan Alhan et al. British Journal of Haematology, 2014, 167,

46 EuroFlow: standardization of method (cytometer, reagents ) STANDARDIZATION of analysis and interpretation automation (Infinicyt software)

47 Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 00:00 00 (2015)

48 Percorso diagnostico dell EPN * Parker, et al. Blood. 2005;106:

49 Come e cosa refertare ai clinici Il referto Citometrico deve contenere: Maturazione granulocitaria Maturazione monocitaria Percentuale di progenitori emopoietici mieloidi: Sottopopolazioni aberranti Patternsanomali di maturazione FCSS (Flow Cytometric Scoring System) A causa della mancanza di studi convalidati: Non refertare Displasia eritroide Displasia megacariocitaria e delle piastrine

50 Come e cosa refertare ai clinici Le conclusioni: A: l analisi in citometria a flusso, non presenta caratteristiche MDS correlate. B: l analisi in citometria a flusso, evidenzia alcune alterazioni caratteristiche delle MDS. (ad es: displasia mielomoncitaria) C: I risultati dell'analisi in citometria a flusso sono coerenti con MDS.

51 Ulteriori commenti nel referto finale integrato il referto integrato dovrebbe includere: Analisi citometrica con FCSS emocromo con formula e descrizione delle popolazioni periferiche Analisi morfologica dell aspirato midollare e/o della Biopsia Osteo Midollare (BOM) Immunoistochimica su striscio di sangue midollare e/o BOM (colorazione di PERLS) Citogenetica/FISH Note: diseritropoiesi e dismegacariocitopoiesi non devono essere incluse nel referto della citometria a flusso. Note: ripetere l'analisi dopo 6 mesi nei casi inconcludenti e/o se si riscontra una discordanza tra diversi strumenti di diagnostica. Note: non refertare nessuna informazione su eventuali elementi prognostici e/o predittivi di risposta.

52 Conclusioni: significato clinico della FCM in MDS La FCM può essere eseguita in MDS sulla base di criteri ben definiti FCM è fondamentale nella diagnosi di esclusione di MDS FCM è parte integrante nel Work UP diagnostico (ELN e NCCN) Le aberrazioni immunofenotipiche sulle cellule mieloidi, monocitarie e CD34+, sono correlate ai parametri clinici prognostici Flow Cytometric Scoring System (FCSS) correla bene con la Overall Survival. E tempo di refertare i risultati della FCM in un report diagnostico integrato nella MDS