IL PACCHETTO CHIMICO A SUPPORTO DELLA DIAGNOSI

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1 IL PACCHETTO CHIMICO A SUPPORTO DELLA DIAGNOSI Pierluigi Capra Torino, 29 giugno 2017

2 Introduzione L UnitàOperativa Tossicologia e ricerca anabolizzanti presso CAD

3 Introduzione Centro Regionale AntiDoping «A. Bertinaria» Espressione del Consorzio di Enti pubblici: - Regione Piemonte - Università di Torino -AOU San Luigi di Orbassano -IZSPLVA

4 Introduzione All interno del centro creata ed equipaggiata l U.O.

5 Attivitàdell U.O. Le attivitàdell U.O. Ricerca residui cat. A e B in esecuzione del PNR Extrapiano regionale Tossicologia Veterinaria

6 Le attività dell U.O. Il progressivo incremento dell operatività dell U.O. ha «coinciso»con la prima emanzione dell Ordinanza Martini (Dicembre 2008) L O.M. Stabilisce tempistiche per l iter di accertamento routinarizzando l esecuzione degli esami chimici tossicologici sugli animali domestici, selvatici e da reddito.

7 Protocollo chimico - Generalità Tipo di campioni: Materiale autoptico: pool fegato e rene,contenuto gastrico, contenuto del gozzo Presunte esche: materiali di varia natura Altro: sangue, urina feci, api e parti di alveare,.

8 Protocollo chimico - Generalità L esame o gli esami chimici sono orientati dalle indicazioni ottenute in sede diagnostica o anatomopatologica (anamnesi, individuazione di lesioni agli organi o presenza di materiali sospetti)

9 Protocollo chimico - Generalità Metodi di analisi: TOSSSC: Rodenticidi LC-MS/MS -Product Ion Scan TOSSA : α-cloralosio LC-MS/MS -Product Ion Scan TOSSCRO: Biocidi GC-MS - Full Scan La fase preparativa èunica per i 3 esami strumentali.

10 Protocollo chimico - Generalità Family (chemical type Quechers: figura or use) e 2 parole PYRETHROIDS (GC-MS) CARBAMATES (GC-MS) ORGANOPHOSPHATES (GC-MS) ORGANOCHLORIDES (GC- MS) ANTICOAGULANTS (LC- MS/MS) α-chloralose (LC- MS/MS) MISCELLANEOUS (GC-MS) Components cypermethrin, decamethrin, permethrin I and II carbofuran, desmedipham, mercaptodimethur (methiocarb), methomyl, oxamyl, propoxur chlorpyrifos-ethyl, chlorpyrifos-methyl, coumaphos, diazinon, dimethoate, ethion, isophenphos, malathion, methamidophos, mevinphos (phosdrin), parathion-ethyl, parathion-methyl, phorate, pirimiphos-methyl, sulfotep, terbufos α-endosulfan, β-endosulfan, endosulfan sulfate, lindane, tetradifon acenocoumarol, brodifacoum, bromadiolone, chlorophacinone, coumachlor, coumafuryl, coumatetralyl, dicoumarol, difenacoum, diphacinone, flocoumafen, pindone, warfarin α-chloralose lenacil, metaldehyde, piperonyl butoxide, strychnine, monoethylene glycol

11 Protocollo chimico - Generalità Convegno Nazionale L AVVELENAMENTO DEGLI ANIMALI IN ITALIA Il fenomeno degli avvelenamenti degli animali in Italia a cinque anni dall emanazione della Ordinanza Ministeriale Roma, 10 Dicembre 2013

12 Protocollo chimico Preparazione del campione Estrazione/Purificazione: 1)Sospetto «veleno»trattato direttamente con solvente organico (polverizzatura se necessario) mediante agitazione e ultrasuoni centrifugato e se necessario filtrato 2)Materiale organico che non presenti tracce macroscopiche di materiale sospetto: QuECheRS

13 Protocollo chimico Preparazione del campione

14 Protocollo chimico Preparazione del campione

15 Protocollo chimico Acquisizione LC-MS/MS

16 Protocollo chimico Acquisizione LC-MS/MS

17 Protocollo chimico Acquisizione GC-MS GC-MS: Agilent Agilent 5975 Column: HP5 30m x 0,25 mm x 0,25µm Carrier: He 1ml/min (constant flow) Injection: 1 µl splitless T injector: 280 C Ramp ( C/min) Final temp ( C) Dwell time (min) Total time: min

18 Protocollo chimico Acquisizione GC-MS

19 Protocollo chimico Acquisizione GC-MS stricnina

20 Protocollo chimico Acquisizione GC-MS α-endosulfano β-endosulfano

21 Protocollo chimico Acquisizione GC-MS GC-MS Full Scan metodo «aperto» embutramide

22 Protocollo chimico Prestazioni dei metodi Validazione: - Verificate specificità e capacita di rivelazione su campioni di pool di organi (varie specie) a 50 microgrammi/kg per i rodenticidi, 100 microgrammi/kg per l alfacloralosio e 4000 microgrammi/kg per gli analiti relativi al metodo GC-MS.

23 Protocollo chimico Prestazioni dei metodi Controlli di Qualità: - Utilizzati standard interno («di processo» secondo le linee guida II.ZZ.SS) deuterati, per entrambi i metodi strumentali - Per il metodo LC-MS/MS (rodentici e cloralosio), inseriti in ogni batch analitico controlli negati e positivi (matrice:fegato) a concentrazione pari alla capacitàdi rivelazione.

24 Protocollo chimico Limitazioni e possibili sviluppi Attuali limiti/possibili sviluppi - Rodenticidi non anticoagulanti (Es. vitamina D, azione tossica cumulativa a livello di fegato e reni. - Cianuri (cromatografia ionica o test colorimetrico al «blu di prussia») - Fosfuro di zinco (GC spazio di testa)

25 V. Ciccotelli S. Falsetti P. Brizio M.Leporati R.Avolio A. Trossi F. Fioravanti M. Scavo P.Capra Grazie per l attenzione!